体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

本实验方案的总体目标是利用骨形态发生蛋白4（BMP4）以及激活素和Nodal信号通路抑制剂，将人类多能干细胞分化为人类滋养层细胞，以研究人类胎盘早期形成与功能的相关事件。该方法有助于解答滋养层细胞功能及其形成机制研究中的关键问题。该技术的主要优势在于能够大量生成滋养层细胞，适用于包括遗传学在内的多种应用，并可用于细胞功能检测。

实验开始时，将一份细胞外基质在冰上解冻三至四小时。使用预冷的枪头、一个预冷的50毫升锥形管以及杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM F12培养基），将两毫克细胞外基质转移至24毫升冰冻的DMEM F12中。立即将50毫升锥形管放回冰上，并于4°C保存。

为包被组织培养板，向六孔板的每个孔中加入一毫升稀释后的细胞外基质。轻轻晃动培养板以使孔壁均匀包被，并在室温下孵育至少一小时。吸除新培养板中的细胞外基质，随后加入含bFGF的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEFCM）。

使用移液器将刮下的细胞团块从 MEF 培养板转移至包被有细胞外基质的培养板中，并分装至各孔。随后将培养板放入培养箱孵育。每天更换培养基时，先用巴斯德吸管刮除已分化的细胞，再加入 2 毫升新鲜培养基至每孔，替换原有的 MEFCM 培养基并补充 bFGF。

当在显微镜下观察到集落较大且明亮时，每六至七天传代一次人胚胎干细胞（hESCs）。当无饲养层细胞准备传代时，移除培养基，并用移液器加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS，然后用移液器加入0.5毫克/毫升预热的分散酶（dispase）。

将细胞在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，通过每孔加入2毫升PBS洗涤细胞，并吸除PBS。每孔加入1毫升CM，使用5毫升移液器的枪头手动将细胞刮下，使其形成小团块。

接下来，将悬浮的细胞团块接种至新的细胞外基质包被的培养板中。配制分化培养基：使用不含 bFGF 的 CM，并在使用前加入新鲜的抑制剂。

使用在细胞外基质包被的培养板上、于含5%氧气的培养箱中培养一代的无饲养层人胚胎干细胞。在细胞接种至细胞外基质包被的培养板后的24小时，让细胞贴壁。次日，通过移除含有bFGF的培养基，并更换为含有BMP4/A/P的培养基（每孔2毫升，六孔板）来启动分化。

继续在4%氧气浓度条件下培养细胞。每两天更换一次含有BMP4/A/P的CM，方法是吸除旧培养基，并加入含有BMP4/A/P的新培养基。在预定的时间点收集细胞。

将hESCs从MEFs转移至含bFGF的hESC培养基后，在细胞外基质上连续培养两代。高细胞汇合度至关重要，因此以1:1比例将hESCs传代至新培养板，以确保次日细胞汇合度至少达到50%。将细胞在低氧培养箱中孵育过夜。

第二天，将培养基更换为每孔2毫升的分化培养基。将细胞置于低氧培养箱中过夜。转染前，用0.1%明胶处理培养皿进行明胶包被。

轻轻晃动培养皿以使溶液均匀覆盖表面，然后在室温下静置。20 分钟后，去除明胶。继续培养细胞至所需的时间点进行分化。

转染前一天，使用 0.05% 胰蛋白酶消化细胞 5 分钟。将细胞接种至明胶包被的培养板中，达到所需的汇合度。加入不含 bFGF 但含有 BMP4/A/P 的条件培养基，并在培养箱中孵育过夜。

第二天，向细胞中加入新鲜的分化培养基。使用siRNA转染试剂转染siRNA。对于质粒DNA，使用适当的脂质体转染试剂。

按照每种转染试剂的产品说明书进行操作。将siRNA脂质体复合物转移至每个细胞孔或细胞培养板中，并轻轻混匀。随后将细胞在低氧培养箱中培养过夜。

第二天，更换为新鲜的分化培养基。在预期的时间点收集细胞，使用定量RT-PCR检测基因敲除效率。最后，收集细胞时，每孔加入1毫升0.05%胰蛋白酶，并将细胞放入培养箱中孵育。

每孔加入 5 毫升 MEF 培养基以中和胰蛋白酶。在 200 × g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀用于 RNA 提取。采用该技术可明显观察到形态学变化。

分化第一天的细胞比第零天的细胞更大。随着分化过程的进行，细胞从菌落中心向外分裂并扩展生长。到分化第五天，单个菌落相互融合，细胞彼此重叠生长。

qRT-PCR 分析显示，当细胞在含有 BMP4 的培养条件下进行分化培养一天后，多能性标志物 NANOG 的相对表达水平降低了 75%，而在 BMP4/A/P 存在的情况下则降低了 90%。到分化第二天时，与含有 bFGF 的 hESC CM 培养基中的细胞相比，单独使用 BMP4 或 BMP4/A/P 培养的细胞中 NANOG 表达水平已非常低。在分化第一天和第三天，将 GFP 质粒转染至经 BMP4/A/P 处理的细胞中，转染后 24 小时可达到 30% 至 50% 的转染效率。

观看本视频后，您应能充分理解如何在体外将人类多能细胞分化为滋养层细胞，以及如何导入DNA构建体以调控基因表达。