基因组编辑和hPSCs定向分化为胰腺癌发展讯问谱系行列式
2017年3月5日
协议来生成使用iCRISPR平台HPSC突变系和分化hPSCs成葡萄糖反应β样细胞中有描述。结合基因组编辑技术，HPSC-定向分化为血统决定因素在人的发展和疾病发展中的作用的系统分析了强大的平台。
该协议演示了如何建立 iCRISPR 平台以在 hPSC 中进行快速基因组编辑，以及如何将基因组编辑系与 hPSC 定向胰腺分化相结合以研究人类胰腺发育和疾病。这些方法可以帮助回答人类胰腺发育领域的关键问题，例如正常胰腺发育的遗传控制以及糖尿病的分子基础。这些技术的主要优点是它们使我们能够有效地修饰 hPSC 中的目标基因，并将这些修饰的细胞系用于体外人类胰腺发育和疾病的研究。
在化学成分明确和无饲养层的条件下，在截短的人玻连蛋白包被培养皿上培养 hPSC。电穿孔前一天，在更换培养基期间添加 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。电穿孔当天，提前准备玻连蛋白包被的 10 厘米培养皿。
然后从细胞中取出培养基，用不含钙和镁的 PBS 洗涤一次，然后在 37 摄氏度下用 1X 解离试剂处理细胞约 3 分钟。接下来，在细胞分离之前吸出解离试剂，并加入 10.5 mL 完全培养基。在转移到离心管之前，使用轻柔的移液形成单细胞悬液。
使用自动细胞计数仪对 500 μL 细胞悬液进行细胞计数。然后以 200 倍 G 沉淀 hPSC 5 分钟。将细胞重悬于冷 PBS 中，以 12.5 倍 10 至每毫升第 6 个细胞，并分装成 800 微升体积。
将质粒添加到每个 800 微升 hPSC 悬浮液中并充分混合。将混合物转移至 0.4 cm 电穿孔比色皿中，并在冰上放置约 5 分钟。使用 250 伏和 500 微法的电穿孔系统对细胞进行电穿孔。
使用健康和增殖的 hPSC 进行基因组编辑至关重要。电穿孔后，将细胞转移到装有 5 mL 预热完全培养基的 15 mL 锥形管中，然后沉淀细胞。将细胞重悬于含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的 10 毫升完全培养基中，并将每个电穿孔的第 6 个细胞接种 10 倍、第 6 个细胞第 10 个细胞 2.5 倍和第 6 个细胞第 10 个细胞的 5 倍接种到玻连蛋白包被的培养皿上，因此至少一个板将具有足够的单细胞集落用于挑选。
在 37 摄氏度下培养细胞。第二天，通过添加含有 500 μg/mL G418 硫酸盐的培养基开始新霉素筛选。第 6 天，通过添加每毫升含有 1 μg 嘌呤霉素二盐酸盐的培养基开始嘌呤霉素筛选。
在第 10 至 12 天，hPSC 单细胞集落的直径将达到 1 至 2 毫米。此时，在立体显微镜下挑选 12 到 24 个菌落。使用 200 微升移液器吸头将 hPSC 集落机械解聚成小块，并将细胞直接转移到玻连蛋白包被的 24 孔板中。
向导 RNA 转染前 24 小时，用每毫升 2 μg 多西环素处理 iCas9 hPSC。转染当天，制备玻连蛋白包被的 24 孔板，并像以前一样使用 1X 解离试剂将 iCas9 细胞解离成单细胞。接下来，以 200 倍 G 的浓度沉淀细胞 5 分钟，并在补充有 2 μg/mL 多西环素和 10 μmol ROCK 抑制剂的完全培养基中以 0.5 倍 10 至每毫升 6 个细胞重悬细胞。
将 500 μL 重悬细胞接种到 24 孔板的各个孔中。对于每种向导 RNA，制备以下转染混合物。混合 A，50 μL 减血清培养基和 1 μL 向导 RNA。
混合 B，50 μL 减血清培养基和 3 μL 转染试剂。将混合物 A 和 B 混合制成 100 μL 的混合物，并在室温下孵育 5 分钟。将 50 微升混合物添加到 24 孔板的重复孔中的细胞中并充分混合。
四天后，提取基因组 DNA，PCR 扩增向导 RNA 靶向序列侧翼的靶区域，并使用 T7E1 消化估计编辑效率。当细胞在接种后两天达到 80% 汇合时，开始分化 hPSC 系。添加分化零天培养基，然后使用此处显示的公式每天更换培养基。
第 10 天，通过免疫荧光染色细胞亚群来检查后期胰腺祖细胞 PP2 标志物、PDX1 和 NKX6.1。然后进行气液界面培养，首先用 10 微摩尔 ROCK 抑制剂处理 PP2 细胞 4 小时。孵育时间过后，像以前一样解离细胞。
最大限度地减少解离试剂处理的持续时间，以最大限度地提高分化气液界面阶段接种的细胞存活率。在细胞分离之前吸出解离试剂。然后向板中加入 10 ml boo-lah 培养基，并通过轻轻上下吹打将 PP2 细胞分散到单个细胞中。
收集单细胞悬液。计数细胞数，并沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于 S5 分化培养基中后，在 transwell 插入过滤器上每个点取 5 至 10 μL 细胞。
将 S5 培养基添加到每个 transwell 插入片段的底部，并与培养基变化一起孵育，直到可通过免疫荧光染色检测到胰腺内分泌标志物。该图显示了 iCRISPR 介导的非同源末端连接 hPSC。基因敲除非常有效，因为不涉及选择过程，并且可以轻松实现 20% 至 50% 的双等位基因突变体。
为了实现高效和精确的基因改变，向导 RNA 与携带特异性序列改变的单链 DNA 供体共转染，如红色所示。通常，为了防止重新切割修饰的等位基因，建议在 PAM 序列中包含一个沉默突变，此处以绿色显示。使用该系统，可以实现大约 10% 的克隆携带所需的同源定向修复介导的基因组修饰，而不会对两个等位基因进行额外改变。
一旦掌握，只需不到两个月的时间即可建立新的 iCas9 hPSC 细胞系。之后，可以在 1 到 2 个月内生成各种 hPSC 突变集落系。在产生 hPSC 遗传突变系之后，突变细胞系在体外逐步分化为胰腺 β 样细胞使我们能够研究受这些突变影响的特定发育步骤，这将有助于更好地了解潜在的疾病机制。
概述
该协议概述了使用iCRISPR平台生成hPSC突变系和将其分化为对葡萄糖反应的β-样细胞的过程。这种方法将基因组编辑与hPSC分化相结合，以探索人类发育和疾病中的谱系决定因素。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 基因工程
- 胰腺发育
背景
- 人类多能干细胞（hPSCs）对于研究人类发育非常有价值。
- 基因组编辑允许对hPSCs进行精确修改。
- 理解胰腺发育对于解决糖尿病至关重要。
- iCRISPR技术提高了hPSCs基因编辑的效率。
研究目的
- 开发一个创建基因组编辑的hPSC系的协议。
- 将这些系分化为胰腺细胞用于研究。
- 研究胰腺发育和糖尿病的遗传控制。
使用的方法
- 在定义的无饲养层条件下培养hPSCs。
- 用质粒电转入细胞进行基因组编辑。
- 使用选择标记分离成功编辑的细胞。
- 将hPSCs分化为胰腺前体细胞并评估标记。
主要结果
- 通过高双等位基因突变率实现了有效的基因敲除。
- 成功地将hPSCs分化为胰腺前体细胞。
- 确定了胰腺发育的关键标记。
- 建立了一个用于未来研究的稳定协议。
结论
- iCRISPR平台对hPSCs中的基因组编辑有效。
- 这种方法促进了胰腺发育和疾病的研究。
- 未来的研究可以利用这些技术获得治疗见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating iCRISPR genome editing with directed hPSC differentiation enables systematic interrogation of gene function in human pancreatic development, directly supporting disease mechanism studies and target validation for diabetes. This platform accelerates the generation of disease-relevant cellular models, enhancing predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points. The approach supports portfolio-wide de-risking by enabling precise, reproducible manipulation and phenotypic assessment of lineage determinants in human systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes implicated in pancreatic lineage specification.
- Supports mechanistic de-risking by linking genotype to developmental phenotype in human cells.
- Facilitates rapid generation of isogenic mutant lines for hypothesis-driven interrogation.
- Improves predictive confidence for target selection in diabetes and metabolic disease research.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, feeder-free hPSC systems for reproducible genome editing and differentiation.
- Delivers quantitative readouts via immunofluorescent marker analysis (e.g., PDX1, NKX6.1).
- Enables scalable production of mutant and control lines for downstream compound screening.
- Supports assay development with validated, lineage-specific cellular outputs.
Translational & Preclinical Research
- Generates disease-relevant human beta-like cells for modeling diabetes mechanisms.
- Aligns in vitro phenotypes with in vivo developmental markers, supporting translational biomarker strategies.
- Enables continuity from genetic perturbation to functional cellular assessment in preclinical workflows.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with human mechanistic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This platform bridges early discovery, target validation, and preclinical model development by enabling precise genome editing and lineage-specific differentiation in hPSCs.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic clarification of gene function in human pancreatic development.
- Screening: Provides reproducible, quantitative marker-based outputs for assay standardization and screening readiness.
- Analytics: Enables measurement of editing efficiency and phenotypic outcomes using T7E1, RFLP, and immunofluorescence assays.
- Translational Research: Connects in vitro differentiation to disease-relevant cellular phenotypes for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating and interrogating mutant hPSC lines across multiple gene targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing and differentiation protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of disease-relevant targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program application of validated cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hPSC culture, genome editing, and differentiation protocols.
- Needs access to electroporation systems, automated cell counters, and molecular biology infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility of editing and differentiation outcomes.
- Adaptation to other lineages or disease models may require protocol optimization.
- Editing efficiency and clonal validation steps are critical for downstream assay reliability.
