利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本方案展示了如何建立iCRISPR平台以在hPSC中快速进行基因组编辑，以及如何将基因组编辑的细胞系结合hPSC定向胰腺分化，用于研究人类胰腺发育与疾病。这些方法有助于回答人类胰腺发育领域中的关键问题，例如正常胰腺发育的遗传调控机制以及糖尿病的分子基础。这些技术的主要优势在于，能够让我们高效地修饰hPSC中感兴趣的基因，并利用这些经修饰的细胞系在体外研究人类胰腺的发育与疾病。

在经截短型人源玻连蛋白包被的培养皿中，以化学成分明确且无饲养层的条件培养人多能干细胞（hPSCs）。电转前一天，在换液时加入10 µM的ROCK抑制剂。电转当天，提前准备好经玻连蛋白包被的10厘米培养皿。

然后从细胞中移除培养基，用不含钙和镁的 PBS 洗涤一次，接着在 37 摄氏度下用 1× 解离试剂处理细胞约三分钟。接下来，在细胞尚未完全脱落前吸除解离试剂，并加入 10.5 毫升完全培养基。通过轻柔吹打形成单细胞悬液，然后转移至离心管中。

使用自动细胞计数仪对500微升细胞悬液进行细胞计数。然后在200 × g条件下离心5分钟，收集hPSC细胞。将细胞重悬于预冷的PBS中，浓度为每毫升12.5 × 10⁶个细胞，并分装为每份800微升。

将质粒加入每个800微升的hPSC悬浮液中，充分混匀。将混合液转移至0.4厘米的电穿孔比色皿中，冰上放置约5分钟。使用电穿孔仪在250伏和500微法的条件下对细胞进行电穿孔。

基因组编辑过程中，使用健康且处于增殖状态的人多能干细胞（hPSCs）至关重要。电穿孔后，将细胞转移至含有5毫升预温完全培养基的15毫升圆锥形离心管中，随后离心收集细胞。用含10微摩尔ROCK抑制剂的10毫升完全培养基重悬细胞，并将每次电穿孔所得的1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶个细胞分别接种至包被有纤连蛋白的培养皿中，以确保至少有一个培养皿中能够获得足够数量的单细胞克隆用于挑取。

将细胞在 37 摄氏度条件下培养。第 2 天，通过加入含有 500 微克/毫升 G418 硫酸盐的培养基开始新霉素筛选。第 6 天，通过加入含有 1 微克/毫升嘌呤霉素二盐酸盐的培养基开始嘌呤霉素筛选。

在第10至12天，hPSC单细胞集落直径将达到1至2毫米。此时，在体视显微镜下挑选12至24个集落。使用200微升移液器吸头将hPSC集落机械解离成小块，并直接将细胞转移至包被有玻连蛋白的24孔板中。

在向导RNA转染前24小时，用每毫升2微克的多西环素处理iCas9人多能干细胞。转染当天，准备经玻连蛋白包被的24孔板，并如前所述使用1倍解离试剂将iCas9细胞解离为单细胞。接着，在200 × g条件下离心5分钟收集细胞，然后将细胞重悬于完全培养基中，终浓度为每毫升0.5 × 10⁶个细胞，并补充2微克/毫升多西环素和10微摩尔ROCK抑制剂。

将重悬的细胞各500微升加入24孔板的各个孔中。针对每种引导RNA，配制以下转染混合物：混合物A，50微升低血清培养基加1微升引导RNA。

将B混合物配制为50微升低血清培养基加3微升转染试剂。将混合物A与B混合，制成100微升的混合液，在室温下孵育5分钟。取50微升该混合液加入24孔板的重复孔细胞中，并充分混匀。

培养四天后，提取基因组DNA，通过PCR扩增引导RNA靶向序列侧翼的目标区域，并利用T7E1酶切分析评估编辑效率。在细胞接种后两天达到80%融合度时，开始对人多能干细胞（hPSC）系进行分化。加入分化第0天培养基，随后按照此处所示配方每日更换培养基。

在第10天，通过免疫荧光染色部分细胞，检测晚期胰腺前体细胞PP2标志物PDX1和NKX6.1的表达。随后进行气液界面培养，首先用10 µM ROCK抑制剂处理PP2细胞4小时。待孵育时间结束后，按前述方法消化细胞。

为在分化过程的气液界面阶段获得最佳细胞存活率，应尽量缩短解离试剂的处理时间。在细胞尚未完全脱落前，吸除解离试剂。随后向培养板中加入10毫升boo-lah培养基，通过轻柔吹打将PP2细胞分散为单细胞悬液。

收集单细胞悬液。计数细胞数量，离心形成细胞沉淀。用S5分化培养基重悬细胞沉淀后，将每点5至10微升的细胞悬液点样于Transwell小室滤膜上。

向每个Transwell小室的底部加入S5培养基，并在更换培养基的条件下继续培养，直至通过免疫荧光染色可检测到胰腺内分泌标志物。该图显示了iCRISPR介导的hPSCs中的非同源末端连接。基因敲除效率很高，无需筛选过程即可轻松实现20%至50%的双等位基因突变。

为了实现高效且精确的基因编辑，可将引导RNA与携带特定序列改变（以红色显示）的单链DNA供体共转染。通常，为了防止在已编辑的等位基因中再次切割，建议在PAM序列中引入一个同义突变，此处以绿色显示。利用该系统，大约可获得10%的克隆，这些克隆携带理想的由同源定向修复介导的基因组修饰，且两个等位基因均无额外的改变。

一旦掌握该技术，建立一个新的可诱导 Cas9 hPSC 细胞系所需时间不到两个月。此后，可在一至两个月内生成多种 hPSC 基因突变克隆细胞系。在获得 hPSC 基因突变细胞系后，通过体外逐步分化这些突变细胞系为胰岛β样细胞，可帮助我们研究这些突变所影响的特定发育阶段，从而更深入地理解相关疾病的发病机制。