Name: 的发展 Metarhizium anisopliae作为防腐剂:从隔离到现场表现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 了解利用本土绿僵菌分离株开发真菌杀虫剂的方法，用于农业害虫防治。本研究展示了从分离鉴定到田间应用的完整流程，为可持续农业提供环保替代方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢印度新德里生物技术部与瑞士伯尔尼发展与合作署共同支持的印瑞生物技术合作项目（ISCB）中各位合作者的贡献。感谢参与真菌杀虫剂研发工作的项目学生及工作人员，包括 Vandana Ghormade、Pallavi Nahar、Priya Yadav、Shuklangi Kulkarni、Manisha Kapoor、Santosh Chavan、Ravindra Vidhate、Shamala Mane 和 Abhijeet Lande。EKP 感谢印度大学拨款委员会提供的研究奖学金，SGT 感谢印度科学与工业研究理事会（CSIR）提供的研究奖学金。MVD 感谢印度新德里工业与科学研究理事会通过名誉科学家计划提供的支持。作者感谢印度新德里生物技术部在 ISCB 和 SBIRI 项目下提供的经费支持。我们感谢审稿人所提出的宝贵意见。

1. 昆虫病原真菌的分离
<ol>
	<li>土壤稀释法
	<ol>
		<li>从不同农田采集土壤样品及僵虫（表1）。采用土壤稀释平板法分离土壤样品中的昆虫病原真菌8。 
		注：本研究中，样品采自印度马哈拉施特拉邦的浦那（18°31'13''N；73°51'24''E）和布尔达纳（19°58'36''N；76°30'30''E）地区。</li>
		<li>称取每份土壤样品10 g，分别加入90 mL无菌0.1%（w/v）吐温-80溶液中。</li>
		<li>使用磁力搅拌器充分搅拌样品60分钟，以释放附着在土壤颗粒上的孢子。</li>
		<li>搅拌后，取每份样品100–200 µL涂布于选择性培养基上，培养基成分（g/L）如下：蛋白胨10；葡萄糖20；琼脂18；链霉素0.6；四环素0.05；放线菌酮0.05；多菌灵0.1 mL；pH 7.09。将平板置于28 °C培养3–7天。</li>
		<li>挑取单个产孢菌落，在相同培养基上进行转接纯化，获得纯培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从僵虫中分离
	<ol>
		<li>从田间采集僵虫。 
		注：虫体坚硬的死虫通常由昆虫病原真菌感染所致；而细菌或病毒感染导致的死虫虫体较软。</li>
		<li>采集行为异常、运动不协调、抽搐的活虫。</li>
		<li>将采集的活虫饲养至死亡，随后转移至湿润培养盒中，在28 °C、70–80%相对湿度条件下继续培养，以促进可能的真菌感染和产孢。</li>
		<li>从产孢的僵虫体表刮取孢子，接种至上述选择性培养基上，并在同一培养基上连续转接2–3次，获得纯培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱饵法
	<ol>
		<li>在含有60 g土壤样品的小瓶（3.85 × 6.0 cm）中加入4头米蛾幼虫（Corcyra cephalonica），将小瓶置于25 ± 2 °C条件下培养14天。</li>
		<li>每天将小瓶倒置一次。14天后，检查土壤中是否存在被真菌感染的米蛾幼虫。从产孢僵虫上刮取孢子，接种至选择性培养基上，分离昆虫病原真菌。</li>
		<li>获得纯培养物后，将菌株转接至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面，于28 °C、70–80%相对湿度条件下培养7天，促进孢子形成。产孢完成后，将母种保存于8 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 昆虫病原真菌的鉴定
<ol>
	<li>通过观察形态特征鉴定昆虫病原真菌，（即， 无性孢子的大小和形状，以及分生孢子梗上孢子的排列方式）；3个主要属的分离物， 绿僵菌, 球孢白僵菌，以及 诺氏菌属，可以被识别。</li>
	<li>用于分子鉴定的 绿僵菌 菌株，使用DNA提取试剂盒从菌丝体生物量中提取基因组DNA；按照制造商的说明进行操作（参见 材料表). 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
	<ol>
		<li>PCR扩增ITS1-5.8S-ITS2和26S rDNA区域。以基因组DNA为模板，使用ITS1上游引物（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4下游引物（TCCTCCGCTTATTGATATGC）10.</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒对预期大小的扩增片段进行凝胶洗脱和纯化；按照制造商说明书操作（参见 材料表）定量纯化的扩增产物并进行测序。</li>
		<li>使用软件读取并编辑序列，对核苷酸序列在NCBI GenBank数据库中进行BLAST比对，以分析其高度同源性11.</li>
		<li>将鉴定出的昆虫病原菌分离物序列提交至NCBI GenBank数据库以获取登录号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 筛选 绿僵菌 对抗分离株 H. armigera
<ol>
	<li>昆虫饲养
	<ol>
		<li>通过从田间采集健康的 H. armigera 幼虫和蛹，建立初始种群。</li>
		<li>饲养时，将幼虫单独置于无菌聚丙烯小瓶（3.85 × 6.0 cm，50 mL 容量）中，瓶内放入经 0.5% (v/v) 次氯酸钠消毒 10 分钟的秋葵片段12。</li>
		<li>收集饲养过程中产下的昆虫卵，并用 0.5% (v/v) 次氯酸钠进行表面灭菌。</li>
		<li>将幼虫维持在 25 ± 2 °C 和 65 ± 5% 相对湿度（RH）条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>昆虫生物测定 
	注：在昆虫生物测定、孢子生产及田间表现研究中，除非另有说明，均使用从感染 Metarhizium 的 H. armigera 幼虫中分离得到的菌株的首次转接培养物。
	<ol>
		<li>进行昆虫生物测定时，使用 H. armigera 的三龄幼虫。</li>
		<li>将一组 30 头幼虫设三个重复，分别浸入 10 mL 的 Metarhizium 分离物孢子悬浮液中（1 × 107 孢子/mL，除非另有说明；活力 &#62; 90%）5 秒。</li>
		<li>处理后，将每头幼虫单独转移至无菌小瓶中以避免自相残食。每个小瓶中加入湿润的 Whatman 1 号滤纸和一块消毒过的秋葵作为饲料。每隔一天更换一次滤纸和饲料。</li>
		<li>将幼虫置于 25 ± 2 °C、65 ± 5% RH 及 16:8 光暗周期条件下培养 14 天，或直至其死亡。</li>
		<li>将死亡幼虫转移至含有湿润棉签的无菌培养皿中，置于 28 °C 和 70–80% RH 条件下培养 3–7 天，以促进菌丝和孢子在尸体表面形成。</li>
		<li>对照组处理：将一组 30 头幼虫设三个重复，用含 0.1% (w/v) Tween-80 的无菌蒸馏水处理。</li>
		<li>所有实验均使用新鲜配制的孢子悬浮液，设三个重复。收集并合并三次实验的死亡率数据，计算平均值。使用 Abbott 公式13计算校正死亡率。</li>
		<li>实验采用随机完全区组设计（RCBD），每个处理包含一组 30 头幼虫，设三个重复。根据对 H. armigera 的死亡率，筛选出表现最佳的 Metarhizium 分离物，用于进一步商业化生产的评估。</li>
		<li>选择对 H. armigera&#160;三龄幼虫致死率 &#62;90% 的分离物。 
		注：本研究中选出了 12 个分离物。</li>
		<li>测定这些分离物的 LT50，并选择杀虫速度最快（所需时间最短）的分离物。 
		注：从 12 个高效分离物中进一步筛选出 5 个。</li>
		<li>使用四种不同浓度的孢子悬浮液（即 1 × 103、1 × 105、1 × 107 和 1 × 109 孢子/mL），测定所选分离物的 LC50 值。</li>
		<li>测定 Metarhizium 分离物对 H. armigera 三龄幼虫的 LC50，以提高识别高死亡率分离物间毒力差异的可能性，若仅使用单一剂量，则此类差异可能被掩盖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于田间表现研究的Metarhizium菌株孢子的制备
<ol>
	<li>通过固态发酵（SSF）生产绿僵菌（Metarhizium）孢子
	<ol>
		<li>进行固态发酵（SSF）时，将 2 × 107 个绿僵菌（Metarhizium）分离株的孢子接种于 200 mL YPG 培养基（0.3% 酵母提取物、0.5% 蛋白胨和 1.0% 葡萄糖）中，制备接种物。将三角瓶置于 28 °C、180 rpm 摇床中培养 48 小时。</li>
		<li>为大规模生产孢子，采用固态发酵（SSF），以大米作为培养基质，除非另有说明。</li>
		<li>进行固态发酵（SSF）时，将 2 kg 大米装入灭菌袋（型号/14，带一个 0.5 µm 微孔滤膜，容量 2 kg，尺寸 64 × 36 cm），向袋中加入 1,000 mL 蒸馏水，浸泡过夜14。将装有浸湿大米的袋子在 121 °C 下高压灭菌 45 分钟15。</li>
		<li>用培养 48 小时的菌丝体接种物（接种量 10%，即每 2 kg 大米使用 200 mL）接种灭菌袋，在 28 °C、70–80% 相对湿度（RH）条件下培养 14 天。</li>
		<li>采用 0.1% Tween-80 溶液进行液体提取以收获孢子。具体操作为：将袋内内容物加入含 0.1% Tween-80 的溶液中（每 1 kg 大米使用 3 L），充分混匀，通过离心法将孢子与液体分离，随后在 37 °C 下干燥 2 天。</li>
		<li>或者，将含有孢子及部分菌丝的大米袋在 37 °C 下干燥 2 天，以降低水分含量（&#60;20%）。使用真菌收获机或振动筛分机收集孢子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孢子活力研究
	<ol>
		<li>采用不同方法测定收获孢子的活力百分比15。制备孢子悬浮液，溶剂为 0.1%（w/v）Tween-80，并将孢子浓度调整至 1 × 103 个孢子/mL。</li>
		<li>取 0.1 mL 孢子悬浮液，三份重复，均匀涂布于 PDA 平板上，在 28 °C、70–80% 相对湿度（RH）条件下培养 72 小时。</li>
		<li>人工计数独立菌落，计算相应样品的总活菌数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孢子沉降速率
	<ol>
		<li>为实现均匀施用剂量，需获得均一的孢子悬浮液；参照已有方法16测定不同绿僵菌（Metarhizium）分离株的孢子沉降速率。检测孢子在 0.2 M 硫酸铵和 0.1% Tween-80 中的沉降速率。</li>
		<li>将孢子悬浮液的浓度调整至约 7 × 107 个孢子/mL，使初始吸光度在 540 nm 处达到 0.6。将比色皿静置 6 小时，使孢子自然沉降。</li>
		<li>持续记录 6 小时内的吸光度变化。以百分比表示沉降速率，并计算 50% 孢子沉降所需时间（ST50）。使用新鲜配制的孢子悬浮液重复实验三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 所选材料田间性能研究 M. anisopliae 从分离到控制 H. armigera 在木豆中
<ol>
	<li>可湿性粉剂配方 M. anisopliae M 34412 孢子
	<ol>
		<li>将孢子与滑石粉混合，配制2.5–5%可湿性粉剂制剂。</li>
		<li>调整最终活菌数（TVC）至 1 x 1012 每千克制剂中的孢子数</li>
	</ol>
	</li>
	<li>田间性能研究 M. anisopliae M 34412 孢子
	<ol>
		<li>针对所选材料在田间表现的研究 M. anisopliae 分离以进行控制 H. armigera 在木豆中研究虫害发生情况，采用具有四个重复的随机区组设计（RCBD）。 
		注：此处实验在马哈特玛·普勒农业大学（MPKV），拉胡里（19.3927° N，74.6488° E）进行。</li>
		<li>使用两种不同的喷雾制剂，一种为孢子的油性制剂（5 x 1012 孢子/3升柴油：葵花籽油，7:3）以及含Tween-80（0.1%）的水剂配方。使用超低容量（ULV）喷雾器喷施油剂配方（70分钟；3升/公顷），使用背负式喷雾器喷施水剂配方（5 × 1012 孢子，500 L/ha。 
		注意：此处记录了喷洒前1天以及每次喷洒后3天和7天时5株随机选择植株上的幼虫种群数量。总种群数量经平方根转换（√(n + 1)）后用于统计分析。
		<ol>
			<li>根据木豆作物的农业实践，在产卵后10至15天进行第一次喷洒，之后每隔14天再喷洒两次。喷洒时间应选在印度标准时间16:00至18:00之间。监测风向，必要时使用布帘以防止孢子漂移到邻近试验地块。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>作为对照，使用手压式背负喷雾器喷洒化学杀虫剂。</li>
		<li>通过采集田间样本确定接种物的存留情况 H. armigera 喷洒后0、3、5、7和14天的幼虫</li>
		<li>将这些幼虫持续观察14天，死亡后转移至含有湿润滤纸的塑料小瓶中。在25 ± 2 °C和70 ± 10%相对湿度条件下培养，以观察真菌感染情况。</li>
		<li>根据喷洒后从田间采集的幼虫死亡率数据，确定接种物在幼虫种群中的持效性。</li>
		<li>根据田间试验的防治效果百分率进行评价17豆荚损伤百分率和产量百分率18. 
		注：此处的参数数据，如温度、湿度、风速（km/h）、日照时数（h）、降水量（mm）、降雨天数和蒸发量（mm），是在一所农业大学（Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth，Rahuri，19.3927° N，74.6488° E）进行试验期间记录的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>农民参与式项目
	<ol>
		<li>选择进行示范试验的农户数量。向农户提供木豆种子（BSMR-736）及肥料。 
		注：本研究共涉及20名农民。村庄：Deolali Pravara（19.473° N，74.6° E）。</li>
		<li>使用与步骤5.2中相同的喷雾制剂和喷雾次数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 对非靶标生物的影响
<ol>
	<li>观察杀真菌杀虫剂喷雾对木豆叶片的任何影响。</li>
	<li>在每次处理后的1天，分别从未经处理的样地和经过处理的样地中采集土壤中的节肢动物以及栖息在叶片上的昆虫 M. anisopliae.</li>
	<li>用药剂处理后24小时内，用陷阱法采集土壤中的节肢动物，并于处理后的次日上午，用扫网法采集栖息在叶片上的昆虫。即， 处理后约15-18小时）。</li>
	<li>将它们分别置于直径3.5 cm、高4.0 cm的圆柱形塑料盒中。每天检查昆虫的感染情况，并提供适当的食物喂养。</li>
	<li>记录以下项目的存在情况 M. anisopliae（如有可能）分离真菌。</li>
</ol>
7. 质控参数的确定
<ol>
	<li>通过在PDA培养基上于28 °C条件下测定孢子萌发率来检查孢子活力。</li>
	<li>测定菌株在YPG和几丁质培养基中产生的角质层降解酶活性，如几丁质酶、几丁质脱乙酰酶、壳聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶，方法如前所述15。</li>
	<li>在实验室生物测定中确定对H. armigera的致死率15。</li>
	<li>使用分子标记，如几丁质酶（Chit 1、2 和 4）和蛋白酶（Pr1A）基因的PCR-RFLP图谱，作为M. anisopliae的毒力特征。
	<ol>
		<li>使用DNA提取试剂盒从菌丝体生物量中提取基因组DNA15。以基因组DNA为模板，采用引物对Chit1F/Chit1R（CTCTGCAGGCCACTCTCGGT/AGCCATCTGCTTCCTCATAT）和Chit2F/Chit2R（GACAAGCACCCGGAGCGC/GCCTTGCTTGACACATTGGTAA）扩增Chit1和Chit2基因片段。对于Chit4，使用引物对Chit4F/Chit4R（ATCCGGCAGCACGGCTAC/CTTGGATC CGTCCCAGTTG）。</li>
		<li>扩增Pr1A基因时，使用METPR2和METPR5引物对（AGGTAGGCAGCCAGACCGGC/TGCCACTATTGGCCGGCGCG）。</li>
		<li>使用BsaJI、BstUI和ScrFI对Chit1基因进行限制性酶切19；使用AluI、HpyCH4IV和HpyCH4V对Chit2基因进行酶切；使用BstUI、HaeIII和MboI对Chit4基因进行酶切。对Pr1A&#160;基因的酶切则使用RsaI、DdeI和MspI20。</li>
		<li>通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶上观察各基因在高毒力菌株（&#62;90%致死率）中的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱；该图谱可作为筛选M. anisopliae毒力菌株的分子标记。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pesticides+use+in+agriculture%3A+their+benefits+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.</a> Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).</li>
<li>Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. <a target="_blank" href="http://www.indianjournals.com/ijor.aspx?target=ijor:ije&volume=77&issue=2&article=012">Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario.</a> Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).</li>
<li>Popp, J., Peto, K., Nagy, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13593-012-0105-x">Pesticide productivity and food security. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).</li>
<li>van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Lenteren%2C+JC+%22Integrated+pest+and+disease+management+in+greenhouse+crops%22">Integrated pest and disease management in greenhouse crops</a>. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).</li>
<li>Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnley%2C+AK+%22The+Mycota+IV%3A+Environmental+and+Microbial+Relationships%22">The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships</a>. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).</li>
<li>Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. <a target="_blank" href="null">Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests</a>. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).</li>
<li>Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Frontiers+in+industrial+mycology%22">Frontiers in industrial mycology</a>. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).</li>
<li>Goettel, M., Inglis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780124325555">Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023646207455">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+TJ+%22PCR-Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR-Protocols: A guide to methods and applications</a>. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).</li>
<li>Basic Local Alignment Search Tool. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST </a> (2017).</li>
<li>Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022201175902943">Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans.</a> J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).</li>
<li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A method for computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).</li>
<li>Nahar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+biocontrol+agents+for+the+control+of+pests+in+agriculture+using+chitin+metabolism+as+target%22">Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target</a>. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137(2004).</li>
<li>Kulkarni, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150802366475?journalCode=cbst20">Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea.</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).</li>
<li>Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m97-004#.WNVDdDvyuUk">Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation.</a> Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Henderson, C. F., Tilton, E. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/48/2/157/2205826/Tests-with-Acaricides-against-the-Brown-Wheat-Mite?redirectedFrom=fulltext">Tests with acaricides against the brow wheat mite.</a> J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).</li>
<li>Hassani, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+proving+of+biocontrol+methods+based+on+Bacillus+thuringiensis+and+entamopathogenic+fungi+against+the+cotton+pests+Spodoptera+littoralis%2C+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+and+Aphis+gossypii+%28Homoptera%3A+Aphididae%29%22">Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)</a>. , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).</li>
<li>Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19682457">PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae.</a> J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).</li>
<li>Bidochka, M. J., Melzer, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11142404">Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains.</a> Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).</li>
<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

19世纪80年代，首次尝试利用Metarhizium防治鳃金龟Anisoplia austriaca以及甜菜象甲Cleonis punctiventris21。在该方案中，一个先决条件是从土壤或感病昆虫中分离出具有强毒力的菌株。事实上，其他参数如LC50、LT50和ST50也显著影响产品的成本效益22,23。为了优化孢子的生产，需在孢子数量、存活率和毒力之间维持一种精细的平衡24。
由于农业属于高产量、低成本的产业，孢子的质量认知度、终端用户的可接受性以及货架期是主要关注点。宿主特异性有助于避免对非靶标生物产生影响14。避免在人工培养基上反复继代培养，并偶尔通过昆虫宿主传代，可维持绿僵菌（Metar...

自20世纪40年代在印度引入有机氯农药以来，农药的使用量已增长了数倍1，而农作物害虫每年仍因农业产量损失造成数十亿卢比的经济损失2。合成农药的广泛且非合理使用持续对环境和人类健康构成威胁1。农药的滥用导致土壤中残留物积累，并使害虫的天然天敌减少。此外，它还对害虫种群施加强大的选择压力，促使其遗传结构发生改变，从而导致抗药性的产生1。尽管绿色革命带来了巨大效益，但其高度依赖化肥和农药等投入品；即便如此，害虫仍是农业生产中主要的生物限制因素。据普遍估计，印度每年记录的农作物损失约为120亿美元2，全球则高达2万亿美元3。
当化学杀虫剂在用于控制害虫时产生有害影响时，寻找生态友好、可靠、经济且可持续的替代方法就变得至关重要。生物防治提供了一种合适的替代方案，包括利用寄生生物、捕食性生物以及微生物病原体4。例如，真菌已知可感染多种昆虫害虫，包括鳞翅目、膜翅目、鞘翅目和双翅目昆虫，常引发自然流行病。此外，与其他细菌性和病毒性昆虫控制剂不同，昆虫病原真菌的作用方式为接触性感染5。这类真菌包含100多个属的异质性类群，已在不同昆虫中报道约750个物种。重要的真菌病原体包括：Metarhizium sp.、Beauveria sp.、Nomuraea rileyi、Lecanicillium lecanii 和 Hirsutella sp. 等6。M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin 是生物防治中应用最广泛的第二种昆虫病原真菌，已知可侵染超过200种昆虫7。
本研究介绍了利用M. anisopliae进行基于知识的真菌杀虫剂开发所涉及的不同阶段，包括：1）寻找强毒力昆虫病原真菌的来源（即土壤或感病昆虫），2）昆虫病原真菌的鉴定与筛选，3）在实验室生物测定及田间条件下维持其毒力和有效性的策略，4）感染性繁殖体的低成本制剂开发，5）针对强毒力制剂建立独特的质量控制参数，以及6）生物勘探与附加值提升。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>试剂</td></tr><tr><td>硫酸铵&amp;nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>试剂</td></tr><tr><td>DNA分析仪&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem</td><td>ABI prism 3730&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>仪器</td></tr><tr><td>DNA提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>试剂</td></tr><tr><td>多菌灵</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>试剂</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>试剂</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Knapsac 喷雾器</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>仪器</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>聚丙烯小瓶&amp;nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>塑料器皿</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）&amp;nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>吐温-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>试剂</td></tr><tr><td>超低容量喷雾器</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Unicorn袋&amp;nbsp;</td><td>Unicorn</td><td>UP-140024-SMB</td><td>SSF用可高压灭菌袋</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>软件</td></tr></tbody></table>

发展 绿僵菌 作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

开发商业真菌杀虫剂时，一个主要问题是其杀虫速度相较于化学杀虫剂较慢。因此，分离和筛选具有快速作用且高毒力的昆虫病原真菌是关键步骤。昆虫病原真菌，例如 绿僵菌，白僵菌， 和 诺穆雷亚，通过接触起效，比 苏云金芽孢杆菌 或核型多角体病毒（NPV），该病毒必须被害虫摄入。在本研究中，我们分离出68 绿僵菌 采用土壤稀释与诱饵法从感染昆虫中分离菌株。通过扩增并测序ITS1-5.8S-ITS2和26S rDNA区域对分离菌株进行鉴定。其中毒力最强的菌株为 Metarhizium anisopliae 基于中位致死浓度（LC50）和时间（LT50在针对三龄幼虫的昆虫生物测定中获得的结果 棉铃虫 采用固态发酵法（SSF），以大米为底物，对所选菌株进行孢子的大规模生产，发酵周期为14天。使用0.1%吐温-80从产孢生物量中提取孢子，并制备不同剂型的孢子制剂。对这些制剂开展了田间试验，用于防治 H. armigera 采用随机区组设计在木豆上进行害虫防治试验。油基和水基制剂的防治效果分别为78.0%和70.9%，优于化学杀虫剂的63.4%。

在研究过程中，不同的菌株 绿僵菌，白僵菌，以及 球孢虫草属 通过多种分离方法进行分离（数据未显示）6,14 作为 绿僵菌 菌株在控制方面效果更佳 H. armigera一种豆类作物的严重害虫6,14，进一步的分离旨在分离 绿僵菌 来自不同农田和昆虫的菌株（表1。总计68 绿僵菌 通过培养特征、形态特征以及ITS 1-5.8S-ITS 4测序对获得的分离株进行鉴定。根据 &#62;90%死亡率 H. armigera 在实验室生物测定中，12 绿僵菌 分离物进一步检测了孢子产生能力、存活率、LC50，LT50和 ST50. 表 2 描...

本文报道了基于知识开发高效真菌杀虫剂所涉及的不同阶段，包括分离、鉴定、筛选和选择最适昆虫病原真菌——金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae），用于防治农业害虫。

开发商业真菌杀虫剂时，一个主要问题是其杀虫速度与化学杀虫剂相比如何。因此，分离和……

不合理地使用合成农药持续威胁着环境和人类健康。利用细菌、病毒和真菌进行生物防治是控制农业中多种害虫的合适替代方法。与细菌和病毒不同，昆虫病原真菌可通过接触发挥作用。绿僵菌属是杀虫效果最好的昆虫病原真菌之一，已知可侵染200多种害虫。我们利用本土绿僵菌分离株的孢子开发了一种真菌杀虫剂。本视频将为您展示分离和鉴定本地真菌分离物的实验方案、利用昆虫生物测定法筛选和选择高效菌株、选定的绿僵菌菌株孢子的生产，以及制备适用于田间应用的低成本真菌杀虫剂的方案。同时还将重点介绍在商业化生产过程中应采取的质量控制措施。昆虫病原真菌的分离可通过三种方法进行。首先，从土壤中获取。绿僵菌是一种在大多数土壤中自然存在的真菌。为了获得多种多样的分离株，需采集来自不同作物类型田地以及地理上相距较远地区的土壤样本。从地表以下四到六英寸处采集土壤样品。田间样品收集于标记好的袋子中，随后在实验室中将每份样品的10克转移至小瓶中。采用土壤稀释平板法分离绿僵菌（Metarhizium）。将10克土壤样品转移至90毫升无菌0.1%吐温80溶液中。使用磁力搅拌器将悬液搅拌60分钟。同时，准备若干份900微升的吐温80溶液，用于后续梯度稀释。将浆液的上清液在吐温80等分试样中进行连续稀释。从每个样品中取100 µL等分试样，涂布于Keller等人描述的培养基上。平板在28 °C下培养3至7天。将单个产孢菌落转接至相同培养基上进行继代培养，以获得纯培养物。为分离昆虫病原真菌，从田间采集死亡昆虫。通过将虫尸上的孢子转移至吐温80溶液中并涡旋振荡，从而分离孢子。将孢子悬液划线接种于琼脂平板上。通过在同一培养基上进一步转接培养获得纯培养物。为从土壤中诱捕昆虫病原真菌，使用大米麦芽幼虫作为诱饵。将四只米曲霉幼虫加入含有60克土壤样品的小瓶中。将小瓶在28摄氏度下进行培养。这些幼虫通常会向土壤深处移动，因此每天将小瓶倒置一次，持续最多14天，以促进幼虫与土壤中的真菌孢子接触。定期取出死亡的幼虫，置于湿度培养箱中进行产孢。真菌的分离过程与昆虫尸体的分离方法相同。获得纯培养物后，将分离物保存在PDA斜面培养基上，母代培养物则在8摄氏度下保存至使用前。为了鉴定真菌，从菌丝生物量中提取基因组DNA。鉴定绿僵菌分离物时所用引物为5'端、3'端、ITS1和ITS4。将预期大小的扩增产物通过凝胶电泳回收，定量后进行测序。随后利用NCBI GenBank数据库对序列进行比对，以确定分离物的物种水平分类。来自印度马哈拉施特拉邦浦那和布尔达纳地区的土壤样品及采集的死亡昆虫共获得68株不同的绿僵菌（Metarhizium）分离物。其中，58株从土壤中分离，10株从昆虫中分离。55株为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae），8株为黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviridae），5株为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）。将斜面培养物中的孢子加入10 ml吐温80（Tween 80）中并涡旋混匀。进行昆虫生物测定前，使用血细胞计数板测定孢子浓度。将孢子浓度调整至每毫升10的7次方个。每组30头幼虫，设三个重复，分别在10 ml各分离株的孢子悬浮液中单独浸渍5秒。昆虫生物测定采用棉铃虫（Helicoverpa armigera）的晚期二龄或早期三龄幼虫。处理后，将每条幼虫转移至含有湿润的Whatman一号滤纸和一片消毒秋葵作为饲料的无菌小瓶中。以三组重复、每组30条幼虫，用含0.1% Tween 80的无菌蒸馏水处理作为对照。幼虫饲养至死亡，并持续观察长达14天。对全部68个分离株重复上述步骤。通过统计死亡和存活的幼虫数量计算死亡率。将死亡的幼虫转移至含有适量棉拭子的无菌培养皿中，置于28摄氏度、70%至80%相对湿度条件下培养3至7天，以观察真菌感染（mycosis）及产孢情况。三项实验的死亡率数据被汇总，以获得平均值，然后使用Abbott公式进行校正。选择其中死亡率超过90%的12个绿僵菌分离株，用于测定其对棉铃虫（Helicoverpa armigera）三龄幼虫的半数致死时间（LT50）。根据LT50值，筛选出5个杀虫速度较快的分离株。通过使用四种不同浓度的孢子悬浮液，测定所鉴定的五种分离物的半数致死浓度。根据LC50值，选择三种绿僵菌分离物进行固态发酵产孢。YPD培养基配制后，在121摄氏度下高压灭菌20分钟。将斜面培养物中的孢子转移至0.1%吐温80溶液中。将三种选定的绿僵菌分离株的孢子悬浮液加入YPD培养基中。随后将三角瓶置于摇床中培养。将装有两公斤大米的可高压灭菌独角兽袋在1升蒸馏水中浸泡过夜，然后在121摄氏度下高压灭菌45分钟。已测试大米、高粱、玉米和小麦等基质上的固态发酵。在所测试的基质中，大米最有利于绿僵菌分离株的产孢。将培养48小时、含量为10%的菌丝体生物量接种至袋中。充分混匀后，在培养条件下孵育14天。孢子可通过不同方法进行收集。使用 Mycoharvester 和 Vibrosifter 进行分离时，将含有孢子化菌丝体的袋子在 37 摄氏度下干燥两天，以使水分含量降低至 20% 以下。液体提取法是一种更高效的方法。将带有孢子的米粒放入大型容器中，加入 0.1% Tween 80，充分搅拌混合物。将上清液过滤以去除任何米粒。通过离心浓缩并分离孢子。然后将孢子在37摄氏度下干燥两天。这些孢子可在负80摄氏度下保存至使用。为延长储存期间的保质期，可添加滑石粉并与孢子混合。为确保有效性，孢子必须具有活性，因此需要鉴定出能产生最多活性孢子的分离株。将孢子悬液制备于0.1%吐温80溶液中，并调整浓度至每毫升含10^7个孢子。取10微升孢子悬液，重复三次接种于PDA载片上，随后进行培养。12小时内，有活力的孢子开始萌发。12小时后，在显微镜下计数形成芽管的孢子。孢子的亲水性对于真菌黏附于昆虫表皮至关重要。取含硫酸铵和吐温80的孢子悬浮液于血细胞计数板中。另一份不含孢子的样品作为对照。将孢子悬浮液的浓度调整至每毫升约七乘以十的七次方到十的七次方个孢子，以获得在540纳米处初始吸光度为0.6的结果。将比色皿静置约六小时，使孢子充分沉降。记录吸光度，并计算50%消化所需的时间。根据实验结果，选择其中一株菌进行田间应用，另外两株作为备用菌株。采用随机区组设计，设置四个重复，对选定的金龟子绿僵菌分离株M34412的孢子在控制豇豆作物上棉铃虫（Helicoverpa armigera）侵染的田间表现进行了评价。试验使用两种不同的喷雾制剂，其中含0.1% Tween 80的制剂采用背负式喷雾器进行喷施。将孢子的油剂配方使用超低容量喷雾器进行喷洒。喷洒时间选择在早晨或傍晚进行。首次喷洒在开花期进行，之后每隔14天重复喷洒，共重复两次。在喷洒后第0、3、5、7和14天采集棉铃虫（Helicoverpa armigera），并将其置于湿度培养箱中以诱导真菌感染。在鹰嘴豆田间试验中，采用金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae M34412）防治棉铃虫的效果超过70%。与化学农药处理区及未处理对照区相比，经金龟子绿僵菌处理的小区中豆荚受害程度最低。检查木豆叶片是否受到虫生真菌杀虫剂中柴油-葵花籽油配方的任何影响。从施用金龟子绿僵菌的地块中采集了土壤中的节肢动物和栖息在叶片上的昆虫。未观察到对任何非靶标节肢动物产生有害影响。示范试验在一个名为doo-lally-pra-va-da的村庄进行，共有20名农民参与。该制剂对其他害虫如黏虫、斑点豆荚螟、粉蚧、绵蚜和蚊子等也具有防治效果。通过实验已成功确定了真菌杀虫剂生产过程中关键的质量控制参数。孢子在28摄氏度及70%至80%相对湿度条件下，在PDA培养基上培养16小时后，以孢子萌发率测定的活力应高于90%。在实验室生物测定中，每107个孢子对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的致死率应超过90%。在人工实验室培养基上连续传代培养时，该生物体会丧失其毒力。将真菌在含几丁质的培养基中培养72小时后，测定几丁质酶、几丁质脱乙酰酶、壳聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶等角质降解酶的活性。这些酶可作为毒力的生化标志物。采用四组不同的三种限制性内切酶组合，用于几丁质酶基因的消化。致死率超过90%的菌株在全部三个基因上均表现出特异性条带模式。这些模式与绿僵菌菌株胞外产生的几丁质降解酶谱具有显著相关性。本研究首次提出，几丁质酶活性及几丁质酶基因的PCR条带模式可作为毒力标记。这可作为工业化生产的质量指标。为了提高产品的成本效益，我们可以利用菌丝体生物量促进植物根系生长。此外，还可用于分离壳聚糖酶，应用于医疗健康领域。这些增值产品将提高基于绿僵菌的真菌杀虫剂的盈利能力。

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

的发展<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt;作为防腐剂：从隔离到现场表现

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus...

将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio...

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

昆虫病原真菌作为农业害虫的生物防治制剂，其重要性日益凸显。本研究利用农业谷物产品，成功实现了对两种南非分离的Metarhizium robertsii和M.

昆虫病原真菌 Metarhizium robertsii 和 Metarhizium pinghaense 的大规模生产及其在防治害虫中的商业应用

从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC...

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

本方案介绍了一种优化的离体叶片生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜（Lipaphis erysimi...

评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

本文介绍了一种从森林钻蛀性害虫中分离昆虫病原真菌的实验方案，并提供了一种利用鞘翅目模式昆虫评估其昆虫病原活性的替代方法。该方法对于在天然林中挖掘和研究钻蛀性害虫来源的昆虫病原真菌资源具有高效性和便利性。...

从森林木蛀虫中分离、行为鉴定及昆虫病原真菌致病性评估

湖泊富营养化是全球范围内的水质问题，因此识别和控制营养源至关重要。通过实验室测定沉积物柱芯中磷的释放速率，是评估内源性磷负荷作用并指导管理决策的有效方法。...

湖泊沉积物中实验室测定的磷通量作为内源性磷负荷的度量

本文介绍了一种全面的实验方案，用于评估偏远海洋环境中有机和无机营养物质的可利用性，以及微生物和病毒群落的丰度与结构。...

揭开海洋中看不见的参与者——水化学与海洋微生物学野外指南

本文详细介绍了利用商业性等鞭金藻（Isochrysis）生产生物柴油并同时共分离高价值副产物烯酮的方法。...

从商业等鞭藻（Isochrysis）藻类生物质中制备生物柴油并联产烯酮的实验方案

评估作物中节肢动物的丰度对于研究种群动态和物种相互作用至关重要。本文介绍了对叶片吹吸机进行改造并将其应用于水稻田节肢动物的吸捕取样方法。...

叶吹式吸虫器的改装及其在节肢动物野外采样中的应用

了解利用本土绿僵菌分离株开发真菌杀虫剂的方法，用于农业害虫防治。本研究展示了从分离鉴定到田间应用的完整流程，为可持续农业提供环保替代方案。

发展绿僵菌作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

探索更多视频

发展 绿僵菌 作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

探索更多视频

发展绿僵菌作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现