Name: 目标原位组蛋白突变的基因在芽殖酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习在芽殖酵母中利用PCR和基因替换技术对组蛋白基因进行靶向突变的方法。该技术可精确研究特定组蛋白残基在染色质相关过程中的功能作用。

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我们感谢 Reine Protacio 在准备本手稿期间提出的宝贵意见。我们感谢美国国家科学基金会（资助编号：1243680 和 1613754）以及亨德里克斯学院 Odyssey 项目提供的经费支持。

注意：靶向实验策略的 原位 组蛋白基因诱变包含多个步骤（概括如下） 图1）。这些步骤包括：（1）用目标组蛋白基因的替换 URA3 基因，（2）利用带有目标突变的引物扩增并纯化对应于目标组蛋白基因两个部分重叠片段的PCR产物，（3）通过融合PCR将两个部分重叠的片段连接，获得用于整合的全长PCR产物，（4）将全长PCR产物与骨架质粒共转化，并基于质粒上的标记进行筛选，（5）筛选对5-FOA具有抗性的转化子，（6）纯化5-FOA抗性菌落并确认骨架质粒的丢失，（7）分子分析以检测突变等位基因的正确整合。
<img alt="基因编辑示意图，展示HHF1、HHT1突变步骤及DNA修饰过程。" src="/files/ftp_upload/55263/55263fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：靶向策略概述 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变 在此示例中，靶基因为 HHT2，但也可使用此策略对任何其他核心组蛋白基因进行诱变。A单倍体酵母细胞含有两个编码组蛋白H3的基因（HHT1 和 HHT2）以及两个编码组蛋白H4的基因 (HHF1 和 HHF2）排列方式如图所示（ HHT1 和 HHF1 基因位于II号染色体上，且 HHT2 和 HHF2 基因位于第 XIV 号染色体上——在每种情况下，箭头均指向转录方向。在该实验步骤的第一步中，目标基因的开放阅读框（ORF） HHT2 基因被替换为 URA3 基因，产生一个 hht2Δ::URA3 菌株。 (B在第1部分中，一个野生型拷贝的 HHT2 从基因组DNA样本中提取的基因作为模板，用于两次PCR反应，以扩增出该基因的两个部分重叠的片段。第一次反应的反向引物包含一个或多个错配的核苷酸（以红色圆圈表示），对应于拟引入基因组中的目标突变；第二次反应的正向引物则在反向互补位置含有相应的错配序列（同样以红色圆圈表示）。在第一部分中产生的两个PCR产物（产物） a 和 b) 随后作为融合 PCR 的模板，使用两种与产物退火的引物进行扩增 a 和 b 如第2部分所示的方式进行。这将产生全长的PCR产物（产物 c 在第3部分）含有目标突变（s）。C）该 hht2Δ::URA3 菌株随后与全长PCR产物和一个骨架质粒共转化（一个 HIS3-标记质粒（本示例中为含组氨酸合成基因的质粒），并通过在缺乏组氨酸的培养基上培养来筛选含有该质粒的细胞。随后对转化子进行5-FOA抗性筛选——具有5-FOA抗性的细胞可能是发生了同源重组事件，导致PCR产物整合并切除了质粒上的标记基因 URA3 基因，如图所示。随后通过有丝分裂丢失骨架质粒，从而获得最终所需组蛋白突变菌株。我们发现，与直接在5-FOA平板上进行筛选相比，先对骨架质粒进行筛选，再筛选5-FOA抗性，能够显著提高正确整合事件的检出频率，后者主要识别的是自发产生抗性的细胞 URA3 突变。（此图已根据参考文献修改）14). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55263/55263fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
1. 用 URA3 基因替换目标组蛋白基因
<ol>
	<li>通过标准的PCR介导的一步基因敲除方法，用 URA3 基因8,9. 
	注意：使用携带以下基因的酵母细胞 ura3Δ0 建议采用此突变，因为该突变可完全去除内源性 URA3 ORF，从而避免PCR产物整合到 URA3 位点8. 或者， K. lactis URA3 基因可被有效用于在任何情况下产生组蛋白替换 ura3 背景，因为它具有功能 S. cerevisiae 但与之仅有部分序列同源性 S. cerevisiae URA3 基因. 该菌株还应至少对一种化合物具有营养缺陷型特征，以便在转化实验中用于筛选骨架质粒（参见本方案的第4步）。如果使用 靶向组蛋白基因Δ::URA3 菌株已可获得。</li>
</ol>
2. 利用含有目标突变的引物扩增并纯化对应于目标组蛋白基因两个部分重叠片段的PCR产物
<ol>
	<li>扩增目标组蛋白基因的两个部分重叠的片段，生成相应的PCR产物。
	<ol>
		<li>按下表准备两份PCR反应：
		<ol>
			<li>生成对应于该基因前半部分的PCR产物（产物 a 在 图1B），建立以下反应体系： 1 μl 模板DNA， 5 μl10 μM 上游引物， 5 μl10 μM 反向引物， 0.5 μl (1.25 U) 耐热DNA聚合酶， 10 μl 5x DNA聚合酶缓冲液， 5 μl dNTP 混合物（各 2 mM），以及 23.5 μl dH2O. 
			注意：模板DNA可以是通过标准方法分离的、来源于目标组蛋白基因野生型菌株的基因组DNA10为避免不同基因组提取物中DNA浓度和杂质含量的差异，建议通过使用未稀释的DNA或对基因组提取物进行不同梯度稀释来优化反应例如， 1:10 和 1:100）。上游引物应与目的基因上游区域互补结合。下游引物应在开放阅读框（ORF）内结合，长度约为 40 个核苷酸，并在其中部位置包含所需的突变位点（参见 图1B-1 以及代表性结果部分中的示例）。建议使用高保真DNA聚合酶，以降低PCR产物合成过程中非预期突变的发生率。</li>
			<li>扩增对应于基因后半段的PCR产物（产物 b 在 图1B），按照2.1.1.1中的说明设置反应，但使用不同的引物。 
			注意：正向引物应在开放阅读框（ORF）内退火，长度约为40个核苷酸，且在其中部包含待引入的突变位点。需注意，该引物中的突变序列与2.1.1.1步骤中反向引物的突变序列互为反向互补。反向引物应退火至目标基因下游区域（参见 图1B-1 以及代表性结果部分中的示例）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将反应物置于热循环仪中，设置如下程序：94 ˚C 预变性 30 秒；进行 30 个循环，每个循环设置为：98 ˚C 变性 10 秒，60 ˚C 退火 5 秒，72 ˚C 延伸 1.5 分钟；最后 72 ˚C 终延伸 10 分钟。 
		注意：针对特定引物组和目标组蛋白基因，可能需要优化PCR参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 20 - 50 μl 在含有89 mM Tris碱、89 mM硼酸和2.5 mM EDTA（TBE缓冲液）的0.9%低熔点琼脂糖凝胶上进行PCR反应产物的电泳。</li>
	<li>使用洁净的解剖刀或剃须刀片从凝胶中切下含有PCR产物的琼脂糖凝胶片段，转移至1.5 ml微量离心管中。将含有PCR产物的琼脂糖凝胶片段于-20 ˚C保存，直至后续使用。</li>
</ol>
3. 通过融合 PCR 连接两个部分重叠的片段以获得用于整合的完整大小 PCR 产物
<ol>
	<li>准备PCR反应模板
	<ol>
		<li>将步骤2.3中的琼脂糖凝胶切片置于65 °C的加热金属块中孵育5分钟（或直至完全融化），以融化凝胶。每1–2分钟涡旋振荡一次，以促进融化过程。</li>
		<li>从每个样品中转移一定量的熔化琼脂糖例如, 50 μl 各，总计 100 μl) 加入一个微量离心管中，涡旋混匀。将此混合液作为模板用于融合PCR反应。将该管置于 -20 ˚C 保存，待用时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增大量全长PCR产物（产物 c 如图1B所示
	<ol>
		<li>设置六个 PCR 反应，每个反应包含以下组分： 2 μl 模板DNA， 10 μl 10 μM 上游引物， 10 μl 10 μM 反向引物， 1 μl (2.5 U) 耐热DNA聚合酶， 20 μl 5x DNA聚合酶缓冲液， 10 μl dNTP 混合物（各 2 mM），以及 47 μl dH2O. 
		注意：反应次数可根据 PCR 效率进行调整。模板 DNA（见 3.1.2）应加热至 65 °C 使其充分解链，涡旋混匀后，最后加入 PCR 反应体系中。加入后，通过移液器轻柔而充分地吹打数次，使溶液混合均匀。为校正不同样品间 DNA 浓度的差异，建议首先使用未稀释的模板或不同稀释倍数的模板进行反应条件优化例如， 1:10 和 1:100）。所用的两种引物应如图所示退火至目标基因的两个部分重叠的片段上 图1B-2 且设计时应确保最终的PCR产物在两侧至少有40个碱基与靶位点侧翼区域同源 URA3 用于驱动同源重组步骤的ORF（示例见代表性结果部分）。建议使用高保真DNA聚合酶，以降低PCR产物合成过程中非预期突变的发生率。</li>
		<li>将试管放入热循环仪中，设置如下程序：94 ˚C 30 秒；30 个循环，每个循环设置为：98 ˚C 10 秒，50 ˚C 15 秒，72 ˚C 1.5 分钟；最后 72 ˚C 延伸 10 分钟。 
		注意：针对特定引物组和目标组蛋白基因，可能需要优化PCR参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 全长PCR产物与骨架质粒的共转化及质粒标记基因的筛选
<ol>
	<li>PCR产物的浓度
	<ol>
		<li>将六个PCR反应合并600 μl 将步骤 3.2.2 中的全部样品合并至一个微量离心管中，涡旋混匀。</li>
		<li>将样品分为三份 200 μl 将等分试样加入微量离心管中。通过向每管中加入试剂沉淀DNA 20 μl 3 M 醋酸钠（pH 5.2） 550 μl 100% 乙醇。充分混匀溶液，置于冰上至少15分钟。在约14,000 × g离心10分钟以收集DNA，用沉淀物用 200 μl 70% 乙醇中，晾干。</li>
		<li>将每个DNA沉淀重悬于 25 μl 的 dH2O，并合并至一个离心管中（总体积为 75 μl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母共转化
	<ol>
		<li>在第1节构建的菌株中，于10 ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基中制备过夜培养物11.</li>
		<li>次日早晨，取8 mL过夜培养的饱和菌液接种于400 mL YPD液体培养基中，振荡培养于 30 °C 孵育4 - 5小时，使细胞进入对数生长期。</li>
		<li>通过离心（约 3,220 x g，10 分钟）收集细胞，弃去上清液，将细胞重悬于 1 体积的 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.1 M 醋酸锂溶液（TE/LiAc）中。</li>
		<li>以约 3,220 x g 离心 10 分钟收集细胞，弃去 TE/LiAc。</li>
		<li>用 1 ml TE/LiAc 重悬细胞。</li>
		<li>在微量离心管中配制以下反应混合液： 800 μl 来自步骤 4.2.5 的细胞， 40 μl 煮沸的10 mg/ml鲑鱼精子DNA，共计 12.5 μg 骨架质粒DNA，以及 75 μl 第4.1.3步中获得的浓缩PCR产物 
		注意：鲑鱼精子DNA在使用前应煮沸5分钟，并置于冰上至少5分钟。加入的骨架质粒DNA总体积应尽量保持最低（约80 μl 或更小。参见代表性结果部分中的骨架质粒示例。</li>
		<li>将混合液充分混匀后，均分至八个微量离心管中（1-8号管）。</li>
		<li>设置以下两个对照转化反应管：
		<ol>
			<li>9号管（无PCR产物对照）： 100 μl 来自步骤 4.2.5 的细胞， 5 μl 煮沸的10 mg/ml鲑鱼精子DNA（煮沸5分钟；参见步骤4.2.6的注释），共计 1.56 μg 无PCR产物加入的骨架质粒DNA。</li>
			<li>10号管（无DNA对照）： 100 μl 来自步骤 4.2.5 的细胞， 5 μL 煮沸的10 mg/mL鲑鱼精子DNA（见步骤4.2.6注），未添加骨架质粒DNA，未添加PCR产物。</li>
			<li>用移液器上下吹打数次，轻柔而充分地混匀两支试管中的液体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将十个试管在 30 ˚C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>向每个离心管中加入1.2 ml含40%聚乙二醇（PEG 3350）的TE/LiAc溶液。使用P-1000移液器充分混匀，直至溶液呈均一状态。</li>
		<li>将十个试管在指定条件下孵育 30 °C 30分钟。用移液器轻轻吹打混匀溶液，然后将试管置于 42 °C 15分钟。</li>
		<li>在微型离心机中以约14,000 × g离心30秒收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于1 ml无菌dH₂O中。2O.</li>
		<li>在微型离心机中以约 14,000 x g 离心 30 秒收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 500 μl 无菌去离子水2O.</li>
		<li>将1至8号管中的液体混合（总体积为4 ml），用移液器反复吹打充分混匀。</li>
		<li>培养皿 200 μl 在二十个完整的最小脱落培养基平板上分别加入上述混合物11 （平板1-20）用于骨架质粒的筛选。</li>
		<li>培养皿 200 μl 来自第9号管混合物的 200 μl 分别将第10管中的混合物接种到各自的筛选平板上（分别为平板21和平板22）。</li>
		<li>将22块平板置于培养箱中孵育 30 °C 3至5天，以筛选质粒转化子。</li>
		<li>在培养3至5天后检查转化平板。1至21号平板上应可见约5,000个菌落（参见代表性结果中的示例），22号平板上应无任何菌落生长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 筛选5-FOA抗性转化子
<ol>
	<li>通过影印接种法11将1-20号平板（以及作为对照的转化平板21号）上的细胞转移至5-氟乳清酸（5-FOA）平板上12，以筛选由于PCR产物在目标位点整合而导致的URA3基因丢失事件。
	<ol>
		<li>取下平板盖，将含有菌落的平板轻轻按压在无菌的绒布表面，随后将绒布上的细胞通过按压转移至5-FOA平板上。于30 °C培养2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经过2天培养后，仔细检查5-FOA平板上的生长情况。 
	注意：预期的整合事件表现为5-FOA平板上出现微小且不对称的“压扁状”菌落；相反，5-FOA平板上出现的小型凸起状微小菌落（papillae）更可能是转化平板上菌落生长过程中自发产生的URA3突变所致，因此不太可能代表目标整合事件（有关此点的进一步说明及示例，请参见代表性结果部分的图3）。</li>
</ol>
6. 5-FOA抗性菌落的纯化及骨架质粒的丢失
<ol>
	<li>使用无菌牙签从步骤5.2中所述的5-FOA平板上挑取候选菌落，并在YPD平板上划线以获得单菌落。于30 °C培养2至3天 30 °C.</li>
	<li>孵育结束后，进行印迹-将每个YPD纯化平板划线接种至一个新的YPD平板以及一个缺乏尿嘧啶的缺失培养基平板，以检测是否丢失了 URA3 基因，以及第二个缺失培养板用于检测骨架质粒的存在或缺失。在30 °C下孵育1 - 2天 30 °C.</li>
	<li>孵育结束后，从每个候选样本中鉴定出在 YPD 平板上生长但在两种缺陷培养基平板上均不生长的菌落（此类菌落预计已丢失了 URA3 通过重组事件获得目标基因并在有丝分裂过程中丢失了骨架质粒）。将此类菌落重新划线接种于新鲜的YPD平板上。这些菌落为整合候选菌，将在步骤7中进一步分析。</li>
</ol>
7. 检测突变等位基因正确整合的分子分析
<ol>
	<li>使用标准方法从候选样品中分离基因组DNA10.</li>
	<li>扩增包含靶位点的基因组区域。
	<ol>
		<li>为每个样本设置以下PCR反应： 0.5 μl 模板DNA， 5 μl 10 μM 上游引物， 5 μl 10 μM 反向引物， 0.5 μl (2.5 单位) Taq DNA 聚合酶， 5 μl 10x Taq DNA聚合酶缓冲液， 5 μl dNTP 混合物（各 2 mM），以及 29 μl dH2O. 
		注意：模板DNA来自候选样本的基因组DNA。建议同时设置两个对照反应：一个使用来源于原始样本的基因组DNA 组蛋白基因Δ::URA3 以突变株基因组DNA为模板进行一次反应，另一次则以野生型组蛋白株基因组DNA为模板。为校正不同基因组提取物在DNA浓度和杂质含量上的差异，建议通过使用未稀释的DNA或对基因组提取物进行不同梯度稀释来优化反应条件（例如， 1:10 和 1:100）。必须确保这些引物能够与DNA序列退火结合 外部 由推测整合的PCR产物所包含的区域——通过这种方法，这些反应中PCR产物的大小可作为判断产物是否在基因组正确位置整合的诊断工具（参见 代表性结果 （例如）。</li>
		<li>将反应物放入热循环仪中，设置如下程序： 94 °C 3 分钟；以下程序循环 30 次： 94 °C 45 秒 50 °C 45 秒 72 °C 2 分钟；以及 72 °C 10 min. 
		注意：针对特定引物组和目标组蛋白基因，可能需要优化PCR参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物的处理
	<ol>
		<li>运行 20 μl 在0.8% TBE琼脂糖凝胶上进行电泳分析。</li>
		<li>使用DNA标准品作为参照，评估PCR产物的大小，以确定是否 URA3 基因已成功被假定突变的组蛋白基因替换（示例结果参见代表性结果部分）。 
		注意：在某些情况下，引入组蛋白基因的预期突变可能会创建或消除一个限制性酶切位点。若存在此种情况，可通过将PCR产物进行相应限制性内切酶消化，随后进行凝胶电泳分析，以检测具有正确整合大小的PCR产物中是否含有预期突变（参见代表性结果中的示例）。</li>
		<li>对具有正确整合大小特征的PCR产物进行DNA测序，以确认目标突变的存在，并确保基因组中未引入其他额外突变。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在单倍体 S. cerevisiae 细胞中，编码四种核心组蛋白蛋白的两个非等位基因之间存在高度的序列同源性，这对希望特异性靶向其中一个基因进行诱变的研究人员构成了挑战。以往报道的酵母诱变方法，包括 Delitto Perfetto、位点特异性基因组（SSG）诱变以及无需克隆的基于PCR的等位基因替换方法5,6,7，以及较新的基于CRISPR的酵母技术15，通常至少部分依赖靶基因ORF内的序列，以将重组或修复机制招募至目标基因组位点，最终产生突变等位基因。相比之下，本文所提出的方法利用靶向ORF两侧的DNA序列来驱动同源重组事件，从而实现突变的整合；因此，即使两个基因的ORF高度同源，该方法仍可实现对其中一个基因的更特异性靶向。这一特点使本策略特别适用于组蛋白的诱变研究。然而，该策略也可适用于酵母基因组中其他基因的诱变。
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核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4在真核生物染色体的压缩、组织和功能中发挥着核心作用。每种组蛋白各两份共同形成组蛋白八聚体，这一分子“卷轴”可引导约147个碱基对的DNA缠绕其上，最终形成核小体1。核小体积极参与多种基于染色体的过程，例如基因转录的调控以及常染色质和异染色质在染色体上的形成，因此在过去数十年中一直是深入研究的重点。已有多种机制被描述，表明核小体可通过这些机制被调控，从而促进特定生物学过程的执行——这些机制包括组蛋白残基的翻译后修饰、ATP依赖性的核小体重塑，以及ATP非依赖性的核小体重组与组装/去组装2,3。
芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究真核生物组蛋白功能的极为强大的模式生物。这主要归因于组蛋白在真核生物域内具有高度的进化保守性，以及酵母适用于多种遗传学和生物化学实验方法4。酵母中的反向遗传学方法已被广泛用于研究特定组蛋白突变对染色质生物学多个方面的效应。在进行此类实验时，通常更倾向于使用突变组蛋白在其天然基因组位点表达的细胞，因为由自主型质粒表达可能导致组蛋白蛋白在细胞内水平异常（由于细胞中质粒拷贝数不均），并随之改变染色质环境，最终干扰实验结果的解释。
本文描述了一种基于PCR的技术，可实现组蛋白基因在其天然基因组位点上的靶向诱变，该技术无需克隆步骤，且可在基因组中产生目标突变，而不残留外源DNA序列。该技术利用了酵母高效的同源重组系统，与其他研究团队开发的类似技术具有多个共同特点，尤其是Delitto Perfetto、位点特异性基因组（SSG）诱变以及无克隆PCR介导的等位基因替换方法5,6,7。然而，本文所述技术具有一项独特优势，使其特别适用于组蛋白基因的诱变。在单倍体酵母细胞中，四种核心组蛋白中的每一种均由两个非等位且高度同源的基因编码：例如，组蛋白H3由HHT1和HHT2基因编码，这两个基因的开放阅读框（ORFs）序列同源性超过90%。如此高的同源性可能使旨在特异性靶向其中一个组蛋白编码基因的诱变实验变得复杂。前述方法通常需要利用目标基因ORF内的部分序列来驱动同源重组，而本文所述技术则利用组蛋白基因ORF两侧的侧翼序列（这些区域的序列同源性较低）进行重组，从而提高了成功靶向目标位点进行诱变的可能性。此外，驱动重组的同源区域可非常长，进一步增强了靶向同源重组的效率。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder（DNA标准品）</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合物（每种10 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA溶液（0.5 M，pH 8.0）</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 Proof）</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polymerase（高保真DNA聚合酶）&amp;nbsp;及5x缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9（Tris碱，粉末状）</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose（低熔点琼脂糖）</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq聚合酶及10x缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>牙签</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl（1 M，pH 8.0）</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>a-D(+)-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>用于酵母培养基</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>用于酵母培养基</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>用于YPD培养基</td></tr><tr><td>4-氨基苯甲酸</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘氨酸盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-精氨酸单盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-天冬酰胺一水合物</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-天冬氨酸钠盐一水合物</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐一水合物</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酸盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-组氨酸单盐酸盐一水合物</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-赖氨酸单盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肌醇（myo-Inositol）</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酵母氮源基础</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>用于完全最小缺陷培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5-氟乳清酸（5-FOA）</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>用于&amp;nbsp;5-FOA培养基</td></tr></tbody></table>

靶向 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

我们描述了一种基于PCR和同源重组的系统，用于在芽殖酵母细胞中对组蛋白基因进行靶向突变。所获得的突变等位基因位于其内源基因组位点，且在操作完成后基因组中不残留任何外源DNA序列。由于在单倍体酵母细胞中，四种核心组蛋白中的每一种均由两个非等位基因编码，且这些基因具有高度同源的开放阅读框（ORF），因此针对编码特定组蛋白的两个基因之一进行特异性靶向诱变可能存在困难。本文所述策略通过在同源重组步骤中利用靶基因ORF以外的序列而非其内部序列，从而规避了这一问题。该系统的另一特点是，驱动同源重组的DNA区域可设计得非常长，从而提高成功整合事件的发生概率。这些特点使该策略特别适用于组蛋白基因的诱变，但也可适用于酵母基因组中其他基因的诱变。

我们以表达组蛋白H3突变蛋白的hht2等位基因为例，该突变蛋白在第53位氨基酸发生由精氨酸到谷氨酸的置换（H3-R53E突变体），以此作为靶向原位突变策略的代表性示例。
我们构建了一个菌株，其中 HHT2 的完整开放阅读框被 URA3 基因取代（见方案步骤1）。该菌株（yAAD156）还携带一个 his3Δ200 等位基因，导致细胞组氨酸营养缺陷。根据方案中步骤2所述的操作流程，我们随后生成了两段部分重叠的 HHT2 片段。第一片段使用的引物如下：正向引物（OAD20）：5' GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3'，反向引物（R53Erev）：5' GTTCAGTAGATTTTTGGAATtcTCTAATTTCTCTCAAG 3'。第二片段使用的引物如下：正向引物（R53Efor）：5' CTTGAGAGAAATTAGAgaATTCC...

介绍了一种在Saccharomyces cerevisiae基因组原位对组蛋白基因进行突变的策略。

我们描述了一种基于PCR和同源重组的系统，用于在芽殖酵母细胞的组蛋白基因中产生靶向突变。所获得的……

本实验的总体目标是在酿酒酵母细胞的内源染色体位点上对组蛋白基因引入特定突变。该方法可用于研究特定组蛋白残基在多种以染色质为底物的生物学过程中的作用，例如DNA转录及各种组合效应。该技术的主要优势在于，尽管在酵母中每种组蛋白由两个高度同源的非等位基因编码，仍可特异性地靶向特定的组蛋白基因进行诱变。 在构建一个目标组蛋白基因被敲除并由URA3替代的酵母菌株后，通过为该基因的前半部分设置以下反应，扩增出目标组蛋白基因的两个部分重叠的PCR片段。对于基因的后半部分，使用不同的引物设置类似的PCR反应。将反应体系放入热循环仪，并设置以下程序。在TBE缓冲液中，将20至50微升的PCR反应产物在0.9%低熔点琼脂糖凝胶上电泳。然后使用干净的剃刀片将PCR产物从凝胶中切下，并将每一片段转移至1.5毫升离心管中。将琼脂糖片段保存在20摄氏度，待用。为准备用于PCR反应的模板DNA以扩增全长PCR产物，将琼脂糖切块置于65摄氏度的金属浴中加热5分钟使其融化。每1至2分钟涡旋振荡试管一次，以促进融化。从每个样品中转移等量融化的琼脂糖至同一个微量离心管中，并通过涡旋振荡充分混匀。将此作为融合 PCR 的模板，并在 20 摄氏度下保存直至使用。为扩增大量全长 PCR 产物，设置六组 PCR 反应，每组包含以下试剂。将试管放入热循环仪中，并按以下条件运行反应。通过沉淀浓缩PCR产物，并根据文本方案将其与骨架质粒共转化。为筛选因PCR产物整合导致的URA3基因丢失，通过移除平板盖并将含有菌落的平板压在无菌绒布上，将1至20号平板的菌落进行影印培养；再将绒布上的菌体转移至5-FOA平板上。将平板在 30 摄氏度下孵育两天，然后仔细检查平板上的菌落生长情况。根据文本方案，在 YPD 平板上划线并孵育候选菌落后，将每块 YPD 纯化平板分别复制到一块新的 YPD 平板、一块缺乏尿嘧啶的 dropout 平板（以检测 URA3 基因是否丢失），以及第二块 dropout 平板（用于监测骨架质粒的存在与否）。孵育结束后，从每个候选样本中鉴定出在 YPD 平板上生长但在两种缺陷型培养基平板上均不生长的菌落。将这些菌落重新划线接种至新的 YPD 平板上。随后按照文本实验方案，通过 PCR 验证突变等位基因的正确整合。该图显示了通过PCR扩增产生两个部分重叠的HHT2片段的结果，这两个片段含有预期的突变，最终导致密码子由AGA变为GAA，从而产生R53E突变。图中展示的是融合PCR反应生成全长PCR产物的结果。全长PCR产物包含195和220个碱基对的区域，分别与HHT2开放阅读框上游和下游区域同源，以驱动同源重组。在此转化示例中，将全长PCR产物与带有HIS-3标记的质粒共转化，并在缺乏组氨酸的平板上筛选转化子。随后对HIS阳性菌落进行5-FOA抗性筛选。图中展示了可能为预期整合事件的候选克隆，以及不太可能代表预期整合事件的样本示例。共鉴定出12个候选样本，并通过PCR分析检测URA3基因是否被突变的PCR产物替换。其中4个候选样本显示PCR产物在正确位置整合。其中一个候选样本的检测结果如第四泳道所示。由于AG2GA突变会产生一个新的EcoR1限制性酶切位点，因此对其中一个成功整合的PCR样本进行EcoR1消化，以证明突变序列确实已整合到基因组中。当所有试剂齐备后，可在15至20天的时间范围内获得携带目标组蛋白突变的酵母细胞。一旦在宿主菌株中成功构建目标突变，便可通过适当的遗传杂交获得仅由突变基因表达目标组蛋白的细胞。在进行该实验操作时，需要注意PCR反应的参数可能需要根据实验中所用特异性引物的性质以及预期的PCR产物大小进行调整。尽管该方法特别适用于组蛋白基因的定点突变，因为它能够在存在另一个高度同源但非等位基因的情况下特异性地靶向目标组蛋白基因，但该方法也可用于在基因组其他位点引入突变。观看本视频后，您应能够充分掌握如何结合PCR技术和酵母遗传学方法，在酿酒酵母中实现NC2组蛋白基因的靶向突变。请务必注意，暴露于紫外光下可能极为危险，使用紫外透射仪时应始终佩戴防护眼镜、防护罩和防护服。此外，在实验的大部分步骤中都应佩戴手套、护目镜和防护服。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

目标<em&gt;原位</em&gt;组蛋白突变的基因在芽殖酵母

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