Name: 在人多能的体外干细胞向滋养层细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解利用骨形态发生蛋白4和信号通路抑制剂将人多能干细胞高效分化为滋养层细胞的方法。该技术可产生大量细胞用于胎盘发育和基因功能研究。

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本工作由宾夕法尼亚州健康研究基金公式基金资助。

注意：为了将人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为滋养层前体细胞，需先将生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上的人多能干细胞（hPSCs）转移至无饲养层条件下连续传代两次，然后再开始使用BMP4/A/P进行分化。此过程可消除分化细胞中的MEF污染。本文以hESC分化为例介绍实验方案，该方案同样适用于hiPSCs。
1. 在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养和复苏人胚胎干细胞（hESCs）（准备工作）
<ol>
	<li>MEF 细胞的γ射线辐照
	<ol>
		<li>配制 500 ml MEF 细胞培养用培养基：含 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素（Pen/Strep）和 0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA）的 DMEM 培养基。</li>
		<li>解冻一管原代 MEF 细胞，并使用 MEF 培养基进行细胞培养。利用 MEF 培养基将原代 MEF 细胞扩增至 30 个培养皿。 
		注：此步骤对氧气浓度无严格要求，因此可在生理氧浓度（4%）或常氧环境（20%）的培养箱中进行。</li>
		<li>收集 MEF 细胞。使用 0.25% 胰蛋白酶将 MEF 细胞从培养皿中消化下来，并转移至锥形管中。将 MEF 细胞放入辐照仪中，接受 3,500 拉德（Gy）的辐照剂量。 
		注：辐照时间取决于辐照仪内放射源的活性。</li>
		<li>用 MEF 培养基重悬经辐照的 MEF 细胞，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
		<li>通过离心收集细胞沉淀，加入 50% MEF 培养基和 50% 细胞冻存液（80% FBS 和 20% MEF 培养基），每管分装 1 × 106 个细胞。</li>
		<li>将辐照后的 MEF 细胞冻存管置于 -80 °C 冰箱中过夜，随后转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻冻存的 MEF 细胞和 hESC 细胞用于培养
	<ol>
		<li>配制 500 ml hESC 培养基：含 20% 血清替代物、0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA）、2 mM L-谷氨酰胺、10 ng/ml bFGF、0.1 mM β-巯基乙醇和 1×青霉素/链霉素（Pen/Strep）的 DMEM/F-12 培养基。</li>
		<li>在解冻 hESC 细胞的前一天解冻一管 MEF 细胞。使用 0.1% 明胶对 6 孔板进行包被，每孔加入 1 ml 明胶溶液。室温孵育至少 20 分钟后，吸除明胶溶液。</li>
		<li>从液氮中取出一管 MEF 细胞，将其浸入 37 °C 水浴中。间歇观察冻存管，直至仅剩少量冰晶。迅速将管内内容物转移至含有 9 ml MEF 培养基的 15 ml 锥形管中。</li>
		<li>在 200 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。吸除上清液，用 MEF 培养基重悬细胞沉淀，并将细胞均匀分装至 6 孔板中。将培养板置于 37 °C、低氧（4%）培养箱中过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MEF 细胞上常规培养 hESC 细胞
	<ol>
		<li>从液氮中取出一管 hESC 细胞，迅速在 37 °C 水浴中解冻。轻柔地将 hESC 细胞吹打转移至含有 9 ml hESC 培养基的 15 ml 锥形管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 ml hESC 培养基重悬细胞。</li>
		<li>吸除步骤 1.2.4 中准备好的培养板中的 MEF 培养基，加入 1 ml hESC 培养基，并添加 Rock 抑制剂 Y-27632（终浓度 10 µM）。将 hESC 细胞接种至 MEF 细胞层上。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、低氧（4%）培养箱中过夜。每日更换 hESC 培养基。在正置显微镜下以 4× 物镜观察，用巴斯德吸管刮除已分化的细胞。</li>
		<li>根据细胞融合度及 hESC 克隆大小，每 4–6 天传代一次。传代前一天准备新的 MEF 细胞包被板。当细胞达到传代条件时，吸除 hESC 培养基，并用 1 ml PBS 洗涤孔内细胞。</li>
		<li>加入 1 mg/ml 胶原酶（预先预热至 37 °C），在 37 °C 孵育 5 分钟后吸除胶原酶。用 PBS 洗涤细胞，每孔加入 1 ml hESC 培养基，使用 5 ml 移液器吸头手动将细胞刮成小团块。将悬浮的细胞团块转移至新的 MEF 包被孔（或孔群）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人胚胎干细胞从饲养层细胞向包被细胞外基质的无饲养层培养条件的转换
<ol>
	<li>制备小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（CM）
	<ol>
		<li>将经照射的MEFs以90-100%融合度接种于T75培养瓶中；MEFs的接种密度必须足够高。使用显微镜观察细胞，以确定其是否已贴附于培养瓶底部（MEFs通常在接种后约6小时或次日完成贴壁）。 
		注意：在显微镜下观察时，未贴壁的细胞悬浮于培养基中。次日，移除MEF培养基，并加入25 ml不含B-FGF的hESC培养基。</li>
		<li>孵育24小时后收集条件培养基。每天更换新鲜培养基，最多持续12天。</li>
		<li>使用 0.22 µm 滤器过滤收集的 CM。使用前，向 CM 中添加新鲜的 B-FGF。 
		注意：CM 可在 -80 °C 冻存，保存时间最长可达 1 年。或者，可在 4 °C 保存 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将hESCs从饲养层细胞（MEFs）培养转移至无饲养层的细胞外基质包被培养板中。
	<ol>
		<li>组织培养板包被用细胞外基质的制备
		<ol>
			<li>在冰上解冻一份细胞外基质（约3–4小时）。使用预冷的枪头、一个预冷的50 ml锥形管和DMEM/F12培养基，将2 mg细胞外基质转移至24 ml冰冻的DMEM/F-12中（稀释比例取决于供应商提供的细胞外基质浓度）。</li>
			<li>立即将50 ml离心管置于冰上，并在4 °C保存。如需包被组织培养板，向孔中加入适量稀释的细胞外基质 例如， 每孔加入1 ml，置于6孔板中。轻轻摇晃以均匀包被，室温孵育至少1小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用含有碱性成纤维细胞生长因子（10 ng/ml）的培养基，将人胚胎干细胞从MEF上进行传代（同步骤1.3）。
		<ol>
			<li>吸弃新培养板中的细胞外基质，加入含b-FGF的培养基。用移液器将MEF培养板上刮取的细胞团块转移至包被有细胞外基质的培养板中，并分装均匀。于37 °C低氧培养箱中孵育过夜。</li>
			<li>每天更换为含B-FGF的培养基；培养基的用量取决于培养瓶的大小。每个6孔板孔使用2 ml培养基。用巴斯德吸管刮除已分化的细胞。</li>
			<li>每6-7天传代一次人胚胎干细胞，当在显微镜下观察到细胞集落呈现明亮状态时进行。 
			注意：在细胞外基质包被的培养板上生长的hESC集落比在MEF上培养的细胞更大。</li>
			<li>当无饲养层细胞准备传代时，移除培养基，用移液器加入1 ml PBS洗涤，吸除PBS，再用移液器加入0.5 mg/ml Dispase（预热至37 °C），于37 °C孵育5 min。</li>
			<li>用 2 ml PBS 洗涤细胞，每孔加入 2 ml PBS 后吸弃。每孔加入 1 ml CM，用 5 ml 移液器枪头手动刮取细胞，使其形成小团块。</li>
			<li>将悬浮的细胞团块接种至新的包被有细胞外基质的培养板中；细胞应在24小时后贴壁。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 BMP4/A/P 诱导 hESC 分化
<ol>
	<li>配制分化培养基。使用不含B-FGF的CM，并加入（新鲜的）BMP4（50 ng/ml）、A83-01（1 µM）和PD173074（0.1 µM）。在使用前将这些抑制剂添加到CM中。</li>
	<li>使用在细胞外基质包被的培养板上无饲养层培养的hESC，传代一次，置于含4%氧气的培养箱中培养。在首次接种至细胞外基质包被的培养板后，让细胞贴壁24小时。次日开始诱导分化。吸除含B-FGF的CM，更换为含有BMP4/A/P的CM（6孔板每孔2 ml）。继续在4%氧气条件下培养细胞。</li>
	<li>每2天更换一次含BMP4/A/P的CM（6孔板每孔2 ml）。用移液器吸除旧培养基，加入新鲜CM。在添加BMP4并去除B-FGF后的第2天（记为分化第2天），细胞形态将发生变化，在显微镜下观察可见细胞变大。 
	注意：未分化细胞具有明亮的圆形边缘，此时不应存在。</li>
	<li>在预定时间点收集细胞。分化后的细胞大约在2周后停止分裂。在此期间进行细胞转染（见下一部分）。</li>
</ol>
4. 用 siRNA 或质粒 DNA 转染滋养层细胞
<ol>
	<li>准备滋养层细胞用于转染
	<ol>
		<li>将hESCs从MEFs转移后，在细胞外基质上连续培养两代（参见步骤2.2）。使用含B-FGF的hESC培养基。</li>
		<li>将hESCs在分化前一天接种至新的细胞外基质包被的培养板中。高细胞汇合度至关重要，因此以1:1比例将细胞传代至新的培养板/孔中，以确保次日细胞汇合度至少达到50%。将细胞在低氧培养箱中过夜孵育。 
		注意：此步骤中无需对人胚胎干细胞（hESCs）进行计数。</li>
		<li>第二天，将培养基更换为分化培养基（含 BMP4/A/P 但不含 b-FGF 的 CM，6 孔板每孔加入 2 ml）。用移液器吸去旧培养基，加入新培养基（2 ml）。将细胞置于低氧培养箱（4% 氧气）中过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用siRNA进行基因敲低或使用质粒DNA进行转染
	<ol>
		<li>将细胞培养至所需时间点（第1天至第14天之间）。转染前一天，使用0.05%胰蛋白酶消化细胞5分钟，收集细胞并以目标汇合度（根据转染试剂说明书确定）接种于明胶包被的培养板上（在组织培养板中加入0.1%明胶，孵育20分钟后吸除）。加入含有BMP4/A/P（不含b-FGF）的培养基，过夜孵育。</li>
		<li>次日，向细胞中加入新鲜的分化培养基。使用siRNA转染试剂转染siRNA。对于质粒DNA，使用适当的脂质体转染试剂。</li>
		<li>按照每种转染试剂的产品说明书进行操作。将siRNA-脂质体复合物转移至各孔/板的细胞中，轻轻混匀，并将细胞在低氧培养箱中培养过夜。 
		注意：某些转染试剂会受到抗生素的抑制，因此需要使用不含青霉素/链霉素的培养基。</li>
		<li>第二天，更换为新鲜的分化培养基。</li>
		<li>在预定的时间点收获细胞（例如， 24 小时、48 小时和 72 小时）后，采用定量 RT-PCR 检测基因敲除效率。收集细胞时，每孔加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶，37 °C 孵育 5 分钟。每孔加入 5 ml MEF 培养基以中和胰蛋白酶。200 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀用于 RNA 提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 滋养层细胞的病原体感染：仙台病毒感染
<ol>
	<li>准备hESCs以进行分化
	<ol>
		<li>在从MEFs转移后，将hESCs在细胞外基质上培养两代（参见步骤2.2）。使用含有B-FGF的hESC培养基。</li>
		<li>在分化前一天，将hESCs以1:1比例传代至新的细胞外基质培养板中。高细胞融合度至关重要，因此以1:1比例将细胞接种至新板/孔中，以确保次日细胞融合度至少达到50%。将细胞在低氧培养箱（4%氧气）中过夜培养。 
		注意：此步骤中无需对hESCs进行计数。</li>
		<li>次日，将培养基更换为分化培养基（含BMP4/A/P但不含B-FGF的CM），并在低氧培养箱（4%氧气）中继续过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滋养层细胞的仙台病毒感染
	<ol>
		<li>在目标分化日的前一天，使用0.05%胰蛋白酶消化5分钟，将正在分化的细胞消化为单细胞，并转移至明胶包被的培养板中。加入分化培养基，并在低氧培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日，加入用于感染的培养基（根据病毒类型而定）。使用不含青霉素/链霉素但含BMP4/A/P的CM，每6孔板的一个孔加入0.5 ml。加入仙台病毒，使MOI = 1。在低氧培养箱中孵育8小时。</li>
		<li>如需额外时间点，可在4小时后移除含病毒的培养基，并更换为含BMP4/A/P的CM。使用细胞刮收集细胞用于RNA提取。</li>
		<li>通过qRT-PCR检测病毒应答相关基因的表达，以确定病毒感染效率18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

我们介绍了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为滋养层前体细胞的基本步骤。该方案近期已得到优化，通过添加Activin/Nodal信号通路抑制剂，可快速诱导hESCs分化，提高向滋养层细胞的分化效率，并避免仅使用BMP4处理时通常出现的中胚层前体细胞的生成。BMP4模型系统可用于研究人类滋养层谱系特化与扩增的最早阶段。此外，该BMP4模型系统还适用于探究滋养层细胞向特定亚谱系的分化，而这是使用绒毛膜癌细胞系或绒毛外滋养层细胞系所无法实现的。体外诱导获得的滋养层细胞也可用于利用siRNA进行的基因功能缺失实验19。此外，还可对hESCs或hiPSCs进行遗传修饰，以实现外源基因的可诱导表达19，或在内源性位点插入报告基因20，随后利用本文所述条件将这些细胞分化为滋养层细胞。
实验方案中的关键步骤
为了从人胚胎干细胞（hESCs）获得滋养层祖细胞，必须在CM分化培养基中省略B-FG...

胎盘在妊娠期间对胎儿的生长和存活至关重要，它介导母体与胎儿循环之间的气体、营养物质、代谢废物和激素的交换。在哺乳动物胚胎发育过程中，最先形成的器官是胎盘，人类胎盘在受孕后6-7天开始发育，小鼠则在3.5-4.5天开始1,2,3,4。滋养层细胞是胎盘中最重要的细胞，代表了哺乳动物胚胎最早发生的谱系分化事件之一。这些细胞起源于着床前胚泡的外层胚外滋养外胚层细胞。由于在模拟人类早期发育方面存在伦理和操作上的限制，我们对胎盘发育早期阶段的认识仍然有限。
在胚胎着床过程中，滋养层细胞侵入母体上皮并分化为特化的祖细胞5。细胞滋养层细胞（CTBs）是单核的未分化祖细胞，可融合并进一步分化为合体滋养层细胞（SYNs）和绒毛外侵袭性滋养层细胞（EVTs），后者将胎盘锚定于子宫壁。SYNs 是多核的终末分化细胞，能够合成维持妊娠所必需的激素。生成 EVTs 和 SYNs 的早期分化事件对胎盘形成至关重要，因为滋养层细胞功能受损可导致流产、子痫前期以及宫内生长受限1。目前已建立的人类滋养层细胞系类型包括永生化 CTBs 和绒毛膜癌细胞系，后者可产生胎盘激素并具有侵袭特性6。可从人类妊娠早期胎盘中分离原代滋养层细胞，但这些细胞在体外培养中会迅速分化并停止增殖。in vitro。重要的是，转化细胞系与原代细胞系具有不同的基因表达谱，表明肿瘤来源或永生化的滋养层细胞系可能无法准确代表原代滋养层细胞7。此外，这些细胞系不太可能模拟胎盘滋养层干细胞祖细胞，因为它们来源于妊娠中晚期（第一至第三孕期）的组织。
需要一种可靠的方法 体外 早期人类滋养层细胞的培养系统，用于研究胎盘早期形成与功能。人类胚胎干细胞（hESCs）具有与着床前胚胎内细胞团相似的特性，常被用于模拟早期人类发育过程，包括早期胎盘的形成。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）和hESCs均可分化为滋养层细胞。 体外 使用骨形态发生蛋白4（BMP4）8,9,10,11,12,13,14,15使用BMP4将多能细胞转化为滋养层细胞的方法对人类细胞具有特异性，且被广泛用于研究早期人类胎盘的发育，因为该方法无需使用早期人类胚胎。9,16最近发现，添加抑制剂 A83-01（A）和 PD173074（P）可阻断 SMAD2/3 和 MEK1/2 信号通路，从而提高人多能干细胞向滋养外胚层样前体细胞（主要为合体滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞）分化的效率，且不会大量生成中胚层、内胚层或外胚层细胞9,17在这些培养条件下，人胚胎干细胞经12天分化后，其基因表达谱与从人类囊胚期胚胎中分离的滋养外胚层细胞相似，并分泌多种胎盘特异性生长激素，支持该方法的有效性 体外 模型系统9,11在此，我们提供了一种详细的方案 体外 利用BMP4/A/P培养基将人多能干细胞（hPSCs）分化为人类滋养层祖细胞。该条件可产生大量细胞，适用于多种应用，包括RNA测序、利用siRNA进行基因敲除、病原体感染实验以及通过脂质体转染介导的遗传修饰。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>本方案中将其称为 &quot;血清替代物&quot;。</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>分散酶</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>经辐照的 CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs 可从胚胎第13.5天的胚胎中分离并进行辐照处理。</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i 低氧培养箱</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>任何可调节氧气浓度的组织培养用培养箱均可使用。</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol 用于提取总 RNA。</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>本方案中将其称为 &quot;细胞外基质&quot;。</td></tr></tbody></table>

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

胎盘是胚胎发生过程中最早发育的器官，对胚胎的存活至关重要。胎盘由多种滋养层细胞组成，这些细胞源自着床前胚泡的胚外滋养外胚层细胞。因此，由于在伦理和法律上对人类胚胎发生过程中的胚胎分离与操作存在限制，我们对人类胎盘早期分化事件的理解仍十分有限。人类多能干细胞（hPSCs）是研究人类发育的有力模型系统，也可被诱导分化 体外 分化为表达各类滋养层细胞标志物的滋养层细胞。本文介绍了一种利用骨形态发生蛋白4（BMP4）及Activin/Nodal信号通路抑制剂将人多能干细胞（hPSCs）分化为滋养层细胞的详细实验方案。该方法可生成多种类型的滋养层细胞，可用于siRNA转染以研究功能缺失表型，或用于病原体感染实验。此外，还可对hPSCs进行遗传修饰后再分化为滋养层前体细胞，以开展功能获得性分析。 体外 从人多能干细胞（hPSCs）出发生成人类滋养层细胞的分化方法克服了使用早期人类胚胎所面临的伦理与法律限制，该体系可用于多种应用，包括药物发现和干细胞研究。

人多能干细胞体外分化 概述
此 体外 分化方案始于在饲养层细胞（MEFs）上培养的未分化人胚胎干细胞，经一次传代后 transitioning 至无饲养层条件（图1A）。虽然本方案中描述的是hESCs的分化，但我们也成功应用此方案将hiPSCs分化为滋养层细胞。向细胞外基质的转移可去除大部分经照射处理的MEFs，而这些MEFs在需要纯度较高的人滋养层细胞群体的分析中是不理想的。未分化的hPSCs在细胞外基质上培养，并使用含B-FGF的CM培养基培养，直至细胞集落达到传代条件（约一周时间），以在诱导BMP4/A/P介导的分化前维持其多能状态。集落通过dispase消化为约50–100个细胞组成的细胞团块，并再次传代至包被有细胞外基质的培养板上。传代后次日，贴壁细胞即可用于启动分化，此时更换培养基为含BMP4/A/P但不含B-FGF的培养基。分化后的细胞持续增殖约两周，在此期间可收集细胞用于R...

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein 4）及Activin/Nodal信号通路抑制剂，从人多能干细胞高效生成人滋养层细胞的实验方案。该方法适用于人多能干细胞的高效定向分化，可获得大量细胞用于遗传学操作。

胎盘是胚胎发育过程中最先形成的器官，对发育中胚胎的存活至关重要。胎盘由……组成

本实验方案的总体目标是利用骨形态发生蛋白4（BMP4）以及活化素和Nodal信号通路抑制剂，将人类多能干细胞分化为人类滋养层细胞，以研究人类胎盘早期形成与功能的相关事件。该方法有助于解答滋养层细胞功能及其形成机制研究中的关键问题。该技术的主要优势在于能够大量生成滋养层细胞，适用于包括遗传学在内的多种应用，并可用于细胞功能检测。实验开始时，将一份细胞外基质在冰上解冻三至四小时。使用预冷的枪头、一个预冷的50毫升锥形管以及杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM F12培养基），将两毫克细胞外基质转移至24毫升预冷的DMEM F12培养基中。立即将50毫升锥形管放回冰上，并于4°C保存。为包被组织培养板，向6孔板的每个孔中加入1毫升稀释后的细胞外基质。轻轻摇晃培养板以使孔壁均匀包被，并在室温下孵育至少1小时。吸除新培养板中的细胞外基质，然后加入含bFGF的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEFCM）。使用移液器将刮取的细胞团块从 MEF 培养板转移至包被有细胞外基质的培养板中，并分装至各孔。随后将培养板放入培养箱孵育。每天更换 MEFCM 培养基时，用巴斯德吸管刮除已分化的细胞，并加入 2 毫升 bFGF 培养基至每孔。当在显微镜下观察到集落较大且明亮时，每六至七天传代一次人胚胎干细胞（hESCs）。当无饲养层细胞准备传代时，移除培养基，并用移液器加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS，然后用移液器加入0.5毫克/毫升预热的分散酶（dispase）。将细胞在37摄氏度下孵育五分钟。孵育结束后，通过每孔加入两毫升PBS洗涤细胞，然后吸除PBS。每孔加入一毫升CM，使用五毫升移液器的枪头手动将细胞刮下，使其形成小团块。接下来，将悬浮的细胞团块接种到新的细胞外基质包被的培养板中。配制分化培养基：使用不含bFGF的CM，并在使用前加入新鲜的抑制剂。将无饲养层的hESC接种于包被有细胞外基质的培养板中，在5%氧气浓度的培养箱内培养一代。在细胞接种至包被有细胞外基质的培养板后的24小时，让细胞充分贴壁。次日，弃去含bFGF的培养基，更换为含BMP4/A/P的培养基，每孔加入2 mL，使用六孔板进行培养以启动分化。继续在4%氧气浓度下培养细胞。每两天更换一次含有BMP4/A/P的CM，通过吸除旧培养基并加入含有BMP4/A/P的新培养基。在预定的时间点收集细胞。将hESCs从MEFs转移至含bFGF的hESC培养基中，并在细胞外基质上连续培养两代。高细胞融合度至关重要，因此应以1:1比例将hESCs传代至新培养板，以确保次日细胞融合度至少达到50%。将细胞置于低氧培养箱中过夜培养。第二天，将培养基更换为每孔2 mL的分化培养基。将细胞置于低氧培养箱中过夜。转染前，用0.1%明胶处理培养皿进行明胶包被。轻轻晃动培养皿使明胶均匀覆盖表面，然后在室温下静置。20分钟后，去除明胶。继续培养细胞至所需时间点进行分化。转染前一天，使用 0.05% 胰蛋白酶消化细胞 5 分钟。将细胞接种至明胶包被的培养板中，达到所需的汇合度。加入不含 bFGF 但含有 BMP4/A/P 的条件培养基，并在培养箱中孵育过夜。第二天，向细胞中加入新鲜的分化培养基。使用siRNA转染试剂转染siRNA。对于质粒DNA，使用适当的脂质体转染试剂。按照每种转染试剂的产品说明书进行操作。将siRNA脂质体复合物转移至每个细胞孔或细胞培养板中，并轻轻混匀。随后将细胞在低氧培养箱中培养过夜。第二天，将培养基更换为新鲜的分化培养基。在预期的时间点收集细胞，利用定量RT-PCR检测基因敲除效率。最后，收集细胞时，每孔加入一毫升0.05%胰蛋白酶，并将细胞放入培养箱中孵育。每孔加入5 mL MEF培养基以中和胰蛋白酶。在200 × g下离心5分钟，收集细胞沉淀用于RNA提取。采用该技术可明显观察到形态学变化。分化第一天的细胞比第零天的细胞更大。随着分化进行，细胞从菌落中心向外分裂并扩展生长。到分化第五天时，各个独立的菌落相互融合，细胞重叠生长。qRT-PCR 分析显示，当细胞在含有 BMP4 的培养基中培养并诱导分化一天后，多能性标志物 NANOG 的相对表达水平降低了 75%，而在 BMP4/A/P 存在的情况下则降低了 90%。到分化第二天时，与含有 bFGF 的 hESC CM 培养基相比，单独使用 BMP4 或 BMP4/A/P 培养的细胞中 NANOG 表达水平已非常低。在分化第一天和第三天，将 GFP 质粒转染至经 BMP4/A/P 处理的细胞中，转染后 24 小时的转染效率达到 30% 至 50%。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外将人类多能细胞分化为滋养层细胞，以及如何导入DNA构建体以调控基因表达。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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