通过细胞内染色和流式细胞术鉴定高血压模型小鼠主动脉、肾脏及淋巴结中的淋巴细胞亚群

本实验方案的总体目标是从小鼠主动脉、肾脏和淋巴结中获取单细胞悬液，以在血管紧张素II诱导的高血压模型中对免疫细胞进行定量和表征。该方法有助于回答心血管疾病领域中的关键问题，例如哪两个淋巴细胞亚群促进高血压的发生发展。该技术的主要优势在于能够在单细胞水平上识别和定量实体器官中的免疫细胞亚群。

开始操作前，用70%乙醇对小鼠胸部进行消毒。然后使用剪刀小心切开皮肤和胸壁，暴露心脏。为了灌注血管系统，需在右心房做一小切口，并以大约每秒1毫升的速度，向左心室心尖部持续注射至少10毫升的冷PBS。

当所有器官均完成漂白后，使用精细解剖镊小心摘除腹主动脉引流淋巴结，注意避免破坏被膜。在解剖显微镜下，用精细剪刀取出双侧肾脏。随后使用精细弯头剪刀从心脏起始处至髂动脉分叉处，完整剥离胸腹主动脉，注意保持周围附着的血管周围脂肪组织与主动脉相连。

接下来，将肾脏转移至含有10毫升肾脏消化液的消化管中，并根据制造商的说明，使用半自动组织解离仪对肾脏组织进行机械解离。解离结束后，将样品在37摄氏度下持续旋转孵育。20分钟后，立即加入含5%FBS的冷RPMI 1640培养基终止酶消化反应，并将所得组织悬液通过40微米细胞筛过滤至50毫升锥形管中。

使用1毫升注射器的推杆将剩余组织分离。然后通过离心收集细胞沉淀。将沉淀重悬于3毫升36%密度梯度介质中，并将细胞转移至15毫升锥形管中。

在细胞下方轻轻加入3 mL 72%密度梯度介质，注意不要扰动各层，通过离心分离细胞。免疫细胞将位于界面处。移除最上层含有细胞碎片的淡黄色层，然后用冷的PBS将体积补至15 mL。

充分振荡以破坏梯度，然后通过离心洗涤细胞。为分离主动脉免疫细胞，将主动脉转移至一个含有1毫升冰上预冷的新鲜主动脉消化液的2毫升离心管中，并用精细剪刀将整个主动脉剪成细小碎片。随后将组织碎片在37°C下孵育30分钟，并持续旋转。

消化结束后，加入体积为消化液体积五倍的含5%FBS的冷RPMI培养基，将所得组织悬液通过40微米细胞筛过滤。然后通过离心收集单细胞悬液，并将沉淀重悬于含FBS的新鲜RPMI培养基中。为从主动脉引流淋巴结制备单细胞悬液，将淋巴结转移至60 mm × 15 mm组织培养皿中的40微米细胞筛上，使用1毫升注射器活塞碾磨以解离组织。

然后用两毫升含FBS的RPMI冲洗滤网，将洗脱的细胞转移至15毫升锥形管中。为刺激细胞，首先将每种细胞悬液用细胞培养基调整至浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。然后，每毫升培养基向每组细胞中加入2微升细胞激活试剂盒溶液。

接下来，将每孔 1×10⁶ 至 2×10⁶ 个主动脉或肾脏细胞接种至 12 孔板中，将每孔 1×10⁶ 至 2×10⁶ 个淋巴结细胞接种至 24 孔板中。将培养板置于 37°C、加湿的含二氧化碳培养箱中孵育 3 小时。随后将细胞转移至相应的聚苯乙烯 FACS 管中，并通过离心收集细胞沉淀。

在相同的离心条件下，用新鲜的FACS缓冲液洗涤细胞两次后，使用FC阻断剂封闭非特异性表面结合，并用PBS洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升新鲜PBS中，加入1微升细胞膜不渗透性胺反应性活力染料，在4摄氏度避光孵育15分钟。孵育结束后，再用1至2毫升FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞沉淀重悬于100微升适当的细胞表面染色抗体混合液中。

在4°C避光条件下孵育30分钟后，用2毫升新鲜FACS缓冲液再洗涤细胞两次，然后根据试剂盒说明书使用固定和破膜试剂盒对细胞进行固定和破膜处理。接着，用感兴趣的细胞内抗体混合物标记细胞，并再次用FACS缓冲液洗涤细胞。在进行刺激后细胞内细胞因子产生的流式细胞术分析时，首先运行未染色和单染对照管以校正光谱重叠，随后对检测面板中的每种荧光染料分别运行荧光减一（fluorescence-minus-one）对照。

在设定基本的荧光分析参数后，使用前向散射光面积与侧向散射光面积的散点图对白细胞群体进行初步设门，随后根据死细胞缺乏活率染料表达的特征进行设门以排除死细胞。将前向散射光面积与前向散射光高度作图，并设门排除双联体。随后可通过CD45的表达来鉴定白细胞。

为了检测小鼠肾脏或主动脉中产生 IL-17A 或 IL-17F 的 T 细胞，可制备单细胞悬液，方法如前所述用于每种细胞因子的荧光减一对照分析。正如预期，在荧光减一对照中，极少细胞呈 IL-17A 或 IL-17F 阳性，从而能够准确区分阳性与阴性信号，进而正确调整设门，以鉴定实验样本中 IL-17A 或 IL-17F 阳性的细胞。对来自野生型小鼠肾脏和主动脉的 T 细胞进行代表性胞内染色显示，在接受溶剂或血管紧张素 II 输注的小鼠中，两种组织内均存在表达 IL-17A 或 IL-17F 的 T 细胞亚群。

此外，对主动脉引流淋巴结中T细胞的胞内染色显示，在血管紧张素II刺激后，CD8阳性T细胞表达干扰素γ和T-bet。一旦掌握，该技术可在6至9小时内完成，具体时间取决于所处理组织的数量。在操作过程中，重要的是要快速高效地进行，以尽量减少细胞死亡。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠肾脏、主动脉和淋巴结中制备单细胞悬液，并对这些器官中的免疫细胞亚群进行表征与定量分析。该技术可帮助心血管与肾脏生理学研究者探索免疫细胞群体的变化，这些变化可能与高血压及其他促炎性疾病的发生发展相关。