一种可定制的细胞迁移测量装置

本实验的总体目标是提供一种简单的方法来研究趋化性和趋排斥性因子对细胞迁移的影响。该方法有助于解答细胞相互作用领域的关键问题，例如不同生长因子对伤口愈合的影响。该技术的主要优势在于可根据不同应用灵活定制，且适用于各个技术水平的研究人员，操作简便。

演示该实验操作的将是我实验室的本科生 Aniqa Chowdhury 和研究生 Tyler Harvey。首先，创建一个具有理想微通道形状的 CAD 文件。调整通道的宽度和长度，以获得所需的梯度。

此处，2.254 厘米的正方形通过一条宽 0.127 厘米的通道连接。接下来，取一块所需厚度的丙烯酸材料，以形成微通道的合适深度。约 1/16 英寸厚的丙烯酸板最为理想，因为过厚的板材难以切割，而过薄的板材在加工过程中容易断裂或变形。

将CAD文件导入激光切割设备，将亚克力材料放置在切割平台上，然后根据制造商的说明切割出腔室。将新切割的哑铃形状亚克力部件放入一个小培养皿中，并在其使用前盖好保存。

在称量舟中加入十份弹性体基质和一份固化剂，使用微量移液器搅拌五分钟。将混合物转移至真空室中，抽真空30分钟，以去除PDMS中的任何滞留气泡。完成后，关闭真空泵并取出称量舟。

将脱气后的PDMS倒入小培养皿中一个哑铃形的丙烯酸切片上方，确保PDMS完全覆盖该插入物。在室温下让PDMS固化至少18小时，然后用手术刀小心地沿丙烯酸部件周围切割PDMS，并取出插入物。

在标准的细胞培养柜中，将微通道腔室放入培养皿内，有结构的一面朝上，并用70%乙醇完全覆盖。然后关闭通风橱，打开紫外灯，将腔室暴露于紫外光下照射一至两小时。

暴露后，打开层流罩，等待15分钟，使层流罩内的气流重新稳定。随后，移除70%乙醇，并用无菌PBS清洗小室两次，每次清洗使用1毫升PBS。

最后一次洗涤后，移除 PBS，并将培养室在室温下敞盖过夜干燥。收集待检测的细胞类型，将 100 微升细胞悬液加入 400 微升 0.4% 台盼蓝溶液中，轻轻混匀。取 100 微升该混合液，轻轻填充血细胞计数板盖玻片下的两个计数室。

使用配备10倍物镜的显微镜对血细胞计数板上的网格进行对焦。然后使用手动计数器对血细胞计数板上全部四组16个方格内的活细胞进行计数。将细胞总数除以4，再将所得数值乘以50,000，得到每毫升细胞悬液中的细胞数量。

根据此计算结果，向每个腔室中的一个孔内加入 2500 个细胞和 100 微升培养基。将细胞置于腔室中静置 60 分钟，然后添加额外的培养基。首先，将琼脂糖加入水中，并在微波炉中加热溶液一分钟，或加热至琼脂糖完全溶解且溶液澄清为止。

将溶液静置冷却15至30秒，然后倒入培养皿中。为去除气泡，将培养皿放入真空室中，在真空条件下静置30分钟，使琼脂糖凝固。凝固后，用解剖刀从培养皿中切取一块2毫米×2毫米×2毫米的琼脂糖立方体。

将琼脂糖块完全浸入含有所需浓度趋化因子的溶液中，在室温下孵育过夜。随后将含有趋化因子的琼脂糖块置于微通道腔室的远端。可使用标记物，如聚苯乙烯微珠或腔室中的微小缺陷。

为了确定细胞的相对起始位置，使用成像软件每小时拍摄一次移动细胞前沿的延时图像，持续12小时。此处展示的图像序列记录了细胞前沿在通道中移动的过程，该移动是由通道另一端放置的胎牛血清浓度梯度所诱导的。

迁移距离是根据生长前沿与器件中微观缺陷之间的距离来测量的。根据这些测量结果，细胞前沿的平均速度为每小时13.4微米。掌握该技术后，可在4小时内完成实验，另需18小时等待PDMS固化，以及额外12小时用于延时成像。

该技术开发完成后，为不同技能水平的研究人员（包括实验室经验较少的本科生）提供了便利，使其能够轻松地在体外探索伤口愈合和细胞迁移过程。在进行该操作时，需特别注意小心地将丙烯酸插件从PDMS模具中取出，以确保微通道小室的成功制备。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备一种简单的微通道小室，用于研究细胞在不同化学信号刺激下的迁移行为。

通过该实验流程，还可研究其他影响因素，例如多种可溶性化学梯度、基质、流体剪切力以及电场，以探讨它们对细胞迁移的影响。请注意，使用激光切割仪具有极高的危险性，在操作过程中必须采取适当的预防措施，例如接受正规培训并佩戴个人防护装备。