的发展 Metarhizium anisopliae作为防腐剂:从隔离到现场表现

不明智地使用合成杀虫剂不会对环境和人类健康构成持续威胁。使用细菌、病毒和真菌的生物防治是控制农业中不同害虫的合适替代方案。与细菌和病毒不同，昆虫病原体真菌通过接触有效。

Metarhizium 物种是最有效的昆虫病原体真菌之一。众所周知，它攻击 200 多种害虫。我们使用本地 Metarhizium 分离株的孢子开发了一种杀霉菌剂。

本视频将向您展示分离和鉴定当地真菌分离物的方案、用于筛选和选择更有效菌株的昆虫生物测定、选定 Metarhizium 菌株孢子的生产，以及为田间应用创建具有成本效益的杀霉菌剂配方的方案。还将强调在商业生产期间要采取的质量控制措施。昆虫病原真菌的分离可以通过三种方法完成。

首先，从土壤中。Metarhizium 是大多数土壤中天然存在的真菌。为了获得各种各样的分离物，需要收集来自不同作物种类的田地和相距甚远的地区的土壤。

土壤样本从地表以下 4 到 6 英寸处采集。现场样本收集在贴有标签的袋子中，然后在实验室中，每个样本 10 克转移到小瓶中。Metarhizium 通过土壤稀释板法分离。

将 10 克土壤样品转移至 90 ml 无菌 0.1% Tween 80 中。用磁力搅拌器将浆料搅拌 60 分钟。同时，制备 900 微升等分试样的 Tween 80 用于子状稀释。

液中的上清液现在以 Tween 80 等分试样连续稀释。将每个样品中的 100 微升等分试样涂在 Keller 等人描述的培养基上。将板在 28 度下孵育 3 至 7 天。

随后在同一培养基上对单个孢子菌落进行传代培养，以获得纯培养物。为了分离昆虫病原真菌，从田间收集死昆虫。通过将霉菌渣尸体的孢子转移到 Tween 80 中，然后通过涡旋来分离它们。

然后将孢子悬浮液在琼脂平板上划线。通过在同一培养基上进一步传代培养获得纯培养物。为了从土壤中诱饵昆虫病原真菌，使用了稻麦芽幼虫。

将 4 只稻麦芽幼虫加入装有 60 克土壤样品的小瓶中。小瓶在 28 度下孵育。这些幼虫通常会深入土壤中，因此每天将小瓶倒置长达 14 天，以促进与幼虫与土壤中的真菌孢子接触。

取出死去的幼虫，并在潮湿的培养箱中保存以形成孢子。分离真菌的过程与用于昆虫尸体的过程相同。获得纯培养物后，将分离物保持在 PDA 倾斜上，并将母培养物保持在 8 摄氏度直至使用。

为了鉴定真菌，从菌丝体生物量中提取基因组 DNA。用于鉴定 Metarhizium 分离物，使用的引物是 5 prime、3 prime、ITS1 和 ITS4。对预期大小的扩增子进行凝胶洗脱、定量和测序。

然后使用 NCBI GenBank 数据库检查序列，以鉴定分离株的物种水平。从印度马哈拉施特拉邦 Pune 和 Buldana 区收集的土壤样本和死虫给出了 68 种不同的 Metarhizium 分离株。其中，58 种是从土壤中分离出来的，10 种是从昆虫中分离出来的。

55 个是 Metarhizium anisopliae，8 个是 Metarhizium flavoviridae，5 个是 Metarhizium robertsii。将来自斜面的孢子加入10ml Tween 80中并涡旋。对于昆虫生物测定，使用血细胞计数器测量孢子计数。

并将计数调整为 10 增加到 ml 的 7 个孢子。将一组 30 只幼虫一式三份分别浸入每个 Metarhizium 分离物的 10 ml 孢子悬浮液中 5 秒钟。Helicoverpa armigera 的晚二龄或早三龄幼虫用于昆虫生物测定。

处理后，将每只幼虫转移到含有潮湿的 Whatman 一号滤纸和一块消毒秋葵作为饲料的无菌 vile 中。一组 30 只幼虫一式三份，用 0.1% Tween 80 在无菌蒸馏水中处理作为对照。幼虫被保存到死亡，并监测长达 14 天。

对所有 68 个分离株重复这些步骤。死亡率百分比是通过计算死幼虫和活幼虫来计算的。将死幼虫转移到含有大多数棉签的无菌培养皿中，并在 28 摄氏度和 70% 至 80% 相对湿度下保存 3 至 7 天，以预防蕈样病和孢子形成。

提取来自三个实验的死亡率百分比数据以获得平均值，然后使用 Abbott 公式进行校正。选择了 12 个死亡率超过 90% 的 Metarhizium 分离株来确定 Helicoverpa armigera 第三龄幼虫的中位致死时间。根据 LT 50 值，确定了 5 种杀死昆虫速度更快的分离株。

使用四种不同浓度的孢子悬浮液测定已鉴定的五种分离株的中位致死浓度。根据 LC 50 值，选择三种 Metarhizium 分离株通过固态发酵生产孢子。制备 YPD 培养基，并在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。

将来自斜面的孢子转移到 0.1% 吐温 80 中。将三种选定的 Metarhizium 分离株的孢子悬浮液添加到 YPD 培养基中。然后将培养瓶在摇床上孵育。

装满 2 公斤大米的可高压灭菌的 Unicorn 袋在 1 升蒸馏水中浸泡过夜，然后在 121 摄氏度下高压灭菌 45 分钟。在水稻、高粱、玉米和小麦等基质上测试了固态发酵。在测试的底物中，水稻支持Metarhizium 分离株的最大孢子形成。

袋子接种了 48 小时龄的 10% 菌丝体生物量。将其充分混合并孵育 14 天。孢子可以使用不同的方法收获。

对于使用 Mycoharvester 和 Vibrosifter 进行分离，将含有孢子菌丝体的袋子在 37 摄氏度下干燥两天，以将水分含量降低到 20% 以下液体提取是一种更有效的方法。将带有孢子的大米放入大容器中。将 0.1% 吐温 80 倒入容器中，充分搅拌混合物。

过滤上清液以去除任何大米颗粒。孢子浓缩并通过离心分离。然后将孢子在 37 摄氏度下干燥两天。

这些孢子可以在零下 80 摄氏度下储存直到使用。为了延长储存期间的保质期，添加滑石粉并与孢子混合。为了有效，孢子必须是活的，因此需要确定提供最大活孢子数量的分离物。

将孢子悬浮液制备在 0.1% 吐温 80 中，并将计数调整为 10 个，每毫升增加至 7 个孢子。将 10 微升孢子悬浮液一式三份铺在 PDA 载玻片上，然后孵育。在 12 小时内，活的孢子开始发芽。

12 小时后，在显微镜下对形成胚管的孢子进行计数。孢子的亲水性对于真菌粘附在昆虫角质层上很重要。将硫酸铵和 Tween 80 中的孢子悬浮液放入刮风管中。

另一个没有孢子的，被视为控制。将孢子悬浮液的数量调节至每毫升约7至10个孢子，以便在540纳米处获得0.6的初始吸光度。让刮刀不受干扰地放置约 6 小时以沉淀孢子。

记录吸光度并计算 50% 营养所需的时间。根据结果，选择了一个菌株进行田间应用。另外两个用作备用菌株。

选定的 Metarhizium 分离物 M34412 的孢子控制木豆作物上 Helicoverpa armigera 侵染的田间性能是在随机区组设计中进行的，有四次重复。有两种不同的喷雾配方。用背负式喷雾器喷洒 0.1% Tween 80 中的制剂。

孢子的油制剂用超低容量喷雾器喷洒。喷洒在早上或晚上进行。第一次喷洒在开花状态下进行，再重复两次，间隔 14 天。

在喷洒后第 0 天、第 3 天、第 5 天、第 7 天和第 14 天收集棉铃草，并保存在湿度室中以预防真菌病。在控制木豆中棉铃草的田间试验中，Metarhizium anisopliae M34412 获得了 70% 以上的疗效。与用化学农药处理的地块和未处理的对照地块相比，发现 Metarhizium anisopliae 处理地块中的豆荚损伤最小。

检查木豆叶是否因杀霉菌剂的柴油葵花籽油配方而受到任何影响。土壤栖息节肢动物和叶栖昆虫是从 Metarhizium anisopliae 处理的地块中收集的。未观察到对任何非目标节肢动物的有害影响。

示范试验在 doo-lally-pra-va-da 村进行，有 20 名农民参与。该配方对其他害虫有效，如油腻的切虫、斑点荚蛀虫、粉虱、羊毛蚜和蚊子。实验已经能够确定杀霉菌剂生产中的基本质量控制参数。

在 28 摄氏度和 70% 至 70% 相对湿度下 16 小时后，以孢子萌发量测量的孢子在 PDA 上的活力应超过 90%。Helicoverpa armigera 的死亡率应超过 90%，在实验室生物测定中，10 个孢子增加到 7 个孢子。在人工实验室培养基上反复传代培养时，生物体失去毒力。

在几丁质培养基中培养真菌 72 小时后，测量几丁质酶、几丁质脱乙酰酶、壳聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶等角质层降解酶的活性。这些是毒力的生化标志物。使用四组不同的 3 种限制性内切酶消化几丁质酶基因。

死亡率超过 90% 的分离株显示出所有 3 个基因的特定模式。这些模式与 Metarhizium 分离株在细胞外产生的角质层降解酶谱显著相关。我们首次提出将几丁质酶活性和几丁质酶基因的 PCR 模式作为毒力标志物。

这可以作为商业规模生产的质量指标。为了使产品更具成本效益，我们可以使用菌丝体生物质核心植物根部推广。它还可用于医疗保健应用的壳聚糖酶分离。

这种增值产品将使这种基于 Metarhizium 的杀霉菌剂更有利可图。