细胞内染色和流式细胞仪识别鼠主动脉，肾脏和淋巴结内淋巴细胞亚群的高血压模型

本文提供了详细的方法来识别和量化细胞内染色鼠肾，主动脉和淋巴结中存在功能性T淋巴细胞亚群和流式细胞仪。被选中的血管紧张素II诱导高血压模型来解释，一步一步的程序和流式细胞仪的基本原则和细胞内染色。

该方案的总体目标是从小鼠主动脉、肾脏和淋巴结获得单细胞悬液，以量化和表征血管紧张素 II 诱导的高血压模型中的免疫细胞。这种方法可以帮助回答心血管疾病领域的关键问题，例如哪两个淋巴细胞亚群促进高血压的发展。该技术的主要优点是它允许在单细胞水平上识别和定量实体器官中的免疫细胞亚群。

在开始程序之前，用 70% 乙醇对小鼠胸部进行消毒。然后用剪刀小心地打开皮肤和胸壁，露出心脏。要灌注脉管系统，请在右心房做一个小切口，并以每秒约 1 毫升的速度将至少 10 毫升的冷 PBS 稳定注射到左心室心尖。

当所有器官都变白后，使用精细解剖钳去除腹主动脉引流淋巴结，注意不要使包膜破裂。在解剖显微镜下，用细剪刀去除两个肾脏。然后用细弯曲的剪刀解剖整个胸主动脉和腹主动脉，从心脏开始，到髂分叉处结束，注意保持周围的血管周围脂肪附着在主动脉上。

接下来，将肾脏转移到含有 10 毫升肾脏消化液的解离管中，并根据制造商的说明使用半自动解离器机械解聚肾脏组织。解离结束时，将样品在 37 摄氏度下连续旋转孵育。20 分钟后，立即用添加 5% FBS 的冷 RPMI 1640 培养基停止酶消化，并通过 40 微米过滤器将所得组织浆液过滤到 50 毫升锥形管中。

使用 1 毫升注射器的柱塞梳理分离剩余的组织。然后通过离心沉淀细胞。将沉淀重悬于 3 mL 36% 密度梯度培养基中，并将细胞转移到 15 mL 锥形管中。

在细胞下轻轻地将 3 毫升 72% 密度梯度培养基分层，注意不要干扰各层，并通过离心分离细胞。免疫细胞将位于界面处。去除最上面含有细胞碎片的淡黄色层，然后使用冷 PBS 将体积增加到 15 毫升。

摇匀以分解梯度，然后通过离心洗涤细胞。为了分离主动脉免疫细胞，将主动脉转移到一个两毫升的管中，管中含有一毫升新鲜制备的冰主动脉消化液，然后用细剪刀将整个主动脉切成细块。然后将片段在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，连续旋转。

在消化结束时，以消化溶液体积的 5 倍加入补充有 5% FBS 的冷 RPMI，并通过 40 微米过滤器过滤所得组织浆液。然后通过离心收集单细胞悬液，并将沉淀重悬于含 FBS 的新鲜 RPMI 中。要从主动脉引流淋巴结生成单细胞悬液，请将淋巴结转移到 60 x 15 毫米组织培养皿中的 40 微米过滤器上，并使用 1 毫升注射器柱塞解聚组织。

然后用 2 毫升 RPMI 加 FBS 冲洗过滤器，并将释放的细胞转移到 15 毫升锥形管中。为了刺激细胞，首先在细胞培养基中将每个细胞悬液的浓度调整为每毫升 10 至 6 个细胞的 1 倍。然后，对于每 1 mL 培养基，向每组细胞中加入 2 μL 细胞活化混合物。

接下来，将每孔 1 到 2 乘以 10 到第六个主动脉细胞或肾细胞转移到 12 孔板中，将每孔 1 到 2 乘以 10 到第六个淋巴结细胞转移到 24 孔板中。将板放入 37 摄氏度加湿的二氧化碳培养箱中 3 小时。然后将细胞转移到适当的相应聚苯乙烯 FACS 管中，并通过离心沉淀细胞。

在相同的离心条件下用新鲜的 FACS 缓冲液洗涤细胞两次后，用 FC 封闭和非特异性表面结合封闭并在 PBS 中洗涤细胞。将沉淀重悬于 1 毫升新鲜 PBS 中，并在 4 摄氏度下用 1 微升不可透过细胞的胺反应性活力染料对细胞进行 15 分钟的染色，避光。孵育结束时，在 1 至 2 mL FACS 缓冲液中再洗涤细胞两次，并将沉淀重悬于 100 μL 适当的细胞表面染色抗体混合物中。

在 4 摄氏度下避光 30 分钟后，在 2 毫升新鲜的 FACS 缓冲液中再洗涤细胞两次，并根据制造商的说明使用固定和透化试剂盒固定和透化细胞。接下来，用感兴趣的细胞内抗体混合物标记细胞，并再次在 FACS 缓冲液中洗涤细胞。对于刺激的细胞内细胞因子产生的流式细胞术分析，首先运行未染色和单染色的对照管以调整光谱重叠，然后对面板中的每个荧光团进行荧光减一对照。

设置基本荧光分析参数后，使用前向散射区域图设置白细胞群检测的主要门，然后根据死细胞缺乏活力染色表达进行门控以排除死细胞。根据前向散射高度和门绘制前向散射区域以排除双峰。然后可以通过它们的 CD45 表达来识别白细胞。

为了确定小鼠肾脏或主动脉是否存在产生 IL-17A 或 IL-17F 的 T 细胞，可以制备单细胞悬液，如刚才所示，用于每种细胞因子的荧光减一对照分析。正如预期的那样，在荧光减一对照中，很少有细胞对 IL-17A 或 IL-17F 呈阳性反应，从而可以准确区分阳性和阴性信号，以正确调整实验样品中 IL-17A 或 IL-17F 阳性细胞的鉴定门。从输注载体或血管紧张素 II 的野生型小鼠的肾脏和主动脉中分离的 T 细胞的代表性细胞内染色显示，两个组织内存在表达 IL-17A 或 IL-17F 的 T 细胞亚群。

此外，来自主动脉引流淋巴结的 T 细胞的细胞内染色表明，CD8 阳性 T 细胞在血管紧张素 II 刺激后表达干扰素 γ 和 T-bet。一旦掌握，这项技术可以在 6 到 9 小时内完成，具体取决于正在处理的组织数量。在执行此程序时，必须快速有效地工作以最大程度地减少细胞死亡。

观看本视频后，您应该对如何从小鼠肾脏、主动脉和淋巴结生成单细胞悬液以及表征和定量来自这些器官的免疫细胞亚群有很好的了解。该技术使心血管和肾脏生理学能够探索可能导致高血压和其他促炎性疾病的免疫细胞群的变化。