Name: 使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学习SPLASH技术，利用生物素化补骨脂素交联和测序方法，在全基因组范围内定位体内RNA-RNA相互作用。该技术适用于酵母、细菌和人类细胞，为RNA基因组学研究提供高通量解决方案。

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我们感谢万氏实验室和纳加拉扬实验室成员提供的有益讨论。N. Nagarajan 获得新加坡科技研究局（A*STAR）的资金支持。Y. Wan 获得新加坡科技研究局（A*STAR）以及社会科学研究-布兰科·韦斯博士后 fellowship（Society in Science-Branco Weiss Fellowship）的资金支持。

1. 用生物素标记的补骨脂素处理 HeLa 细胞及 RNA 提取
<ol>
	<li>在10 cm培养皿中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养HeLa细胞。</li>
	<li>用5 mL 1× PBS洗涤HeLa细胞两次。将培养皿垂直放置1分钟，彻底去除多余的PBS。</li>
	<li>向细胞中均匀加入1 mL含有200 µM生物素化补骨脂素和0.01% w/v皂苷（digitonin）的PBS，于37 °C孵育5分钟。生物素化补骨脂素本身可进入细胞，但在0.01%皂苷中处理5分钟可显著提高其细胞通透性。</li>
	<li>取下含处理后HeLa细胞的10 cm培养皿盖，将培养皿平放于冰上。使用紫外交联仪，在距紫外灯管3 cm处，以365 nm紫外光在冰上照射20分钟。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取HeLa细胞总RNA。加入等体积异丙醇，在室温下沉淀RNA 30分钟。 
	暂停点：RNA可在异丙醇中于-20 °C长期保存。此步骤可进行点杂交（dot blot）检测，以确认生物素化补骨脂素已成功进入细胞并在体内（in vivo）实现RNA交联（图2）。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，收集沉淀的RNA。弃去上清液，加入1 mL 70%冷乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 × g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀在室温下空气干燥5分钟。</li>
	<li>向RNA沉淀中加入无核酸酶水，使用紫外分光光度计测定RNA浓度。 
	暂停点：RNA经液氮速冻后可在-80 °C保存。</li>
</ol>
2. RNA 片段化
<ol>
	<li>将15 µL 2x RNA断裂缓冲液和10 µL RNA样品（1 µg/µL）分别加入0.2 mL PCR管中，在95 °C预热1分钟。用移液器反复吹打，将10 µL加热后的2x RNA断裂缓冲液与10 µL RNA样品混合。在95 °C孵育5分钟。将反应管迅速置于冰上进行骤冷，以终止反应。</li>
	<li>将两次断裂反应产物转移并合并至1.5 mL微量离心管中。向反应体系中加入40 µL无核酸酶水、10 µL 3 M醋酸钠、1 µL糖原和300 µL 100%乙醇。在-20 °C孵育至少1小时，以沉淀RNA。</li>
	<li>在20,000 × g离心30分钟，弃去上清液，并用1 mL 70%乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>在20,000 × g离心15分钟，弃去上清液，将RNA沉淀溶解于20 µL无核酸酶水中。</li>
</ol>
3. RNA 大小选择与洗脱
<ol>
	<li>在微量离心管中回收的 RNA 中加入 20 µL RNA 上样染料。将 RNA 与 RNA 上样染料在 95 °C 加热 3 分钟，然后置于冰上 2 分钟。</li>
	<li>在微量离心管中，向 0.25 µL 的 10 nt DNA 标准品中加入 3 µL RNA 上样染料。将标准品在 95 °C 加热 3 分钟，然后置于冰上 2 分钟。</li>
	<li>将变性的标准品和样品上样至一块 8.6 cm × 6.8 cm 的 6% TBE 尿素凝胶中，在 180 V 条件下电泳 40 分钟进行大小分离。将凝胶置于含 1:10,000 核酸凝胶染料的 10 mL TBE 缓冲液中避光染色 5 分钟。</li>
	<li>使用 24 G 针头在干净的 0.6 mL 微量离心管底部打孔，并将其放入一个 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>使用透射成像仪观察染色后凝胶上的条带，切取对应于 90–110 nt 的凝胶片段。将该凝胶片段转移至置于 2 mL 微量离心管中的打孔 0.6 mL 微量离心管中。此大小选择步骤旨在确保嵌合片段具有足够的最小长度以比对至转录组，并在后续的大小选择步骤中区分邻近连接产物与未连接产物。</li>
	<li>将凝胶片段在室温下以 12,000 × g 离心 2 分钟，使凝胶破碎并落入 2 mL 微量离心管中。弃去空的 0.6 mL 微量离心管。向 2 mL 微量离心管中的破碎凝胶中加入 700 µL 洗脱缓冲液，并在 4 °C 下持续旋转孵育过夜，以使样品充分扩散进入缓冲液。</li>
	<li>将凝胶碎片和洗脱缓冲液转移至离心过滤管中，以 20,000 × g 离心 2 分钟。凝胶碎片将被截留在过滤管的上层腔室中。弃去凝胶碎片及上层腔室。</li>
	<li>向微量离心管中的滤液中加入 1 µL 糖原和 700 µL 100% 异丙醇，在 -20 °C 沉淀 RNA 至少 1 小时或过夜。 
	暂停点：RNA 可在 -20 °C 条件下于异丙醇中无限期保存。</li>
	<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 30 分钟，回收沉淀的 RNA。弃去上清液，加入 1 mL 70% 冷乙醇洗涤 RNA 沉淀。将洗涤后的沉淀在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>弃去洗涤液，加入 20 µL 无核酸酶水以重悬 RNA。使用紫外分光光度计测定 RNA 浓度。 
	暂停点：RNA 经液氮速冻后可在 -80 °C 长期保存。</li>
</ol>
4. RNA 交联区域的富集
<ol>
	<li>剧烈涡旋搅拌偶联链霉亲和素的磁珠，使磁珠在管中均匀重悬。取100 µL磁珠转移至1.5 mL微量离心管中，将管置于磁力架上1分钟，使磁珠吸附至管壁的磁性一侧。小心移除保存缓冲液，并将管从磁力架上取下。</li>
	<li>向微量离心管中的磁珠加入1 mL裂解缓冲液，上下吹打混匀。将含有磁珠的微量离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠与洗涤缓冲液分离。重复此步骤，共洗涤3次。</li>
	<li>将含有磁珠的微量离心管置于磁力架上1分钟，去除洗涤缓冲液。在裂解缓冲液中加入RNase抑制剂（1:200），然后向经洗涤的磁珠中加入100 µL裂解缓冲液。</li>
	<li>在15 mL锥形离心管中加入2 mL新鲜配制的杂交缓冲液、1 mL添加物补充的裂解缓冲液、1.5 µg经尺寸分级的RNA以及100 µL重悬的磁珠。轻轻涡旋混匀。</li>
	<li>将15 mL锥形离心管在37 °C下孵育30分钟，并进行端对端旋转。同时将洗涤缓冲液预热至37 °C。</li>
	<li>将15 mL锥形离心管置于适用于15 mL管的磁力架上2分钟，使磁珠与缓冲液分离。小心用移液器吸出管内缓冲液并弃去。</li>
	<li>向磁珠中加入1 mL预热的洗涤缓冲液，上下吹打混匀，然后将磁珠转移至1.5 mL微量离心管中。在37 °C下孵育5分钟，并进行端对端旋转。</li>
	<li>短暂离心微量离心管内容物。将含有洗涤后磁珠的1.5 mL微量离心管置于适用于2 mL管的磁力架上1分钟，使磁珠与洗涤缓冲液分离。通过轻轻移液将洗涤缓冲液从微量离心管中吸出并去除。</li>
	<li>向磁珠中加入1 mL预热的洗涤缓冲液，上下吹打混匀以重复洗涤步骤。总共进行5次洗涤。在第5th次洗涤结束后，将含有磁珠的微量离心管置于磁力架上1分钟，去除洗涤缓冲液。</li>
</ol>
5. 邻近连接
<ol>
	<li>向洗涤后的磁珠中加入 1 mL 冷的 T4 多核苷酸激酶（PNK）缓冲液，在 4 °C 下以末端旋转方式孵育 5 分钟。将含有磁珠的微量离心管置于磁力架上 1 分钟，轻轻移除 T4 PNK 缓冲液。重复此步骤共洗涤 2 次，并在最后一次洗涤后彻底移除 T4 PNK 缓冲液。</li>
	<li>根据 表 1 向磁珠中加入相应缓冲液。为使 RNA 片段的 3' 末端能够与后续的 3' 接头连接，请在 37 °C 下以持续振荡条件孵育反应体系 4 小时，将 RNA 末端的 3' 环状磷酸基团转化为 3' 羟基（3' OH）。</li>
	<li>根据 表 2 向前一步反应中添加缓冲液。为使 RNA 片段的 5' 末端具备连接活性，在 ATP 存在下于 37 °C 持续振荡孵育 1 小时，将 RNA 上的 5' 羟基（5' OH）转化为 5' 磷酸基团。</li>
	<li>根据 表 3 向前一步反应中加入缓冲液以进行邻近连接反应。在 16 °C 下持续振荡孵育 16 小时。</li>
	<li>将含有连接后 RNA 的微量离心管置于磁力架上 1 分钟。小心移除上清液，向磁珠中加入 1 mL 室温洗涤缓冲液，通过上下吹打重悬磁珠。</li>
	<li>将微量离心管再次置于磁力架上 1 分钟，小心移除洗涤缓冲液。共进行 2 次洗涤，并在第二次洗涤结束后彻底移除洗涤缓冲液。</li>
	<li>向磁珠中加入 100 µL RNA PK 缓冲液，通过上下吹打重悬磁珠。将样品在 95 °C 金属浴中加热 10 分钟。</li>
	<li>将样品在冰上冷却 1 分钟，然后向样品中加入 500 µL 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液。剧烈涡旋混匀 10 秒。在室温下孵育 10 分钟。 
	暂停点：RNA 可在 -80 °C 条件下于异硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液中保存数月。</li>
	<li>向异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取的样品中加入 100 µL 氯仿。剧烈涡旋 10 秒。在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将 400 µL 水相转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。加入 800 µL（2 倍体积）100% 乙醇，通过上下吹打混匀。</li>
	<li>将 RNA 溶液转移至 RNA 纯化柱中，按照制造商说明书回收 RNA，确保小分子 RNA 也被有效保留。用 100 µL 无核酸酶水洗脱 RNA。 
	暂停点：RNA 经液氮速冻后可在 -80 °C 长期保存。</li>
</ol>
6. 生物素化补骨脂素的逆转交联
<ol>
	<li>将100 µL洗脱样品转移至24孔板的一个孔中。移去盖子，并在254 nm紫外光下照射样品。&#160;冰上孵育5分钟。</li>
	<li>将反向解交联的样品转移至洁净的微量离心管中，加入10 µL乙酸钠、1 µL糖原和300 µL 100%乙醇，于-20 °C沉淀RNA至少1小时或过夜。 
	暂停点：RNA可在-20 °C乙醇中无限期沉淀保存。</li>
	<li>在4 °C条件下，以20,000 x g离心沉淀的RNA 30分钟，以回收RNA。弃去上清液，加入1 mL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以20,000 x g离心洗涤后的沉淀15分钟。弃去洗涤缓冲液，加入4.25 µL无核酸酶水以重悬RNA。将RNA转移至0.2 mL PCR管中。 
	暂停点：RNA 经液氮速冻后可在 -80 °C 保存。</li>
</ol>
7. 逆转录与 cDNA 环化
<ol>
	<li>在PCR管中，向重悬的样品加入0.75 µL RNA连接子（0.5 µg/µL），在80 °C加热90秒，然后将样品置于冰上2分钟。</li>
	<li>根据表4，向已变性的样品中加入缓冲液，用于3'接头连接反应，在25 °C孵育2.5小时。</li>
	<li>将反应液转移至1.5 mL微量离心管中。向反应液中加入90 µL无核酸酶水，随后加入10 µL乙酸钠、1 µL糖原和300 µL 100%乙醇。在-20 °C下沉淀RNA至少1小时或过夜。 
	暂停点：RNA可在-20 °C的乙醇中无限期保存。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，回收沉淀的RNA。弃去上清液，加入1 mL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>将洗涤后的沉淀在4 °C下以20,000 g离心15分钟。弃去洗涤液，将沉淀重悬于5 µL无核酸酶水中。</li>
	<li>在微量离心管中，向回收的RNA中加入5 µL RNA上样染料。将RNA与上样染料在95 °C加热3分钟，然后置于冰上2分钟。</li>
	<li>在微量离心管中，向0.25 µL 10 nt DNA分子量标准中加入3 µL RNA上样染料。将DNA标准在95 °C加热3分钟，然后置于冰上2分钟。</li>
	<li>使用8.6 cm × 6.8 cm 6% TBE尿素凝胶进行大小分离，操作同步骤3.3和3.4。</li>
	<li>使用透射仪观察经核酸染料染色的凝胶，根据DNA标准条带切取对应110–140 nt的凝胶片段。将凝胶片段转移至已穿孔的0.6 mL微量离心管中（置于2 mL微量离心管内），并按照步骤3.6–3.9的方案继续操作。</li>
	<li>加入5 µL无核酸酶水以重悬RNA沉淀。将RNA转移至0.2 mL PCR管中。 
	暂停点：RNA经液氮速冻后可在-80 °C长期保存。</li>
	<li>在PCR管中向RNA加入1 µL浓度为1.25 µM的逆转录引物（RT primer），在80 °C加热2分钟，然后将样品置于冰上2分钟。</li>
	<li>根据表5加入逆转录反应所需缓冲液，在50 °C孵育30分钟。</li>
	<li>向反应体系中加入1.1 µL 1 N NaOH，在98 °C加热20分钟。将反应液置于冰上冷却。</li>
	<li>将反应液转移至1.5 mL微量离心管中。向反应液中加入90 µL无核酸酶水，随后加入10 µL乙酸钠、1 µL糖原和300 µL 100%乙醇。在-20 °C下沉淀DNA至少1小时或过夜。 
	暂停点：DNA可在-20 °C的乙醇中无限期保存。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 g离心30分钟，回收沉淀的DNA。弃去上清液，加入1 mL预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀。将洗涤后的沉淀在4 °C下以20,000 × g离心15分钟。弃去洗涤液，将沉淀重悬于5 µL无核酸酶水中。</li>
	<li>使用8.6 cm × 6.8 cm 6% TBE尿素凝胶进行大小分离，操作同步骤3.3和3.4。</li>
	<li>使用透射仪观察染色后的凝胶，根据DNA标准条带切取对应200–240&#160;nt的凝胶片段。由于加入了96个碱基的逆转录引物，逆转录生成的cDNA比原始RNA片段长96个碱基。将凝胶片段转移至已穿孔的0.6 mL微量离心管中（置于2 mL微量离心管内）。</li>
	<li>在室温下以12,000 × g离心2分钟，使凝胶碎片化并收集至2 mL微量离心管中。弃去空的0.6 mL微量离心管。</li>
	<li>向2 mL微量离心管中的凝胶碎片中加入700 µL洗脱缓冲液，在37 °C下以持续旋转方式孵育2小时。后续操作参照步骤3.7–3.8所述方案进行。</li>
	<li>加入6 µL无核酸酶水以重悬DNA沉淀。将DNA转移至0.2 mL PCR管中。 
	暂停点：DNA经液氮速冻后可在-80 °C长期保存。</li>
	<li>根据表6向反应体系中加入cDNA环化所需缓冲液，在60 °C孵育1小时，随后在80 °C加热10分钟以终止反应。</li>
	<li>将反应液转移至1.5 mL微量离心管中。使用DNA纯化柱按照制造商说明书纯化环化cDNA。向纯化柱中加入20 µL无核酸酶水以洗脱纯化的cDNA。 
	暂停点：DNA可在-20 °C保存数月。</li>
</ol>
8. PCR 扩增（小规模 PCR）
<ol>
	<li>根据表7将缓冲液加入PCR扩增反应体系中，以检测文库扩增所需的最少循环次数。</li>
	<li>根据表8设置PCR扩增程序，在10、15和20个循环时暂停反应，分别取5 µL PCR反应产物，转移至不同的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在不同循环数的5 µL PCR反应产物中各加入1 µL 6x DNA上样缓冲液，在3%琼脂糖凝胶上以120 V电泳1小时，以观察PCR产物。
	<ol>
		<li>选择显示在约250个碱基处有扩增条带的最少PCR循环数（Y）（在图3中，15个循环时条带明显，10个循环时条带微弱。由于大规模PCR扩增所用cDNA量是小规模扩增的10倍，因此12个循环的大规模PCR扩增很可能产生足够用于深度测序的产物量）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. PCR 扩增（大规模 PCR）及纯化
<ol>
	<li>根据表9将缓冲液加入反应体系，用于大规模PCR扩增。</li>
	<li>根据表10设置PCR扩增的循环条件。</li>
	<li>向25 µL的PCR反应产物中加入5 µL的6x DNA凝胶上样染料，并上样至3%琼脂糖凝胶的加样孔中。在另一加样孔中加入1 kb plus DNA Marker。以100 V电压进行凝胶电泳，持续1.5小时。</li>
	<li>使用紫外透射仪观察电泳完成后的凝胶。</li>
	<li>切取含有200–300碱基PCR产物的凝胶片段，并转移至一个洁净的2 mL微量离心管中。</li>
	<li>向凝胶片段中加入1 mL DNA凝胶回收试剂盒中的凝胶溶解缓冲液，在室温下持续振荡孵育30分钟，或直至凝胶完全溶解。</li>
	<li>向溶解后的凝胶溶液中加入200 µL异丙醇，用移液器充分混匀。将700 µL样品转移至DNA凝胶回收纯化柱中，在13,000 × g离心30秒。重复此步骤，直至所有样品均加载至纯化柱中。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，向纯化柱中依次加入500 µL凝胶溶解缓冲液和700 µL柱洗涤缓冲液。最后，向纯化柱中央加入12 µL无核酸酶水以洗脱DNA。暂停点：DNA可在-20 °C条件下保存。</li>
	<li>使用荧光定量法测定DNA浓度。若构建了多个文库并合并进行测序，则应将等量的各文库样品加入混合池中，用于高通量测序。</li>
</ol>

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
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<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
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<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

作者没有竞争性财务利益。

本文详细描述了 SPLASH 方法的实验与计算工作流程，该方法能够以全基因组范围的方式鉴定 RNA 分子间的成对相互作用。我们已成功在细菌、酵母和人类细胞培养物中应用 SPLASH，并预期该策略可广泛适用于不同细胞状态下多种生物体。本实验方案中的一个关键步骤是起始材料需至少含有 20 µg 的交联 RNA，以确保后续步骤有足够的起始量。随后将 RNA 片段化至约 100 个碱基，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行片段大小筛选。这些步骤对于在文库构建过程中优先富集连接形成的嵌合 RNA 分子而非单体分子至关重要。通常在完成片段化及首次大小筛选后，可回收约 1.5 µg 的 RNA，随后根据 SPLASH 工作流程将其转化为 cDNA 文库。我们发现，使用该量级的起始 RNA 可在少于 15 个 PCR 扩增循环的条件下获得足够用于高通量测序的文库材料。由于 PCR 扩增循环次数增加会导致扩增重复序列数量急剧上升，因此保持较低的扩增循环数对于在后续分析中有效识别出有意义且唯一的嵌合序列至关重要。
与其它基于补骨脂素的全基因组策略不同，SPLASH 利用生物素标记的补骨脂素将碱基配...

研究大分子如何折叠以及如何相互作用是理解细胞内基因调控的关键。尽管过去十年中，大量研究集中在DNA和蛋白质如何参与基因调控方面，但关于基因表达的转录后调控，目前了解仍相对较少。RNA的信息不仅存在于其线性序列中，也存在于其二级和三级结构中1。RNA在体内能够与自身或其他RNA发生碱基配对，这种能力对其功能至关重要。in vivo。近年来，高通量RNA二级结构探测技术的进步为转录组中双链和单链区域的位置提供了宝贵的见解2,3,4,5,6,7,8，然而关于配对相互作用伙伴的信息仍然严重缺乏。要确定转录组中哪些RNA序列正在与另一RNA区域发生相互作用，我们需要全局性的成对信息。
以全局性、无偏倚的方式绘制RNA成对相互作用图谱一直是重大挑战。尽管此前已有CLASH等方法9, hiCLIP10 和 RAP11，用于大规模鉴定RNA相互作用，这些技术通常针对与特定蛋白质或RNA种类相互作用的一部分RNA，绘制其碱基配对图谱。近年来，在研究全局RNA相互作用方面的新进展包括RPL方法12，该方法不能稳定RNA相互作用 体内 因此可能仅能捕获其中的一个子集 体内 相互作用。为克服这些挑战，我们及其他研究者开发了全基因组范围、无偏倚的策略，以绘制RNA相互作用组 体内，使用补骨脂素交联剂的改良版本13,14,15在本方案中，我们详细描述了进行 S测序 P补骨脂素交联， L探究，并 S选出的 H杂交技术（SPLASH），该技术利用生物素标记的补骨脂素来交联碱基配对的RNA 体内，随后通过邻近连接和高通量测序在全基因组范围内鉴定RNA的碱基配对伙伴（图1)15.
在本文中，我们描述了使用培养的贴壁细胞（此处为 HeLa 细胞）进行 SPLASH 实验的步骤。该方案可轻松适用于悬浮培养的哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。简言之，HeLa 细胞经生物素标记的补骨脂素处理后，在 365 nm 光照下进行辐照，以交联相互作用的 RNA 碱基对 体内随后从细胞中提取RNA，将其打断并利用链霉亲和素磁珠富集交联区域。通过邻近连接法将相互作用的RNA片段连接在一起，并构建cDNA文库用于深度测序。测序后，将嵌合RNA比对至转录组/基因组，以鉴定相互配对的RNA相互作用区域。我们已成功应用SPLASH技术鉴定了数千个RNA相互作用 体内 在酵母和多种人类细胞中，包括不同类别RNA（如snoRNA、lncRNA和mRNA）中的分子内和分子间RNA碱基配对，以揭示细胞内RNA的结构组织特征与相互作用模式。

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>10 bp DNA ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>20% SDS 溶液</td><td>First BASE</td><td>BUF-2052-1L&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M 醋酸钠溶液</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>核酸沉淀所需</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE 尿素凝胶组分</td></tr><tr><td>Ambion 缓冲液试剂盒</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵，分子生物学级&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&amp;nbsp;</td><td>TBE 尿素凝胶组分</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>单链 DNA 连接酶</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA 连接酶</td></tr><tr><td>离心管滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X 离心管滤器</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>用于细胞处理</td></tr><tr><td>Dark Reader 透射仪&amp;nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X 透射仪</td><td>蓝光透射仪</td></tr><tr><td>DNA 凝胶上样染料 (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>琼脂糖凝胶电泳所需</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>用于 HeLa 细胞培养</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>适用于 15&amp;nbsp;mL 管的磁力架</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>适用于 15&amp;nbsp;mL 管的磁力架</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&amp;nbsp;C</td></tr><tr><td>生物素标记的补骨脂素</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin</td></tr><tr><td>F8T5/BL&amp;nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&amp;nbsp;</td><td>365 nm 紫外灯泡</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>HeLa 培养基组分</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Promega</td><td>H5052&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>杂交缓冲液组分</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm 紫外灯泡</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>核酸沉淀所需</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>核酸定量用分光光度计</td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>First BASE</td><td>BUF-1180-500ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>HeLa 培养基组分</td></tr><tr><td>高保真 DNA 聚合酶 (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&amp;nbsp;</td><td>Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液，2x）</td></tr><tr><td>引物组 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&amp;nbsp;</td><td>PCR 引物</td></tr><tr><td>DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>荧光定量试剂盒</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini 试剂盒 硅胶膜柱</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>逆转录酶</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III 第一链合成预混液</td></tr><tr><td>核酸凝胶染料</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD 核酸染料 500 µL</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>末端修复酶</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>邻近连接用酶</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 2，截短型 KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>接头连接用酶</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE 尿素凝胶组分</td></tr><tr><td>硫氰酸胍-苯酚-氯仿</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&amp;reg; 试剂，用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>尿素</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>紫外透射仪</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>用于条带可视化</td></tr><tr><td>二甲苯青 FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA 浓缩柱-5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;所需软件列表&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC 软件</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr><tr><td>SeqPrep 软件</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWA 软件</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>SAMTOOLS 软件</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr><tr><td>PULLSEQ 软件</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR 软件</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON 脚本</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON 脚本</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK 脚本</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液组成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;洗脱缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M 醋酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;裂解缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>除洗涤磁珠外，使用前均需新鲜加入 Superase-in</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;蛋白酶 K 缓冲液&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;杂交缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% 甲酰胺（避光保存于 4 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使用前需新鲜加入 Superase-in</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2x SSC 洗涤缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x 氯化钠-柠檬酸钠（SSC）（由 20x SSC Invitrogen 储液稀释）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2x RNA 断裂缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2x RNA 上样染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% 甲酰胺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% 溴酚蓝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01% 二甲苯青</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3' RNA 接头序列：&lt;br /&gt;
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT 引物序列：&lt;br /&gt;
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制rna-rna相互作用

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

了解RNA如何与自身及其他RNA相互作用，是理解细胞中基于RNA的基因调控的关键。尽管已有研究表明RNA-RNA相互作用（如miRNA与mRNA的相互作用）可调控基因表达，但RNA在细胞内相互作用的广泛程度仍不清楚。以往研究RNA相互作用的方法主要集中于与特定蛋白质或特定RNA分子结合的RNA子集。本文详细介绍了一种名为 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用的全基因组捕获）技术，可实现RNA相互作用的全基因组范围捕获 体内 以无偏倚的方式。SPLASH 利用 体内 交联、邻近连接和高通量测序，以全局性鉴定RNA分子内和分子间的碱基配对伙伴。SPLASH技术可应用于多种生物体，包括细菌、酵母和人类细胞，以及不同的细胞状态，有助于深入理解多种细胞背景下RNA结构的动态特征。完整的SPLASH实验流程约需5天完成，计算分析流程约需7天完成。

图1展示了SPLASH实验流程的示意图。在加入生物素标记的补骨脂素并添加0.01%的皂苷（digitonin）后进行紫外交联，随后从细胞中提取总RNA，并进行点杂交以确认生物素已高效交联至RNA上（图2）。我们使用生物素标记的20碱基寡核苷酸作为阳性对照，以滴定加入细胞的生物素化补骨脂素的用量，使大约每150个碱基中有一个发生交联。
由于PCR扩增循环次数增加时更容易发生PCR重复事件，我们使用不同PCR循环次数进行小规模PCR扩增，以确定能够提供足够深度测序材料的最低扩增循环数。在高效的文库构建过程中，我们能够在少于15个PCR扩增循环内，从1.5 µg经片段大小筛选的RNA起始量中扩增出cDNA测序文库（图3）。随后，使用高通量测序仪进行2×150 bp双端测序，并根据<...

此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA 相互作用组。

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

了解RNA如何与自身及其他RNA相互作用，是理解细胞中基于RNA的基因调控的关键。尽管已有RNA-RNA相互作用的实例……

本视频的主要目标是介绍补骨脂素交联连接并富集杂交链测序（SPLASH）的方法，该方法可全基因组范围内绘制体内RNA-RNA成对相互作用图谱。该技术是一种简单、高通量的体内RNA相互作用图谱绘制方法。该方法有助于回答RNA基因组学领域的关键问题，例如：单条RNA链的不同区域之间，或不同RNA链之间如何相互作用。尽管该方法可为酵母细胞和人类细胞的研究提供见解，但也可应用于其他现代生物体的研究，包括细菌以及细胞中的膜结构。我们最初萌生这一方法的想法，是源于希望提出一种分子相互作用的作图方式。请注意，以下实验流程包含多个可暂停的步骤。在这些时间点，实验可暂时或无限期暂停。详细信息请见随附文本。开始该操作时，先用五毫升 PBS 将 HeLa 细胞洗涤两次。将培养皿垂直放置一分钟，以彻底沥干多余的 PBS。接着，加入 1 毫升含有 200 微摩尔生物素化补骨脂素和 0.01% 皂苷（digitonin）的 PBS 溶液，后者可提高细胞通透性。注意将溶液均匀地加在细胞表面。在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，打开培养皿盖子，将其置于紫外交联仪内的冰上，距离紫外灯管3厘米。用365纳米紫外光照射20分钟。20分钟后，从交联仪中取出培养皿，然后根据随附文件中的说明，从HeLa细胞中分离片段并沉淀RNA。将变性后的DNA标记物和RNA样品上样至一块8.6厘米见方的6% TBE-尿素凝胶中。在180伏电压下电泳40分钟，进行大小分离。在避光条件下，用 10 毫升含有 1:10,000 稀释的核酸凝胶染料的 TBE 缓冲液染色凝胶 5 分钟。染色的同时，用 24 号针头在洁净的 0.6 毫升微量离心管底部穿孔，并将其放入一个 2 毫升的微量离心管中。使用透射仪观察染色后凝胶上的条带，并切取对应于90至110个核苷酸的凝胶片段。将凝胶片段转移至已穿孔的0.6毫升微量离心管中，该小管置于2毫升微量离心管内。片段大小选择可使我们设定嵌合片段的最小长度，并在后续步骤中区分连接产物与未连接产物。将凝胶切片在室温下以12,000 × g离心两分钟，以破碎凝胶切片并收集至2毫升微量离心管中。离心后，弃去空的0.6毫升微量离心管。向破碎的凝胶切片中加入700 µL洗脱缓冲液。将样品在4°C下孵育过夜，并持续旋转以使样品充分扩散进入缓冲液。将凝胶切片和洗脱缓冲液转移至离心过滤管中，在20,000 × g条件下离心20分钟。离心后，凝胶切片将被截留在滤器的上层室中，可将其弃去。按照随附文档中所述方法沉淀并定量RNA。将RNA在液氮中速冻后，于负80摄氏度保存，直至使用。为富集RNA交联区域，首先在微型离心管中加入含有RNase抑制剂的100微升裂解缓冲液，洗涤链霉亲和素包被的磁珠。向一个15毫升的圆锥形离心管中加入2毫升新配制的杂交缓冲液、1毫升补充裂解缓冲液、1.5微克经尺寸分级的RNA以及100

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用

RNA转录本受到多种反式作用的RNA结合蛋白（RBPs）介导的广泛转录后调控。本文介绍一种可普遍应用的方法，用于精确且在全转录组范围内鉴定RBPs的RNA结合位点。...

PAR-CliP——一种用于鉴定RNA结合蛋白转录组范围结合位点的方法

RNA-蛋白质相互作用是许多细胞过程的核心。本文介绍一种在活体（in...

通过RaPID方法分离新型RNA结合蛋白

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。...

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

本文介绍了一种应用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略的详细方案，用于鉴定与编码RNA和非编码RNA结合的蛋白质。...

利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白

使用生物素-链霉亲和素策略纯化的RNA/蛋白质复合物在变性条件下洗脱至溶液中，其形式不适合进一步的纯化和功能分析。在此，我们描述了该策略的一种改进方法，该方法在RNA中利用光裂解接头并结合温和的紫外洗脱步骤，从而获得天然且完全具有功能的RNA/蛋白质复合物。...

使用与生物素及光裂解连接子相连的RNA一步纯化大分子复合物

本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol...

用于解析共转录 RNA 加工事件的人工 RNA 聚合酶 II 延伸复合物

本文介绍使用生物素标记的体外生化检测方法，该方法可广泛应用于 适用于研究蛋白质-核酸相互作用。...

利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

学习SPLASH技术，利用生物素化补骨脂素交联和测序方法，在全基因组范围内定位体内RNA-RNA相互作用。该技术适用于酵母、细菌和人类细胞，为RNA基因组学研究提供高通量解决方案。

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

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