Name: 多能高效分化干细胞NKX6-1 +胰腺祖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解四阶段分化方案，将人多能干细胞高效诱导为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。该方法可建立人类胰腺发育体外模型，为糖尿病治疗及药物筛选提供重要平台。

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本研究由多伦多综合医院与西部医院基金会及班廷基金提供资助 &amp;#38; 最佳糖尿病中心-大学健康网络研究生奖

1. 溶液与培养基的制备
注意：所有细胞培养用培养基均需在无菌环境中配制。培养基需现配现用。试剂详情见材料表。
<ol>
	<li>分化培养基
	<ol>
		<li>制备第0天分化培养基：含1%谷氨酰胺、2 µM CHIR 99021、100 ng/ml Activin A 和 104 M MTG 的RPMI培养基。</li>
		<li>制备第1–2天分化培养基：含1%谷氨酰胺、100 ng/ml Activin A、104 M MTG、5 ng/ml bFGF 和 50 µg/ml 抗坏血酸的RPMI培养基。</li>
		<li>制备第3–5天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、104 M MTG、0.75 µM Dorsomorphin 和 50 ng/ml FGF10 的RPMI培养基。</li>
		<li>制备第6–7天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、50 µg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml FGF10、0.25 µM SANT-1、2 µM 视黄酸 和 50 ng/ml NOGGIN 的DMEM培养基。 
		注意：视黄酸应最后加入培养基中，且培养基需避光保存，以防止氧化降解15。</li>
		<li>制备第8–12天分化培养基：含1%谷氨酰胺、1% B27、50 µg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml NOGGIN、100 ng/ml hEGF 和 10 mM 烟酰胺的DMEM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备FACS缓冲液：含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），不含钙和镁离子。</li>
</ol>
2. 人类胚胎干细胞分化
注意：人胚胎干细胞（hESC）在经照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，使用添加 bFGF 的 KOSR 培养基进行解冻、传代和扩增16。当细胞融合度达到 80–95% 时，hESC 即可进行分化。此时，细胞集落应较大，边界清晰，并呈现“圆顶样”结构（图 1A）。所有细胞培养均在经组织培养处理、并以 0.1% 明胶包被的平底培养板中进行。通常，细胞分别在 6 孔或 12 孔板中培养，培养基体积分别为 2 ml 或 1 ml。
<ol>
	<li>第0天，通过将基于KOSR的培养基更换为第0天分化培养基，开始诱导分化。</li>
	<li>第1天和第2天，在吸除培养基前，轻轻振荡培养板以去除单层细胞中的死细胞，随后更换为第1–2天分化培养基。</li>
	<li>第3天，收集细胞进行流式细胞术检测。若细胞中CXCR4+/CD117+表达比例超过90%，则进入步骤2.4。</li>
	<li>第3天和第5天，在吸除培养基前，轻轻振荡培养板以去除单层细胞中的死细胞，随后更换为第3–5天分化培养基。</li>
	<li>第6天和第7天，更换为第6–7天分化培养基。</li>
	<li>第8、10和12天，更换为第8–12天分化培养基。</li>
	<li>第13天，收集细胞进行流式细胞术检测，以确定PDX1和NKX6-1的表达情况。</li>
</ol>
3. 用于流式细胞术分析的细胞收获
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用1×商品化胰蛋白酶溶液消化细胞，并在37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>去除商品化胰蛋白酶溶液，将单细胞重悬于含30 µl DNase I的1,000 µl FACS缓冲液中。</li>
	<li>使用35 µm尼龙网细胞滤筛过滤细胞，转移至微量离心管中。</li>
	<li>在455 × g离心5分钟。根据需要准备活细胞或固定后染色的细胞。</li>
</ol>
4. 流式细胞术染色
<ol>
	<li>第3天活细胞染色的流式制备
	<ol>
		<li>将细胞重悬于1,000 µl FACS缓冲液中。取200 µl（约1-3 × 105个细胞）加入96孔板的两个孔中（分别用于未染色和染色样本）。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>使用偶联一抗CXCR4:APC和CD117:PE（见材料表）在室温避光孵育30分钟进行染色。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>将样本重悬于100 µl FACS缓冲液中。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>将每个样本重悬，并转移至总体积为300-500 µl的FACS缓冲液中，分别加入1 ml微量离心管或5 ml圆底管中。</li>
		<li>在流式细胞仪上检测样本17。若无法立即检测，应于4 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第13天固定后染色的流式制备
	<ol>
		<li>将细胞沉淀重悬于商品化固定/通透溶液中，在4 °C孵育24小时。</li>
		<li>以455 × g离心5分钟。重悬于400 µl通透/洗涤溶液中。</li>
		<li>取200 µl样本（约0.5-1 × 106个细胞）加入96孔板的两个孔中（分别用于IgG对照和PDX1/NKX6-1染色）。以931 × g离心2分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于含抗PDX1和抗NKX6-1一抗或同型对照抗体的100 µl通透/洗涤溶液中（见材料表）。在4 °C孵育过夜。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。将样本重悬于100 µl通透/洗涤溶液中。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>将样本重悬于含二抗的100 µl通透/洗涤溶液中，在室温避光孵育1小时。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>将样本重悬于100 µl通透/洗涤溶液中。</li>
		<li>以931 × g离心2分钟。通过倒置平板去除上清液。</li>
		<li>重复步骤4.2.9和4.2.10。</li>
		<li>将每个样本重悬，并转移至总体积为300-500 µl的FACS缓冲液中，分别加入1 ml微量离心管或5 ml圆底管中。</li>
		<li>在流式细胞仪上检测样本17。若无法立即检测，应于4 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功生成NKX6-1+ 由人多能干细胞分化而来的胰腺前体细胞 体外 依赖高质量的hPSC培养以及通过精确调控在胰腺发育关键发育阶段起决定性作用的特定信号通路来实现定向分化。尽管本方案如先前所示，可用于在多种hPSC细胞系中诱导NKX6-1的强效表达3，为确保高效生成NKX6-1，需注意以下事项。所有细胞培养和培养基配制操作均应在无菌环境中进行，以防止污染。人胚胎干细胞（hESC）集落必须达到适当的汇合度，且在启动分化第0天前不得出现自发分化。若起始使用的hESC状态不理想，可能导致定型内胚层及其后续发育阶段的诱导效率低下。因此，必须在分化第3天通过流式细胞术对细胞进行分析，以确认定型内胚层的高效诱导。CXCR4双阳性细胞的比例+CD117+ 第3天的细胞存活率应高于90%，以确保有效的胰腺发育3如果同时表达CXCR4和CD117的细胞比例低于90%，则向胰腺前体细胞的有效诱导可能会受到影响（结果未显示）。此外，与先前发表的研究不同，使用第1阶段培养基喂养细胞前...

糖尿病的发病率正在上升，根据加拿大糖尿病协会的数据，预计加拿大有超过1100万人患有糖尿病或处于糖尿病前期，其中5%至10%为1型糖尿病（T1D）11型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，由位于朗格汉斯胰岛内的胰岛素分泌β细胞遭到破坏所致。目前，患有T1D的个体需要依赖外源性胰岛素来源2尽管胰岛素治疗已取得进展，但1型糖尿病（T1D）患者仍难以维持血糖水平稳定，持续经历低血糖和高血糖。一种有望恢复T1D患者正常血糖水平的治疗方法是利用人类胚胎干细胞（hESCs），该细胞可被用于生成无限量的胰岛素分泌β细胞 体内 和 体外3,4,5,6,7将hESCs分化为类β细胞可能有助于糖尿病的研究 体外，从而有助于发现2型糖尿病的新型治疗靶点，并为1型糖尿病患者的移植治疗提供细胞来源。
从人胚胎干细胞生成胰岛素产生细胞的最成功尝试 体外 旨在重现胰腺发育过程中发生的胚胎事件4,5这涉及调控不同的信号通路，以精确模拟胰腺发育的关键阶段。胰腺发育始于定型内胚层的诱导，该阶段以 CXCR4 和 CD117（c-KIT）的表达为特征。8,9精确调控定型内胚层的组织结构对于原肠管的形成至关重要，随后原肠管经历从头端到尾端以及腹侧到背侧的模式形成。背侧和腹侧胰腺芽从表达胰腺和十二指肠同源框基因（pancreatic and duodenal homeobox gene）的后部前肠区域发育而来。Pdx1），这对胰腺发育是必需的10背侧和腹侧芽融合形成胰腺，随后胰腺经历广泛的上皮重塑和扩张11向内分泌和外分泌谱系的分化伴随着多能祖细胞（MPCs）的产生，这些细胞表达多种转录因子，其中包括 Pdx1，Nkx6.1 和 Ptf1a12,13. 将分化为内分泌细胞和导管细胞的MPCs继续表达 Nkx6-1 同时减少 Ptf1a 表达。与此相反，外分泌谱系细胞将失去表达 Nkx6-1 并维持 Ptf1a 表达12.
转录因子 Nkx6-1 在胰腺发育中起关键作用，特别是在内分泌前体细胞向β细胞分化的过程中。如前所述，删除 Nkx6-1 导致胰腺发育过程中β细胞形成受损14因此，生成能产生胰岛素的β细胞 体外 和 体内 需要高效的诱导作用 Nkx6-1
我们近期开发了一种高效方案，可从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成PDX1+/NKX6-1+胰腺前体细胞。这些由hPSCs衍生的胰腺前体细胞在移植至免疫缺陷小鼠体内后可进一步发育为成熟的β细胞3。该分化方案可分为四个阶段，分别对应于：1）定型内胚层诱导，2）后部前肠模式形成，3）胰腺特化，以及4）NKX6-1诱导。本文将详细描述定向分化的每一步操作。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;培养基与细胞因子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-硫代甘油（MTG）</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC/CF&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化缓冲液</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash 缓冲液，1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R&amp;D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x），含酚红</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流式细胞术抗体（工作稀释度）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE（1:100）</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC（1:50）</td><td>BD&amp;nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 647 标记（1:400）</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记（1:400）&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>同型对照小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&amp;nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>同型对照山羊 IgG</td><td>R&amp;D&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1（1:2,000）</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1（1:100）</td><td>R&amp;D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

高效地将多能干细胞分化为nkx6-1+胰腺前体细胞

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

多能干细胞具有自我更新和向多个谱系分化的潜能，因此成为生成胰腺前体细胞的理想来源，可用于糖尿病的研究及未来的治疗。本文介绍一种四阶段分化方案，旨在由人胚胎干细胞（hESCs）诱导生成胰腺前体细胞。该方案适用于多种人多能干细胞（hPSC）系。该方法通过模拟胰腺发育过程中的关键阶段，逐步将hESCs分化为胰腺前体细胞。首先，通过在含Activin A、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和CHIR990210的培养体系中培养细胞，诱导其向定型内胚层分化。随后，在成纤维细胞生长因子10（FGF10）和Dorsomorphin的作用下进一步分化并进行模式形成，获得类似于后部前肠的细胞。接着，加入视黄酸、NOGGIN、SANT-1和FGF10，将后部前肠细胞分化为具有胰腺内胚层特征的细胞。最后，联合使用表皮生长因子（EGF）、烟酰胺和NOGGIN，可高效生成PDX1阳性细胞。+NKX6-1+ 细胞。通过流式细胞术检测胰腺发育关键阶段特定标志物的表达。PDX1+NKX6-1+ 第4阶段结束时的胰腺前体细胞在移植到免疫缺陷小鼠体内后能够生成成熟的β细胞，并可进一步分化为产生胰岛素的细胞 体外因此，高效生成PDX1+NKX6-1+ 胰腺前体细胞，如本方案所示，具有重要意义，因为它为研究人类胰腺发育提供了平台 体外 并提供了具有分化为β细胞潜能的细胞来源，这些细胞未来可能用于糖尿病的治疗。

高效生成胰腺前体细胞依赖于未分化细胞的适当生长与维持，随后在分化方案中精确添加特定的信号分子，如图1A示意图所示。第0天时，未分化细胞应达到80-95%的融合度，且克隆应具有清晰的边界（图1A）。在第1阶段期间，由于此阶段细胞死亡较为常见，培养基可能呈现浑浊状态。至第1阶段结束时，细胞应共表达定型内胚层标志物CXCR4和CD117，且比例应超过90%（图1B）。
在四阶段分化方案过程中，随着细胞的分化，其形态从细长、椭圆形（第1和第2阶段观察到）逐渐转变为更小、更圆的细胞（第3和第4阶段可见）（图1A）。在第4阶段结束时，通过流式细胞术确认PDX1+/NKX6-1+的高效诱导。如图1C所示的代表性结果中，第13天NKX6-1+</s...

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外 该方案可应用于多种人类多能干细胞系。

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

多能干细胞具有自我更新和分化为多种谱系的能力，使其成为生成……的理想来源

本实验的总体目标是通过体外模拟胰腺发育的四个关键阶段，高效地将人多能干细胞分化为表达NKX6.1的胰腺前体细胞。通过引导人多能干细胞经历胰腺发育的四个关键阶段，该方案为在体外研究人类胰腺发育提供了模型。与现有方案相比，该技术的主要优势在于，我们能够利用多种人多能干细胞系，获得高比例的NKX6.1阳性胰腺前体细胞。鉴于胰腺前体细胞具有生成能产生胰岛素的类似β细胞的潜力，该技术将为我们提供开发用于糖尿病治疗、药物发现及疾病建模的细胞的机会。在第0天，通过将KnockOut血清替代培养基更换为第0天分化培养基，开始诱导分化。在第1天和第2天，轻轻振荡培养板，以从单层细胞中去除任何死亡细胞，然后吸除培养基。随后，更换为第1至第2天的分化培养基。第3天，收集细胞进行流式细胞术检测。若细胞中CXCR4和CD117的表达超过90%，则表明分化效率已达到预期。然后轻轻振荡培养板，以在吸除前去除单层细胞中的死亡细胞，并更换为第3至第5天的分化培养基。必须确保在第3天通过流式细胞术检测到定型内胚层的高效诱导。如果同时表达CXCR4和CD117的细胞比例低于90%，则向胰腺前体细胞的分化可能会受到影响。在第6天和第7天，更换为第6至第7天分化培养基。在第8、10和12天，更换为第8至第12天分化培养基。随后在第13天，收集细胞进行流式细胞术分析，以检测PDX1和NKX6.1的表达。为了获取细胞进行流式细胞术分析，根据制造商说明书使用商用胰蛋白酶溶液消化细胞，并在37摄氏度下孵育3分钟。3分钟后，去除胰蛋白酶溶液，将单细胞重新悬浮于含有30微升DNA One的1,000微升fax缓冲液中。随后使用35微米尼龙网细胞滤器过滤细胞，并将其转移至微量离心管中。在对细胞进行活体或固定染色前，以455 × g离心5分钟。随后将细胞重悬于1,000 µL的FACS缓冲液中。取200 µL分别加入96孔板的两个孔中，用于未染色和染色样本。随后，将培养板在931 × g下离心2分钟，然后通过倒置培养板去除上清液，在室温下避光条件下，用100微升终体积的偶联一抗对细胞染色30分钟。接着，再次在931 × g下离心2分钟，2分钟后通过倒置培养板去除上清液。随后，将样品重悬于100微升Fax缓冲液中。然后以931 × g离心96孔板2分钟，通过倒置平板去除上清液。接着将样品重悬于300至500 µL的fax缓冲液中，转移至1 mL微量离心管或5 mL圆底试管中，并在流式细胞仪上检测样品。如果样品无法立即检测，应将其在4 °C条件下避光保存。在此步骤中，将细胞沉淀重悬于商用固定和透化溶液中，在4 °C条件下孵育24小时。24小时后，以455 ×g离心5分钟，然后将沉淀重悬于400 µL的商用透化洗涤液中。接下来，将200微升样品转移至96孔板的两个孔中，用于IGG对照以及PDX1和NKX6.1染色，以931 × g离心2分钟。然后将细胞沉淀重悬于100微升含有抗PDX1和抗NKX6.1一抗或同型对照抗体的商用透化洗涤液中，在4°C下孵育过夜。第二天，将培养板在931 × g下离心2分钟，通过倒置培养板去除上清液，并将样品重悬于100 µL商用透化洗涤液中。接着，将培养板在931 × g下离心2分钟，再次通过倒置培养板去除上清液。然后在室温下避光孵育一小时，用含有二抗的100微升破膜洗涤液重悬样本。孵育一小时后，以931 × g离心96孔板两分钟，随后通过倒置平板去除上清液；接着用100微升商品化破膜洗涤液重悬样本，再次以931 × g离心两分钟，并倒置平板去除上清液。然后，再次用100微升商品化破膜洗涤液重悬样本，以931 × g离心两分钟，随后去除上清液。接下来，将样品重悬于 300 至 500 微升的 fax 缓冲液中，并转移至单独的 1 毫升离心管或 5 毫升圆底管中，用于流式细胞术检测。此处展示的是由人胚胎干细胞诱导胰腺前体细胞的示意图，标明了分化天数、发育阶段、基础培养基以及各阶段添加的细胞因子。以下是胰腺分化关键阶段的相差显微图像。H1细胞按照所示的四阶段分化方案进行分化。第0天为未分化的人胚胎干细胞，第一阶段为定型内胚层，第二阶段为后部前肠，第三阶段为胰腺内胚层，第四阶段为NKX6.1阳性内胚层胰腺前体细胞。该图显示了第3天CXCR4 PE和CD117 APC抗体染色的代表性流式细胞术图谱。这是未染色的样本，这是染色的样本。该图显示了第13天代表性流式细胞术图，展示处于第四阶段衍生的胰腺前体细胞表达NKX61和PDX1的情况。这是IgG对照，这是染色样本。掌握后，该技术可在13天内完成，但具体时间可能因所用细胞系的不同而有所差异。在进行该操作时，由于试剂存在批次间差异，必须对所有试剂进行测试。按照本方案操作后，NKX6.1阳性的胰腺前体细胞可利用其他已发表的方案进一步分化为能够产生胰岛素的类似β细胞。这为体外研究β细胞的成熟与发育提供了平台。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过引导人多能干细胞经历四个关键发育阶段，高效地将其分化为胰腺前体细胞。

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发育生物学

多能高效分化干细胞NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt;胰腺祖

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非转基因与转基因人类多能干细胞向神经前体细胞的分化

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。...

一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

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小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

在本实验方案中，我们描述了一种稳定且高效的分化策略，可用于由人类多能干细胞生成节后交感神经元。该模型将为多种自主神经系统疾病的研究所需的神经元提供来源。...

在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

了解四阶段分化方案，将人多能干细胞高效诱导为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。该方法可建立人类胰腺发育体外模型，为糖尿病治疗及药物筛选提供重要平台。

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1⁺胰腺前体细胞

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