利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

本视频的总体目标是介绍一种用于测序补骨脂素交联、连接并富集的杂交分子（SPLASH）的方法，该方法可全基因组范围内映射体内RNA-RNA成对相互作用。该技术是一种简单、高通量的体内RNA相互作用图谱绘制方法。该方法有助于回答RNA基因组学领域的关键问题，例如：单条RNA链上的不同区域之间，或不同RNA链之间如何相互作用。

尽管该方法可为酵母和人类细胞的研究提供见解，也可应用于其他现代生物体的研究，包括细菌以及细胞中的膜结构。我们最初产生该方法的想法，是源于希望找到一种方式来绘制分子相互作用图谱。请注意，以下实验步骤包含多个可暂停的节点。

在这些时间点，实验可暂时或无限期暂停。详细信息请参见配套文本。首先用五毫升 PBS 清洗 HeLa 细胞两次。

将培养皿垂直放置一分钟，以彻底排出多余的 PBS。接着，加入含有 200 微摩尔生物素化补骨脂素和 0.01% 皂苷（digitonin）的 1 毫升 PBS 溶液，后者可增加细胞通透性。注意将溶液均匀地加在细胞表面。

在37摄氏度下孵育五分钟。孵育结束后，取下培养皿盖，将其置于紫外交联仪中，距离紫外灯三厘米处的冰上。用365纳米紫外光照射20分钟。

20分钟后，从交联仪中取出培养皿，然后根据随附文件中的说明，从HeLa细胞中分离片段并沉淀RNA。将变性后的DNA标记物和RNA样品上样到一块8.6厘米见方的6% TBE-尿素凝胶上。在180伏电压下电泳40分钟，进行大小分离。

在避光条件下，用含有1:10,000稀释的核酸凝胶染料的10毫升TBE缓冲液染色凝胶5分钟。染色的同时，使用24号针头在洁净的0.6毫升微量离心管底部穿孔，并将其放入一个2毫升的微量离心管中。

使用透射仪观察染色后凝胶上的条带，并切取对应于90至110个核苷酸的凝胶片段。将凝胶片段转移至已打孔的0.6毫升微量离心管中，该小管置于2毫升微量离心管内。片段大小选择可使我们设定嵌合片段的最小长度，并在后续步骤中区分连接产物与未连接产物。

将凝胶切片在室温下以12,000 × g离心两分钟，以破碎凝胶切片并收集至2毫升微量离心管中。离心后，弃去空的0.6毫升微量离心管。向破碎的凝胶切片中加入700微升洗脱缓冲液。

将样品在4°C条件下孵育过夜，并持续旋转以使样品充分扩散进入缓冲液。将凝胶切片和洗脱缓冲液转移至离心过滤管中，在20,000 × g条件下离心20分钟。离心后，凝胶切片将被截留在滤器的上层腔室中，可弃去。

按照随附文档所述沉淀并定量RNA。将RNA在液氮中快速冷冻后，于负80摄氏度保存，直至使用。为富集RNA交联区域，首先在微量离心管中加入含有RNase抑制剂的100微升裂解缓冲液，洗涤链霉亲和素包被的磁珠。

向一个15毫升的锥形离心管中加入2毫升 freshly-prepared hybridization buffer、1毫升补充裂解缓冲液、1.5微克经片段大小分级的RNA以及100微升重悬的磁珠。轻轻涡旋混匀。在37摄氏度下孵育30分钟，并进行末端对末端旋转。

孵育结束后，用预热的洗涤缓冲液洗涤磁珠五次。第五次洗涤完成后，将含有磁珠的微量离心管置于磁力架上静置一分钟，然后移除洗涤缓冲液。向洗涤后的磁珠中加入一毫升冰冷的T4多聚核苷酸激酶缓冲液。

将珠子在4°C条件下轻轻旋转孵育五分钟。将含有珠子的微量离心管置于磁力架上。一分钟后，轻轻吸去缓冲液。

重复此步骤，共洗涤两次，并在最后一次洗涤后移除缓冲液。接下来，按照随附文件中的说明，将5'端和3'端修饰为可进行连接，并执行邻近连接反应。洗涤后，向磁珠中加入100 µL RNA PK缓冲液，通过上下吹打重悬磁珠。

将样品置于金属浴中，95 摄氏度加热 10 分钟。随后将样品置于冰上冷却 1 分钟。向样品中加入 500 µL 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液。

剧烈涡旋振荡10秒以混合。将混合物在室温下孵育10分钟。孵育结束后，使用试剂盒对RNA进行沉淀、纯化和回收，确保保留包括小分子RNA在内的所有RNA。

用100微升无核酸酶的水洗脱RNA。将100微升洗脱后的样品转移至置于冰上的24孔板的一个孔中。保持样品处于冰上，用254纳米的紫外线照射5分钟。

将反向交联的样品转移至一个干净的微量离心管中。加入10 µL乙酸钠、1 µL糖原和300 µL 100%乙醇。在-20 °C下沉淀RNA至少一小时。

为了回收RNA，将沉淀的RNA在4°C条件下以20,000 × g离心30分钟。离心后，弃去上清液，并加入1毫升70%冷乙醇洗涤RNA沉淀。将洗涤后的沉淀在4°C条件下以20,000 × g离心15分钟。

去除洗涤缓冲液，加入 4.25 µL 无核酸酶水以重悬 RNA。将 RNA 转移至 0.2 mL PCR 管中。最后，根据随附文件中的说明对 cDNA 进行逆转录、环化和扩增。

该示意图展示了 SPLASH 实验流程。在加入生物素标记的补骨脂素并存在 0.01% 狄吉通（digitonin）的条件下进行紫外交联后，从细胞中提取总 RNA，并进行点杂交以确认交联效率。随后使用生物素标记的 20 碱基寡核苷酸作为阳性对照，滴定加入细胞中的生物素化补骨脂素用量，使大约每 150 个碱基中有一个发生交联。

随后使用逐渐增加的PCR循环次数进行小规模PCR扩增，以确定深度测序所需的最少循环数。在高效的文库构建过程中，仅需少于15个PCR扩增循环，即可从1.5微克经片段大小筛选的RNA起始量中扩增出cDNA测序文库。然后，使用高通量测序仪对文库进行双端150个碱基的测序。

随后根据计算流程对测序读段进行处理。最终结果是一份经过筛选的嵌合相互作用列表，其中包含转录组中的分子内和分子间 RNA-RNA 相互作用。在新生物体上使用 SPLASH 时，务必注意检查生物素化补骨脂素的掺入情况。

该技术问世后，为RNA生物学领域的研究人员探索多种生物体内的RNA相互作用开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建测序文库，以全面捕获细胞内成对的RNA相互作用。