使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用

本视频的总体目标是描述补骨脂素交联连接和选定杂交种或 SPLASH 的测序方法，其中成对体内 RNA-RNA 相互作用以全基因组方式进行定位。该技术是一种简单的高通量方法，用于绘制体内 RNA 相互作用。这种方法可以帮助回答 RNA 基因组学领域的关键问题，例如沿单条 RNA 链或不同 RNA 链之间的不同区域如何相互作用。

虽然这种方法可以提供对酵母和人类细胞的见解，但它也可以应用于其他现代生物的研究，包括细胞中的细菌和膜。我们最初想到这种方法是在我们想出一种绘制相互作用分子的方法时。请注意，以下过程包含多个停止点。

此时，实验可以短暂或无限期暂停。详细信息可在随附的文本中找到。通过用 5 毫升 PBS 洗涤 HeLa 细胞两次来开始此过程。

将培养皿垂直放置 1 分钟，以完全排出多余的 PBS。接下来，加入 1 毫升含有 200 微摩尔生物素化补骨脂素和 0.01% 洋地黄皂苷的 PBS，以增加细胞通透性。注意将溶液均匀地添加到细胞表面。

在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育后，取下培养皿的盖子，将其放在距离 UV 灯泡 3 厘米的 UV 交联剂内的冰上。用 365 纳米紫外线照射 20 分钟。

20 分钟后，从交联剂中取出培养皿，然后根据随附文件中的说明从 HeLa 细胞中分离片段并沉淀 RNA。将变性分子量标准和 RNA 样品上样到 8.6 平方厘米的 6%TBE-尿素凝胶上。通过 180 伏电泳 40 分钟进行大小分级分离。

在 10 毫升含有 1：10， 000 稀释度的核酸凝胶染料的 TBE 缓冲液中对凝胶进行染色，在黑暗中染色 5 分钟。凝胶染色时，使用 24 号针头在底部刺穿干净的 0.6 ml 微量离心管。将其放入 2 毫升微量离心管中。

使用透射仪，观察后染色凝胶上的条带，并切割对应于 90 至 110 个核苷酸的凝胶切片。将凝胶切片转移到 2 ml 微量离心管中穿刺的 0.6 mL 微量离心管中。大小选择使我们能够设置嵌合片段的最小长度，并在以后区分连接产物和非连接产物。

在室温下以 12， 000 倍 g 离心凝胶切片 2 分钟，将凝胶切片切碎，并收集在 2 毫升微量离心管中。离心后，丢弃空的 0.6 毫升微量离心管。向切碎的凝胶切片中加入 700 μL 洗脱缓冲液。

在 4 摄氏度下孵育过夜，不断旋转，以使样品扩散到缓冲液中。将凝胶切片和洗脱缓冲液转移到离心管过滤器中，并以 20， 000 次 g 离心 20 分钟。旋转后，凝胶切片将被困在过滤器的顶部隔室中，该隔室可能会被丢弃。

如随附文件所述沉淀和定量 RNA。将 RNA 快速冷冻并储存在零下 80 摄氏度的液氮中，直至使用。为了富集 RNA 交联区域，首先加入 100 μL 含有 RNase 抑制剂的裂解缓冲液，以在微量离心管中洗涤链霉亲和素包被的磁珠。

向 15 mL 锥形离心管中加入 2 mL 新鲜制备的杂交缓冲液、1 mL 补充的裂解缓冲液、1.5 μg 大小分级 RNA 和 100 μL 重悬珠子。轻轻涡旋试管。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，端到端旋转。

孵育后，用预热的洗涤缓冲液洗涤珠子五次。在第五次洗涤结束时，将含有磁珠的微量离心管放在磁架上 1 分钟，然后取出洗涤缓冲液。向洗涤过的磁珠中加入 1 毫升冷的 T4 多核苷酸激酶缓冲液。

将珠子在 4 摄氏度下孵育 5 分钟，并端到端旋转。将含有磁珠的微量离心管放在磁条上。1 分钟后，轻轻去除缓冲液。

重复此步骤，总共洗涤两次，并在最后一次洗涤后去除缓冲液。接下来，按照随附文档中的说明将 5 个 Prime 和 3 个 Prime 末端转换为连接兼容并执行邻位连接。洗涤后，向磁珠中加入 100 μL RNA PK 缓冲液，并通过上下吹打重悬。

加热块上将样品在 95 摄氏度下加热 10 分钟。接下来，将样品在冰上冷却 1 分钟。向样品中加入 500 微升硫氰酸胍-苯酚-氯仿。

剧烈涡旋 10 秒钟，混合。将混合物在室温下孵育 10 分钟。孵育后，使用试剂盒沉淀、纯化和回收 RNA，确保保留即使是小 RNA。

在 100 μL 无核酸酶水中洗脱 RNA。将 100 微升洗脱的样品转移到 nice 的 24 孔板的孔中。将样品放在冰上，以 254 纳米的紫外线照射 5 分钟。

将反向交联样品转移到干净的微量离心管中。加入 10 微升乙酸钠、1 微升糖原和 300 微升 100% 乙醇。在零下 20 摄氏度下沉淀 RNA 至少一小时。

为了回收 RNA，将沉淀的 RNA 在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 g 离心 30 分钟。离心后，去除上清液并加入 1 毫升 70% 冷乙醇以洗涤 RNA 沉淀。将洗涤后的沉淀在 4 摄氏度下以 20， 000 次 g 离心 15 分钟。

去除洗涤缓冲液并加入 4.25 μL 无核酸酶水以重悬 RNA。将 RNA 转移到 0.2 mL PCR 管中。最后，根据随附文件中的说明对 cDNA 进行逆转录、环化和扩增。

此示意图描述了 SPLASH 工作流程。在 0.01% 洋地黄皂苷存在下加入生物素化补骨脂素并进行紫外线交联后，从细胞中提取总 RNA，并进行斑点印迹以确保交联有效。然后将生物素化的 20 个碱基寡核苷酸用作阳性对照，滴定要添加到细胞中的生物素化补骨脂素的量，使得大约每 150 个碱基中就有 1 个碱基交联。

然后使用增加的 PCR 循环数进行小规模 PCR 扩增，以确定深度测序所需的最小循环数。在高效的文库制备过程中，可以在不到 15 个循环的 PCR 扩增中从 1.5 μg 大小的选定 RNA 起始量中扩增 cDNA 测序文库。然后在整个测序机上使用两个 150 个碱基对读数对文库进行测序。

然后根据计算管道处理测序读数。最终结果是过滤的嵌合相互作用列表，其中包括转录组中的分子内和分子间 RNA-RNA 相互作用。在尝试此程序时，重要的是要记住在新生物体上使用 SPLASH 时检查生物素化补骨脂素掺入。

开发后，这项技术为 RNA 生物学领域的研究人员探索不同生物体中的 RNA 相互作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何制作测序文库有一个很好的了解，该文库可在细胞中全局捕获成对 RNA 相互作用。