Name: 基因组编辑和hPSCs定向分化为胰腺癌发展讯问谱系行列式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习利用iCRISPR平台在人类多能干细胞中进行基因组编辑，并将其定向分化为胰腺祖细胞以研究胰腺发育和糖尿病机制。该方法可高效实现基因敲除并建立疾病模型。

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本工作部分由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK R01DK096239）和纽约州干细胞科学计划（NYSTEM C029156）资助。Z.Z. 获斯隆凯特林研究所干细胞生物学中心的纽约州干细胞科学计划博士后奖学金支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

创建突变品系的时间安排
尽管基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑新方法已成功实现靶向编辑，但若要进行更大规模的基因功能分析，仍需要一种更高效且通用的平台。iCRISPR平台提供了一种快速且高效的方法，可用于对任何目的基因引入突变5,9。首先，基于PCR的gRNA合成方法可在一天内以阵列化形式生成数百个gRNA，无需耗时的克隆步骤。其次，由于iCas9 hPSCs中Cas9的表达由多西环素诱导，gRNA转染步骤所需操作极少，因此可同时开展多个gRNA靶向实验。第三，由于本系统可实现较高的靶向效率，对每个转染的gRNA分析约24–48个克隆即足以建立针对单个基因的多个单等位和双等位突变细胞系，尽管效率因靶位点而异。由于经过培训的操作人员可在一次操作中机械挑取384个克隆（相当于4块96孔板），在解剖显微镜下耗时约4小时，因此可预期一名熟练人员在1–2个月内生成影响12个基因的突变细胞系。在短时间内高效生成hPSC突变体，使得能够系统性分析一系列相互作用、调控发育过程的转录因子和/或信号通路组分9。此外，高效的多重基因靶向也为研究复杂人类性状背后的遗传相互作用提供了可能。
精确基因修饰的构建
从易于获取的体细胞类型中获得患者特异性的诱导多能干细胞（iPSCs），并将其分化为与疾病相关的细胞类型，为功能验证疾病相关突变提供了重要机遇。然而，由于个体间遗传背景存在较大差异，直接比较患者来源与健康供体来源的iPSCs可能难以区分疾病表型与背景遗传效应。因此，有必要通过将致病突变修复为野生型序列，或如先前研究者所提出的，将患者特异性突变引入野生型人多能干细胞（hPSC）背景中，从而构建同基因型对照iPSCs25,26。除了功能缺失型（无效）突变外，目前还可通过将患者特异性序列变异精确引入hPSC的内源性基因位点，更深入地解析疾病机制，包括研究功能增强型（hypermorphic）、功能减弱型（hypomorphic）、获得新功能型（neomorphic）或显性负效应型（dominant-negative）的患者突变。
精确的基因修饰利用同源定向修复（HDR）在存在修复模板的情况下对双链断裂（DSB）进行修复。由于其效率远低于非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA修复，以往通常使用包含患者特异性突变、药物筛选标记盒以及同源臂的供体质粒作为修复模板2。在完成药物筛选并验证患者特异性突变后，通常需要第二步操作以去除药物筛选标记盒。尽管目前最常用的Cre-loxP和FLP-FRT系统会在内源性基因座中留下残余序列，但利用piggyBac转座子可实现药物筛选标记盒的无缝移除27。最近的研究还表明，短单链DNA（ssDNA）模板也可支持工程化DNA核酸酶介导的高效HDR28。与供体质粒相比，ssDNA可直接合成，从而避免了耗时的克隆步骤。本文证明，通过共转染gRNA和ssDNA模板以诱导同源定向修复，iCRISPR可高效引入特定的核苷酸修饰。这对于解析蛋白质功能域中关键核苷酸的作用至关重要，同时也可用于模拟人类疾病相关突变，并有望为治疗性干预提供纠正这些致病突变的手段。由于存在大量易感位点，且每个位点均与多种序列变异相关，遗传学家在构建糖尿病等复杂多基因疾病的模型方面一直面临挑战。由于iCRISPR平台允许快速生成等位基因系列或实现多重基因靶向，因此可促进对多个疾病相关位点的研究，无论是在单个背景下还是在等基因背景下联合分析。
靶向效率与脱靶效应
我们发现，T7E1 和 RFLP 检测结果与通过测序鉴定出的突变株系数量之间具有良好的相关性。这强调了在建立单克隆株系时，平行开展这些检测的重要性。尽管靶向效率可能因基因组位点的不同而有所差异，但在大多数单基因靶向实验中，有 20 - 60% 的克隆在两个等位基因上均发生突变（包括同框突变和移码突变）9。在进行多重基因靶向的情况下，获得了效率为 5-10% 的三重双等位基因突变克隆5。此外，还通过 ssDNA 介导的 HDR 对多个基因进行了精确的遗传修饰，获得纯合敲入克隆的效率范围为 1 - 10%5。在 hPSCs 中使用 CRISPR/Cas 进行研究时，尚未检测到潜在脱靶位点中存在与 gRNA 靶序列不同的突变5,9,12。最近一项研究中进行的全基因组测序也未能在使用 CRISPR/Cas 生成的单克隆 hPSC 株系中发现显著的脱靶突变29。然而，为了尽量减少脱靶效应位点突变可能引入的干扰表型的影响，建议使用至少两个针对同一基因内不同序列的独立 gRNA 生成独立的突变株系。若在使用不同 gRNA 生成的多个株系中观察到相似的表型，则原则上可排除该表型来源于脱靶效应的可能性。
饲养层依赖性与非依赖性培养及靶向
传统的人多能干细胞（hPSC）培养方法依赖于饲养层细胞，并使用含有血清或含动物源成分（如牛血清白蛋白）的血清替代物的培养基进行维持和扩增。饲养层细胞、血清、血清替代物和白蛋白均含有复杂且未明确定义的成分，且存在显著的批间差异。采用无饲养层且化学成分明确的培养条件，可显著减少hPSC维持所需的工作量，更重要的是，提高了分化实验的一致性。目前，极少有研究描述在完全定义的培养条件下对hPSC进行基因组编辑的操作流程30。我们发现，在无饲养层条件下进行gRNA转染和单克隆接种时，CRISPR靶向效率高于依赖饲养层的培养条件。我们认为，这归因于转染后细胞存活率提高，以及单细胞接种形成克隆的效率更高。此外，已有研究显示，饲养层细胞可吸附转染试剂，从而降低转染效率。
将基因组编辑与定向分化相结合
既往的分化方案仅能获得少量胰岛素阳性细胞，其中大多数为多激素细胞，且类似于胎儿内分泌细胞23。近年来的进展已实现将人多能干细胞（hPSCs）分化为更成熟的、具有葡萄糖响应功能的类β细胞16,17,19,20。使用HUES8 hPSCs，我们通常可获得至少75%的定型内胚层细胞、40%的PDX1+NKX6.1+胰腺前体细胞，以及约20%的NKX6.1+CPEP+葡萄糖响应性类β细胞9。当该更稳定的分化方案与iCRISPR基因组编辑系统结合时，有助于分析在胰腺前体细胞及内分泌细胞分化阶段起关键作用的转录因子。这将使未来的研究能够对大量候选致病基因进行功能验证，并深入探究糖尿病发病机制9。
未来应用或发展方向
我们的iCRISPR系统可能有助于实现更复杂的基因组修饰，例如通过HDR介导的基因靶向，利用编码蛋白标签或荧光报告分子的长片段供体DNA模板创建报告等位基因。12我们已证明，由于该系统实现了较高的CRISPR靶向效率，此过程可在hPSCs中进行，无需进一步的药物筛选。12.&#160; 此外，多重基因靶向可用于研究复杂人类疾病背后的遗传相互作用，正如我们最近的研究所示，据我们所知，这是此类工作的首个实例31iCRISPR 还可用于通过在非编码 RNA 或基因调控区域（如启动子和增强子）中创建缺失来研究基因调控机制。为了高效利用 iCRISPR 生成调控突变体，可设计 gRNA 以破坏 DNA 结合蛋白的结合位点，包括但不限于基础转录机制或组织特异性转录因子。此外，还可利用 ssDNA 模板介导的 HDR 来突变特定的蛋白质结合位点。最后，我们预计进一步优化后，iCRISPR 平台可结合高通量遗传分析，用于人多能干细胞（hPSCs）中多能性表型或疾病表型的研究 体外 分化方案。这些由iCRISPR介导的研究可能有助于更快速地鉴定候选的疾病相关基因，并研究其功能相关性。

人类多能干细胞（hPSCs）具有自我更新的能力，并可分化为三个胚胎胚层的所有衍生物。它们为细胞替代疗法和疾病建模提供了宝贵的资源，作为一种独特平台，可在人类发育背景下重现细胞过程。此外，它们也是可用于大规模、高通量分析的实验细胞来源。然而，由于存在两个主要挑战，相关进展受到限制：一是缺乏高效的基因修饰工具，二是在培养皿中难以重现复杂的胚胎发育过程。
基因修饰是研究基因在正常发育和疾病中功能不可或缺的工具。然而，尽管通过同源重组的经典基因靶向方法已被证明是解析小鼠胚胎干细胞（mESCs）中基因功能的强大工具1，但该方法在人多能干细胞（hPSCs）中的应用效率极低2,3。近年来，自然界中可编程的位点特异性核酸酶迅速被引入实验室应用，包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统4，这使得基因组编辑在包括hPSCs在内的多种生物体和细胞系中变得更加容易。这些基因编辑工具利用了嵌合核酸酶（如Cas9内切酶）能够在特定位置诱导双链断裂（DSBs）的特性，从而激活细胞内源性DNA修复机制，触发非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。通过诱导随机插入和缺失突变（indels；via NHEJ）造成移码突变以使基因等位基因失活，或通过精确的核苷酸替换（via HDR）重现患者突变以建立人类疾病模型，或纠正致病突变用于基因治疗，这两种机制均可被用于遗传操作。
CRISPR/Cas介导的基因组编辑需要两个组分：一是恒定的RNA引导型Cas9内切酶，负责DNA切割；二是可变的CRISPR RNA（crRNA）与反式激活crRNA（tracrRNA）双链结构，用于特异性识别DNA靶位点。crRNA/tracrRNA双链可被一个单一的嵌合引导RNA（gRNA）替代，且研究发现后者效率更高5,6,7。尽管CRISPR/Cas9系统已被应用于大多数实验生物和细胞系，但Cas9与gRNA的递送和表达在不同体系中差异显著，仍需进一步优化，以实现在包括人多能干细胞（hPSCs）在内的多种系统中高效进行基因组编辑8。一种高效的基因组编辑平台iCRISPR已在hPSCs中建立5。在该系统中，采用TALEN介导的方法靶向hPSCs中AAVS1位点的两个等位基因——该位点被视为“转基因安全港”&#34;transgene safe harbor locus&#34;，其中一个等位基因插入反向四环素调控转录激活因子（M2rtTA），另一个等位基因插入四环素反应元件（TRE），以驱动Cas9（iCas9）在hPSCs中的表达。在已建立的克隆细胞系（iCas9 hPSCs）中，加入多西环素即可实现Cas9的高水平表达。同时，由于gRNA分子较小（100 nt），单个或多个gRNA均可高效递送至iCas9 hPSCs中，并引导Cas9在特定位点进行DNA切割，从而实现高效的非同源末端连接（NHEJ）介导的基因失活，以及在存在短单链DNA（ssDNA）供体模板的情况下，通过同源定向修复（HDR）实现精确的核苷酸修饰。iCRISPR系统已成功用于构建一系列模拟疾病的hPSC细胞系，这些细胞系在重要发育相关基因中携带双等位基因（纯合或复合杂合）或杂合的功能丧失性突变5,9。尽管已有多个研究团队报道了在hPSCs中使用CRISPR/Cas实现高效基因编辑，但成功案例仍局限于少数技术娴熟的实验室。iCRISPR平台为不同技术水平的研究人员提供了高效且简便的常规基因编辑解决方案，目前已在本课题组及他人的多项已发表研究中得到应用9,10,11,12。该方法还进一步拓展至基于dCas9-KRAB表达的可诱导基因沉默系统13。
随着基因组编辑技术的进步，人类多能干细胞（hPSC）的维持与定向分化也取得了显著进展。hPSC的培养条件已从依赖经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）作为饲养层，发展为在明确的细胞外基质成分上进行无饲养层培养；培养基也从复杂的成分组合转变为化学成分明确的培养体系。14这些改进减少了因iMEF制备和knockout血清替代成分的批次间差异所导致的hPSCs变异，从而为hPSC分化提供了更可重复的环境。同时，对调控人类胚胎发育信号通路的深入认识，以及高通量药物筛选的研究发现，也推动了分化方案的优化。15,16,17,18这些方案更真实地模拟 体内 发育阶段并产生高度模拟其来源组织的细胞类型 体内 对应物。对于人多能干细胞（hPSC）向胰腺谱系的分化，早期方案在一定程度上较好地模拟了胰腺的早期发育过程，但最终产生的β细胞具有多激素表型，表现为不成熟的胎儿表型，且对葡萄糖刺激反应较差。近期进展16,17,19,20 已能够生成对葡萄糖有响应的胰腺β样细胞，这将使我们能够研究后续事件，例如单激素β细胞的形成及其进一步成熟过程。
在此，我们详细阐述了结合iCRISPR系统与基于hPSC的方法，利用基因组编辑细胞系研究胰腺发育的应用 体外 向葡萄糖响应性胰腺β样细胞分化的平台。将强大的基因组编辑工具与优化的人多能干细胞（hPSC）分化方案相结合，不仅提供了验证疾病因果关系所需的高效性与规模化能力，还可实现复杂的遗传操作，以进一步深入探究调控正常发育及疾病发生过程中的转录机制9.

<table><tbody><tr><td>化学成分明确的培养基（E8）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 基础培养基和 Essential 8 添加剂包含在内</td></tr><tr><td>截短型重组人源连环蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>解离试剂（TrypLE Select 酶）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12563029</td><td>1x，无动物源成分，重组酶</td></tr><tr><td>G418硫酸盐</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131035</td><td>遗传霉素选择性抗生素</td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>嘌呤霉素选择性抗生素</td></tr><tr><td>DNA聚合酶（Herculase II融合酶）</td><td>安捷伦科技</td><td>600679</td><td>PCR试剂盒</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 转录纯化试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985062</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>基因组DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>罗氏</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>根据已发表配方定制 &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺补充剂（GlutaMAX）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE 生物实验室</td><td>7500855</td><td>无脂肪酸</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>GSK-3抑制剂</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>维生素C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Hedgehog抑制剂</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>视黄酸</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>BMP抑制剂</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt拮抗剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>PKC 激活剂</td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;三碘甲状腺原氨酸（T3）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5抑制剂II</td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>γ分泌酶抑制剂XX，NOTCH信号通路抑制剂</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸（N-Cys）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>维生素E类似物</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>AXL受体酪氨酸激酶抑制剂</td></tr><tr><td>24 mm Transwell 嵌插式培养小室</td><td>康宁生命科学</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm 电穿孔比色皿</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 内切酶 I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>长寡核苷酸</td><td>Eton Bioscience 或 IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 抗体</td><td>默克密理博</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 抗体</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 抗体</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>胰岛素抗体</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>C肽抗体</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>胰高血糖素抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1,000</td></tr></tbody></table>

利用基因组编辑和hpsc定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

在自我更新或分化的人类多能干细胞（hPSCs）中研究基因功能，为在体外理解人类发育过程和解析疾病机制提供了重要的研究平台。充分发挥这一应用潜力，需要高效的基因组编辑工具，以在与疾病相关的基因中构建hPSC突变体，以及 体外 hPSC分化方案以生成与疾病相关的细胞类型，这些细胞类型能够高度模拟其体内对应物 体内 对应物。一种名为iCRISPR的高效hPSC基因组编辑平台已通过TALEN介导的Cas9表达盒靶向技术开发而成 AAVS1 基因座。本文描述了在化学成分明确的培养基中、无饲养层条件下培养的可诱导型Cas9人多能干细胞（hPSC）系的建立方案。详细介绍了利用iCRISPR系统在hPSC中实现基因敲除或精确遗传修饰的操作流程，分别通过非同源末端连接（NHEJ）或借助同源定向修复（HDR）模板实现精确核苷酸编辑。这些技术步骤包括CRISPR向导RNA（gRNA）的设计、制备与转染；通过T7E1或限制性片段长度多态性（RFLP）检测评估CRISPR突变效率；以及克隆突变细胞系的建立与验证。最后，我们记录了通过模拟体内发育过程将hPSC分化为葡萄糖响应性胰腺β样细胞的实验流程 体内 胰腺胚胎发育。结合iCRISPR技术与定向hPSC分化，可系统性研究基因功能，从而加深对胰腺发育及糖尿病疾病机制的理解。

人多能干细胞化学成分明确且无饲养层培养的适应与维持
在iMEF饲养层上培养的hPSC可快速适应于VTN包被板上的无饲养层培养条件。在适应过程中，可使用与常规iMEF饲养层培养相同的传代比例。图1A展示了hPSC在含KSR培养基的iMEF饲养层上以及在无饲养层培养基中VTN包被表面的典型形态。图1B展示了适应过程首次传代期间（4天）hPSC克隆典型的形态变化和生长情况。细胞可进一步传代或冻存以用于后续实验。在开始分化实验前，应完成2–3次适应性传代培养。尽管我们在适应阶段未观察到核型异常，但仍建议在适应完成后进行核型分析。
通过TALEN介导的AAVS1靶向生成iCas9 hPSC细胞系
如先前所述，将hPSCs与一对AAVS1 TALEN质粒以及Cas9和M2rtTA质粒进行电穿孔转染5。图2A和B展示了供体质粒靶向设计的详细信息以及生成iCas9 hPSC单克隆细胞系的完整流程。经过抗生素筛选后，来源于单细胞、大小合适且具有典型hPSC形态的克隆即可进行挑取（电穿孔后10 - 12天，图2C）。通常约50%的克隆能够正确靶向且无随机整合，经Southern印迹法验证（图2D）5。随机整合可能导致在未使用多西环素处理的情况下出现Cas9的泄漏表达。
利用iCRISPR平台在hPSCs中实现高效的基因修饰
在已建立的iCas9 hPSCs中，通过多西环素处理可诱导Cas9表达，并由转染的gRNAs引导至靶位点，从而产生DNA双链断裂（DSBs）。在无修复模板的情况下，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）进行DNA修复，产生插入或缺失突变（indels），通常导致基因功能破坏或基因敲除。在存在修复模板的情况下（例如， 一种ssDNA供体），HDR可用于实现精确的基因修饰，例如在野生型hPSC背景下引入患者特异性突变，或在患者来源的iPSC中矫正致病性遗传变异（图3A）。使用iCRISPR系统生成克隆突变细胞系大约需要1个月。在诱导iCas9表达并转染gRNA后，采用T7EI和/或RFLP检测评估Cas9切割效率，随后将转染的细胞以低密度（约500 - 2,000个细胞/10 cm培养皿）接种至10 cm培养皿中进行单细胞分离。10 - 12天后，将单细胞来源的克隆转移至96孔板的孔中进行扩增和进一步鉴定。即， 基因分型和蛋白质印迹）（图3B）。由于iCRISPR介导的基因敲除效率很高，无需进行筛选过程，通常可轻松获得20–50%的双等位基因突变体（图3C)5为了实现高效且精确的基因组编辑，可将gRNA与携带特定序列改变的单链DNA供体（ssDNA donor）共同转染，适用于对基因组序列进行小而特异的修饰。通常，为防止在已修饰的等位基因中发生再次切割，建议在PAM序列附近或PAM序列内引入一个同义突变。图3D）。利用该系统，可获得约10%的克隆，其两个等位基因均携带目标HDR介导的基因组修饰且无其他额外改变。图3E利用iCRISPR平台对人多能干细胞（hPSC）基因组进行快速而精确的修饰，可使我们高效、迅速地构建用于研究人类发育与疾病的hPSC细胞系模型。
高效诱导人多能干细胞分化为葡萄糖响应性β样细胞
近年来，人多能干细胞（hPSC）向胰腺分化的研究进展推动了能够紧密模拟胰腺胚胎发育过程的分化方案的建立。未分化的hPSC首先分化为定型内胚层，随后形成PDX1+早期胰腺前体细胞（PP1）和PDX1+NKX6.1+晚期胰腺前体细胞（PP2），最终生成具有葡萄糖响应功能的β样细胞16,17,19,20,23,24。这些方案进一步优化后，可稳定地生成PDX1+NKX6.1+胰腺前体细胞及具有葡萄糖响应能力的β样细胞9。图4A展示了各分化阶段所使用的详细化学添加剂。通常情况下，在初始细胞接种后约2天，细胞融合度达到约80%时，是启动HUES8 hPSC分化过程的理想时机（图4B）。强烈建议测试多种不同的接种密度，以确定每种特定细胞系的最佳条件。通常可在定型内胚层阶段获得至少75%的FOXA2+SOX17+细胞，在PP2阶段获得40%的PDX1+NKX6.1+细胞（图4C）。在S5阶段，细胞聚集体周围出现类似光晕的形态，是细胞存活良好的标志，这对于进一步分化为NKX6.1+CPEP+葡萄糖响应性β样细胞至关重要（图4D）。该方案适用于在体外研究人类胰腺发育与疾病。
<img alt="hPSC 形态、iMEF 与 Vitronectin 培养基比较、适应过程、第1-4天、显微镜观察" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. hPSC 化学成分明确且无饲养层的维持培养及从 iMEF 饲养层向无饲养层培养的适应过程。（A）第4天在iMEF饲养层或VTN上培养的hPSC代表性图像，此时细胞准备进行传代。（B）hPSC从iMEF饲养层向无饲养层培养适应过程中的首次传代典型形态。第4天在iMEF饲养层上培养的hPSC被消化并以与常规在iMEF饲养层条件下相同的传代比例接种至VTN包被的培养板中，使用含ROCK抑制剂的化学成分明确培养基。此后每天更换不含ROCK抑制剂的新鲜培养基。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Cas9编辑的iPSC制备流程、hPSC细胞系的Southern印迹结果示意图。" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. iCas9 hPSC细胞系的建立。（A）构建iCas9 hPSC细胞系的靶向策略。通过一对AAVS1位点特异的TALENs，将Puro-Cas9供体质粒和Neo-M2rtTA供体质粒靶向整合至人AAVS1基因座。（B）完整靶向过程的示意图，包括电穿孔、抗生素筛选、克隆挑取与扩增，以及细胞系鉴定。（C）电穿孔后约10至12天，准备挑取的代表性单细胞克隆。（D）Southern印迹检测结果示例，用于鉴定正确靶向且未发生两个供体质粒额外整合的克隆。正确克隆以红色标记。（A）和（D）经许可改编自参考文献5。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="hPSCs中的基因编辑；Cas9系统，NHEJ，HDR；示意图和图表；突变效率分析。" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 利用iCRISPR系统在hPSCs中实现高效遗传修饰。（A）使用iCRISPR系统生成基因敲除突变体或精确基因修饰的示意图。（B）靶向操作流程及克隆系建立。（C）通过NHEJ在hPSCs中实现基因敲除的效率9。（D）携带特定核苷酸修饰的ssDNA设计。P（红色）：患者特异性突变；X（绿色）：沉默突变。（E）HDR介导的精确核苷酸修饰效率。利用iCRISPR系统在GATA6位点引入了精确的R456C突变（由特定核苷酸C&gt;T突变引起）。（详见参考文献5）。图（C）和图（E）分别改编自参考文献9和参考文献5，并已获得授权。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="hPSCs向β样细胞逐步分化；标志物染色；胰腺分化示意图。" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 将hPSCs定向分化为葡萄糖响应性胰腺β样细胞。（A）详细分化方案示意图，显示各分化阶段添加的化学物质。分化过程中被激活或抑制的信号通路分别以绿色或红色标出。CHIR：GSK3抑制剂；GDF8：生长分化因子8，又称肌肉生长抑制素，属于TGF-β蛋白家族；HH：Hedgehog信号通路；DE：定型内胚层；PP1：PDX1+早期胰腺前体细胞；PP2：PDX1+NKX6.1+晚期胰腺前体细胞。（B）hPSCs接种后48小时，准备启动分化时的典型汇合度（70–80%）。（C）代表性免疫荧光染色图像，显示定型内胚层（DE）阶段（FOXA2与SOX17共染色）、胰腺前体细胞阶段（PP2：PDX1与NKX6.1共染色）以及葡萄糖响应性β样细胞阶段（NKX6.1与C-肽共染色）的成功分化结果。通常，若希望在β样细胞阶段获得超过10%的NKX6.1+CPEP+细胞，则在相应阶段至少需要达到75%的FOXA2+SOX17+定型内胚层细胞和40%的PDX1+NKX6.1+ PP2细胞。（D）S5阶段细胞聚集体在气液界面培养中位于插入式滤膜上的典型形态。存活细胞已迁移至聚集体中心（颜色较深区域），边缘则留下类似光晕的结构。（A）和（D）经许可改编自参考文献9。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质粒</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>5 µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>5 µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>40 µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>40 µg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7F</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TracrR</td>
			<td>AAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>35.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x PCR 反应缓冲液</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP 混合液 (25 mM)</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7F (10 µM)</td>
			<td>1.25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TracrR (10 μM)</td>
			<td>1.25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-gRNA IVT 模板  (250 nM)</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 聚合酶</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 反应体系总体积</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">PCR 循环条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>循环次数</td>
			<td>变性</td>
			<td>退火</td>
			<td>延伸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>94 ºC, 2 min</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-31</td>
			<td>94 ºC, 20 s</td>
			<td>60 ºC, 20 s</td>
			<td>72 ºC, 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>72 ºC, 2 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 ATP</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 CTP</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 GTP</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 UTP</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 10x 缓冲液</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 酶混合物</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR扩增模板</td>
			<td>8 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计 体外 gRNA 转录反应体系</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 ºC 下孵育 6 小时至过夜</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积 (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未纯化的 PCR 产物</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2 10x</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蒸馏水 (dH2O)</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">DNA 变性与杂交循环条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>PCR 仪条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 2 °C/s 的速率升至 85 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 75 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 65 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 55 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 45 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 35 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>以 0.3 °C/s 的速率升至 25 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C</td>
			<td>保持</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表7
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阶段</td>
			<td>天数</td>
			<td>培养基</td>
			<td>添加物</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">S1</td>
			<td>d0</td>
			<td>S1</td>
			<td>GDF8 
			100 ng/mL</td>
			<td>CHIR-99021 
			3 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d1</td>
			<td>S1</td>
			<td>GDF8 
			100 ng/mL</td>
			<td>CHIR-99021 
			0.3 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d2</td>
			<td>S1</td>
			<td>GDF8 
			100 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">S1 培养基：MCDB 131 + 1x L-谷氨酰胺补充剂 + 0.5% BSA + 1.5 g/L NaHCO3 + 10 mM 葡萄糖</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表8
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阶段</td>
			<td>天数</td>
			<td>培养基</td>
			<td colspan="8">添加物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S2</td>
			<td>d3-d4</td>
			<td>S1</td>
			<td>LAA 
			0.25 mM</td>
			<td>FGF7 
			50 ng/mL</td>
			<td>IWP-2 
			2.5 µM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3</td>
			<td>d5-d6</td>
			<td>S3</td>
			<td>LAA 
			0.25 mM</td>
			<td>FGF7 
			50 ng/mL</td>
			<td>SANT-1 
			0.25 µM</td>
			<td>RA 
			1 µM</td>
			<td>LDN 
			100 nM</td>
			<td>TPB 
			200 nM</td>
			<td>ITS-X 
			1:200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S4</td>
			<td>d7-d9</td>
			<td>S3</td>
			<td>LAA 
			0.25 mM</td>
			<td>FGF7 
			2 ng/mL</td>
			<td>SANT-1 
			0.25 µM</td>
			<td>RA 
			0.1 µM</td>
			<td>LDN 
			200 nM</td>
			<td>TPB 
			100 nM</td>
			<td>ITS-X 
			1:200</td>
			<td>IWP-2 
			2.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="11">S3 培养基：MCDB 131 + 1x L-谷氨酰胺补充剂 + 2% BSA + 2.5 g/L NaHCO3 + 10 mM 葡萄糖</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表9
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阶段</td>
			<td>天数</td>
			<td>培养基</td>
			<td colspan="8">添加剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S5</td>
			<td>d10-d12</td>
			<td>S5</td>
			<td>T3 1 µM</td>
			<td>ALK5i II 10 µM</td>
			<td>SANT-1 0.25 µM</td>
			<td>RA 0.05 µM</td>
			<td>LDN 100 nM</td>
			<td>ITS-X 1:200</td>
			<td>ZnSO4 10 µM</td>
			<td>Heparin 10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6</td>
			<td>d13- d19</td>
			<td>S5</td>
			<td>T3 1 µM</td>
			<td>ALK5i II 10 µM</td>
			<td>GSiXX 100 nM</td>
			<td></td>
			<td>LDN 100 nM</td>
			<td>ITS-X 1:200</td>
			<td>ZnSO4 10 µM</td>
			<td>Heparin 10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7</td>
			<td>d20- d33</td>
			<td>S5</td>
			<td>T3 1 µM</td>
			<td>ALK5i II 10 µM</td>
			<td>N-Cys 1mM</td>
			<td>Trolox 10 µM</td>
			<td>R428 2 µM</td>
			<td>ITS-X 1:200</td>
			<td>ZnSO4 10 µM</td>
			<td>Heparin 10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="11">S5 培养基：BLAR + 1x L-谷氨酰胺补充剂 + 2% BSA + 1.5 g/L NaHCO3 + 20 mM 葡萄糖</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表10

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

在自我更新或分化的人类多能干细胞（hPSCs）中探究基因功能，为理解……提供了有价值的平台

本方案展示了如何建立iCRISPR平台，以实现hPSC中快速的基因组编辑，并如何将基因组编辑的细胞系与hPSC定向胰腺分化相结合，用于研究人类胰腺发育与疾病。这些方法有助于回答人类胰腺发育领域中的关键科学问题，例如正常胰腺发育的遗传调控机制以及糖尿病的分子基础。这些技术的主要优势在于，能够高效地对hPSC中的目的基因进行修饰，并利用这些经基因修饰的细胞系在体外开展人类胰腺发育与疾病的相关研究。在经截短型人源玻连蛋白包被的培养皿中，以化学成分明确且无饲养层的条件培养人多能干细胞（hPSCs）。电转前一天，在换液时加入10 µM的ROCK抑制剂。电转当天，提前准备好经玻连蛋白包被的10厘米培养皿。然后从细胞中移除培养基，用不含钙和镁的 PBS 洗涤一次，再在 37 摄氏度下用 1X 解离试剂处理约三分钟。接下来，在细胞尚未完全脱落前吸除解离试剂，并加入 10.5 毫升完全培养基。通过轻柔吹打形成单细胞悬液，然后转移至离心管中。使用自动细胞计数器对500微升细胞悬液进行细胞计数。然后在200 × g条件下离心5分钟，收集hPSC细胞沉淀。用预冷的PBS重悬细胞，浓度为12.5 × 10⁶ 个细胞/毫升，并分装为每份800微升。将质粒加入每个800微升的hPSC悬浮液中，充分混匀。将混合液转移至0.4厘米的电穿孔比色皿中，冰上放置约5分钟。使用电穿孔仪在250伏和500微法拉条件下对细胞进行电穿孔。基因组编辑过程中，使用健康且处于增殖状态的人多能干细胞（hPSCs）至关重要。电穿孔后，将细胞转移至含有5毫升预温完全培养基的15毫升锥形管中，随后离心收集细胞。用10毫升含10 µM ROCK抑制剂的完全培养基重悬细胞，并将每次电穿孔所得的1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶个细胞分别接种至包被有纤连蛋白（vitronectin）的培养皿中，以确保至少有一个培养皿能够获得足够数量的单细胞克隆用于挑取。将细胞在 37 摄氏度下培养。第 2 天，通过加入含有 500 微克/毫升 G418 硫酸盐的培养基开始新霉素筛选。第 6 天，通过加入含有 1 微克/毫升嘌呤霉素二盐酸盐的培养基开始嘌呤霉素筛选。在第10至12天，hPSC单细胞集落直径将达到1至2毫米。此时，在体视显微镜下挑选12至24个集落。使用200微升移液器吸头将hPSC集落机械解离成小块，并直接将细胞转移至包被有纤连蛋白的24孔板中。在进行向导RNA转染前24小时，用每毫升2微克的多西环素处理iCas9人多能干细胞。转染当天，准备经纤连蛋白包被的24孔板，并如前所述使用1倍解离试剂将iCas9细胞解离为单细胞。接着，在200 × g条件下离心5分钟收集细胞，然后将细胞重悬于完全培养基中，终浓度为每毫升0.5 × 10⁶个细胞，并补充2微克/毫升多西环素和10微摩尔ROCK抑制剂。将重悬的细胞各500微升加入24孔板的各个孔中。针对每种向导RNA，配制以下转染混合物：混合物A，50微升低血清培养基加1微升向导RNA。将B混合物（50微升减血清培养基加3微升转染试剂）与A混合物混合，制成100微升的混合液，室温孵育5分钟。取50微升该混合液加入24孔板的重复孔细胞中，并充分混匀。四天后，提取基因组DNA，通过PCR扩增引导RNA靶向序列侧翼的目标区域，并利用T7E1消化法评估编辑效率。在细胞接种后两天达到80%融合度时，开始对人多能干细胞系进行分化。加入分化第0天培养基，随后根据此处所示配方每日更换培养基。第10天，通过免疫荧光染色部分细胞，检测晚期胰腺前体细胞PP2标志物PDX1和NKX6.1。随后进行气液界面培养，首先用10 µM ROCK抑制剂处理PP2细胞4小时。孵育时间结束后，按前述方法消化细胞。为在分化过程的气液界面阶段获得最佳细胞存活率，应尽量缩短解离试剂的处理时间。在细胞尚未完全脱落前，吸除解离试剂。随后向培养板中加入10毫升boo-lah培养基，通过轻柔吹打将PP2细胞分散为单细胞悬液。收集单细胞悬液，计数细胞数量后离心形成细胞沉淀。用S5分化培养基重悬细胞沉淀后，将5至10微升细胞悬液均匀点样于Transwell小室滤膜上。向每个Transwell小室底部加入S5培养基，并在更换培养基的条件下继续培养，直至通过免疫荧光染色可检测到胰腺内分泌标志物。该图显示了iCRISPR介导的人多能干细胞（hPSCs）中的非同源末端连接。基因敲除效率很高，无需筛选过程即可轻松获得20%至50%的双等位基因突变体。为了实现高效且精确的基因组编辑，可将引导RNA与一条携带特定序列改变的单链DNA供体共同转染，其中特定序列改变以红色显示。通常，为防止在已修饰的等位基因中发生再次切割，建议在PAM序列中引入一个同义突变，此处以绿色显示。利用该系统，可获得约10%的克隆，其携带期望的、由同源定向修复介导的基因组修饰，且两个等位基因均无额外的改变。一旦掌握，建立一个新的iCas9 hPSC细胞系所需时间不到两个月。此后，可在一至两个月内生成多种hPSC突变克隆细胞系。在获得hPSC基因突变细胞系后，通过体外逐步分化将其诱导为胰腺β样细胞，可研究这些突变所影响的特定发育阶段，从而有助于更深入理解相关疾病的发病机制。

genome-editing-directed-differentiation-hpscs-for-interrogating

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基因组编辑和hPSCs定向分化为胰腺癌发展讯问谱系行列式

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑可以快速高效地完成。本文展示了一种可靠的实验方案，以编辑AAVS1安全港位点以表达EGFP并引入抗生素抗性为例，对hPSCs进行基因工程改造。...

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。...

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

学习利用iCRISPR平台在人类多能干细胞中进行基因组编辑，并将其定向分化为胰腺祖细胞以研究胰腺发育和糖尿病机制。该方法可高效实现基因敲除并建立疾病模型。

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

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