Name: Système defficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire Mycobacterium tuberculosis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez un système de criblage à haut débit pour identifier des inhibiteurs de Mycobacterium tuberculosis intracellulaire. Cette méthode par bioluminescence évalue l'efficacité et la cytotoxicité sur macrophages humains.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l’Association pulmonaire de la Colombie-Britannique et Mitacs.

1. La souche bactérienne et la croissance moyenne <ol><li> Faire dextrose albumine et solution de réserve de sel (ADS) en solubilisant 25 g d&#39;albumine de sérum bovin, 10,0 g de dextrose et 4,05 g de chlorure de sodium dans 460 ml d&#39;eau déminéralisée. Filtre-stériliser l&#39;ADS et stocker à 4 ° C. </li><li> Ajouter le bouillon 7H9 en ajoutant 4,7 g de poudre 7H9 et 2 ml de glycerol à 900 mL d&#39;eau purifiée. Autoclaver le bouillon 7H9 à 121 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à la température ambiante avant de procéder. Faire 7H9ADST en ajoutant 100 ml d&#39;ADS et 0,5 ml de Tween80 à 900 ml de bouillon 7H9. Conserver à 4 ° C. </li><li> Peser 50 mg de sulfate de kanamycine et on dissout dans 1 ml d&#39;eau déminéralisée; la concentration finale est de 50 mg / mL. Filtre-stériliser et stocker à -20 ° C. Ajouter 0,5 ml de kanamycine solution mère par 1 L de 7H9ADST. NOTE: Ce milieu doit être frais, si les volumes échelle appropriée en fonction de la taille de la culture. </li><li> Cultivez M. tuberculosis dans 7H9ADST complété par la kanamycine dans la culture debout. Secouez la culture quotidienne et diluer avant la DO600 atteint 1,0 pour éviter agglomérante. NOTE: La souche de M. tuberculosis utilisé pour le développement de cette méthode a été H37Rv transformée avec le plasmide pJAK2.A 12. pJAK2.A est un plasmide intégratif sur la base du vecteur pMV361, qui permet l&#39; expression de haut niveau du gène de la luciférase de luciole à partir du promoteur hsp60 et peut être sélectionné en utilisant la kanamycine. </li></ol> 2. THP-1 moyen et entretien <ol><li> Ajouter 50 ml de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 5 mL de 200 mM de L-glutamine à 500 ml de RPMI 1640 à faire milieu RPMI incomplète (environ 10% de FBS et 2 mM de glutamine). </li><li> Maintenir une culture de cellules THP-1 selon le protocole standard 13. En bref, cultiver les cellules THP-1 dans du milieu RPMI incomplète, tout en maintenant une densité de cellules de 0,2 à 1 million par ml de milieu entre les passages. </li></ol> 3. Intracellulaire à haut débit utilisant le dépistage Luciferase exprimant M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Mesurer la densité optique d&#39;une suspension de bactéries en croissance active dans un spectrophotomètre à une longueur d&#39;onde de 600 nm. Calculer la densité bactérienne en utilisant le facteur de conversion de 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bactéries par ml. </li><li> Pipeter les bactéries suffisantes pour une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 10: 1 dans un nouveau tube de centrifugation. Pellet à 3000 xg pendant 10 min et aspirer le liquide. Ajouter 50 pi de sérum humain à 450 pi de RPMI1640. Échelle du volume à des valeurs appropriées pour l&#39;expérience. </li><li> Pour opsoniser les bactéries, resuspendre le culot à une densité de 1 x 10 8 bactéries par 500 ul de RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain. Laisser le mélange à incuber à 37 ° C pendant 30 min. Déterminer la densité de la culture de cellules THP-1 par comptage avec un hémocytomètre et un microsco inversépe. </li><li> Pellet les cellules dans des tubes de centrifugation stériles à 100 xg et 37 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du RPMI incomplète à une densité de 1 million de cellules par ml. Ajouter phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) à une 40 ng / ml concentration finale. NOTE: Ce sera appelée mélange de différenciation. </li><li> Moissonneuse opsonisé M. tuberculosis avec le mélange de la différenciation de THP-1 à une MOI de 10: 1 et aliquoter le mélange final à 100 ul par puits dans une plaque blanche à 96 puits à fond plat. agiter régulièrement le mélange pour assurer l&#39;uniformité. Permettent la différenciation et de l&#39; infection à dérouler pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Laver les puits deux fois avec 100 ul de RPMI chacun. Ajouter composés dilués aux concentrations souhaitées dans du RPMI incomplète et incuber pendant 3 jours. </li><li> Aspirer le milieu des puits. Ajouter 50 ul de réactif de dosage de luciférase à chaque puits. Sceller les plaques avec tscellants de plaques adhésives ransparent. Laisser 5 min d&#39;incubation à 22 ° C, puis obtenir une lecture dans un luminomètre à 1 s par puits. </li></ol> 4. Analyse de cytotoxicité L&#39; utilisation d&#39; un acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) Dosage 14 <ol><li> Différencier les cellules THP-1 dans du milieu RPMI additionné de 40 incomplète ng / ml de PMA en clair des plaques à 96 puits. Maintenir une densité cellulaire de 1 million par ml et aliquote de 100 pi par puits. Permettre une différenciation de procéder pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Aspirer le milieu des puits et les laver deux fois avec du RPMI 1640. Ajouter composés dilués dans du RPMI incomplète dans les puits. Incuber pendant 3 jours. </li><li> Dissoudre 0,5 g de MTT pour constituer une solution mère de 5 mg / mL 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Filtre stérile et conserver à -20 ° C, à l&#39;abri de la lumière; il est préférable de faire de cette nouvelle solution. </li><li> 2,5 h BÉFORe la fin de la période d&#39;incubation de 3 jours, ajouter 25 ul de solution de MTT à chaque puits et terminer la période d&#39;incubation. </li><li> Préparer N 50%, N - diméthyl formamide (DMF) en mélangeant 250 ml de DMF avec 250 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Préparer du tampon d&#39;extraction MTT comme suit: Peser 100 g de SDS dans une bouteille de 500 ml et ajouter 300 ml de DMF à 50%. Appliquer à feu doux pour permettre au SDS de se dissoudre. Ajouter 10 ml d&#39;acide acétique pur et 12,5 ml de 1 M HCl. Remplir jusqu&#39;à la marque de 500 ml avec 50% de DMF; la composition finale du tampon d&#39;extraction est de 50% de DMF, 20% de SDS, 2,5% d&#39;acide acétique, et de 2,5% 1 M d&#39;acide chlorhydrique. </li><li> A la fin de la période de traitement, ajouter 100 ul de tampon d&#39;extraction (réchauffé à 45 ° C pour dissoudre tous les cristaux) dans chaque puits. Laisser le mélange à incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. Lire l&#39;absorbance à 570 nm. NOTE: Le test de cytotoxicité est mieux réalisée en parallèle avec un intra-celluleécran Ular en utilisant même lot et l&#39;âge des cellules THP-1. </li></ol> 5. Dans le bouillon Analyse d&#39;activité à l&#39; aide d&#39; un dosage résazurine 3 <ol><li> Cultiver M. tuberculosis dans 7H9ADST à la phase mi-log (~ 0,5 à 0,8 DO 600). Diluer la culture avec le 7H9ADST à 0,01 DO 600. Diluer les composés dans 7H9ADST 2 fois les concentrations d&#39;essai et aliquote de 100 uL de chaque composé dilué dans chaque puits. </li><li> Transférer 100 pl de la suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié pendant 5 jours. Dissoudre 10 mg de résazurine dans 100 mL d&#39;eau désionisée et d&#39;un filtre stérile. </li><li> Ajouter 30 pi de solution de résazurine et de surveiller le changement de couleur après 48 h; la croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose. NOTE: L&#39;analyse quantitative peut également être effectuée soit par la mesure de la fluorescence à 590 nm avec une excitation à 530-560nm ou l&#39;absorbance à 570 nm et 600 nm 15. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2015%22">Global tuberculosis report 2015</a>. , WHO. (2016).</li>
<li>USFDA. FDA news realease. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm">http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm</a> (2012).</li>
<li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li>
<li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57(2010).</li>
<li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li>
<li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li>
<li>ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth%2Fcell+kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/PI-DAL1025-1100_TI%20alamarBlue%20Rev%201.1.pdf">AlamarBlue assay</a>. , Invitrogen. (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Cell+Viability+Assays%22">Cell Viability Assays</a>. , (2004).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li>
<li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+open-source+drug+discovery%3A+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li>
<li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18752626">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li>
<li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+%28PtpA%29+excludes+host+vacuolar-H%2B-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li>
<li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://edepot.wur.nl/374646">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960(2014).</li>
<li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777(2010).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114(2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Q203%2C+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent pour ce travail.

L&#39;objectif de cette étude était de créer une méthode simple et rentable en utilisant un modèle HTS d&#39;infection intracellulaire humaine pour M. tuberculosis. La tuberculose est une maladie humaine caractérisée par l&#39;infection des macrophages alvéolaires par M. tuberculosis. En raison de problèmes de biosécurité, la recherche sur des modèles biologiques à la fois la bactérie et les cellules hôtes a été utilisé dans le passé. Cependant, il a été démontré que l&#39;utilisation des bactéries de ...

Mycobacterium tuberculosis, l&#39;agent causal de la tuberculose (TB), est une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. TB sensible aux drogues est une maladie traitable qui nécessite de multiples antibiotiques pour une période de 6 mois. En dépit d&#39; être une maladie curable, la tuberculose mortalité a été estimée à 1,5 million en 2015 1. Au cours des 10 dernières années, il y a eu des préoccupations croissantes quant à la prévalence de la tuberculose M. pharmacorésistante. TB multirésistante (MDR-TB) est définie comme la tuberculose qui est résistante à au moins l&#39;isoniazide (INH) et rifampicine (RMP), et la plupart des souches de MDR-TB sont également résistantes à sélectionner des médicaments antituberculeux de deuxième ligne, limitant ainsi les options de traitement . Les effets de la résistance aux médicaments créent un plus grand défi pour le traitement des patients co-infectés par le virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH); 400.000 patients dans le monde sont morts de la tuberculose associée au VIH en 2015 1. Il est décevant, la Food and Drug États-Unis Administration a approuvé un seul nouveau médicament contre la tuberculose MDR-TB, bédaquiline, au cours des 40 dernières années 2. Les progrès dans la recherche de meilleures thérapies et de la tuberculose plus courtes sont nécessaires de toute urgence afin de rester en tête dans la lutte contre la tuberculose et la tuberculose multirésistante. Traditionnellement, les écrans de médicaments antituberculeux sont effectuées sous des conditions in vitro de la croissance dans un milieu de croissance, de sorte que les composés sont ajoutés à une culture en croissance et de leur efficacité dans l&#39; élimination des micro - organismes sont déterminés en comptant les unités formant des colonies (CFU) sur un milieu solide. Comme UFC compte sont chronophage intensifs, la main-d&#39;œuvre, et coûteuse, diverses méthodes indirectes ont été développées pour remédier à ce problème. Ces procédés comprennent le dosage de viabilité Alamar Bleu 3, la détermination de la fluorescence à partir de 4 protéine fluorescente verte (GFP) ou la luminescence 5 à partir de bactéries exprimant la luciférase, et l&#39;estimation de l&#39; adénosine triphosphate totale (ATP) 6, 7. TB typique est caractérisée par une infection par M. tuberculosis du poumon, où les bactéries se trouvent et se répliquent à l&#39; intérieur des phagosomes des macrophages alvéolaires 8. L&#39;écran phénotypiques simple bouillon peut convenir à des agents pathogènes extracellulaires; Cependant, dans la perspective historique, ont frappé des composés contre M. tuberculosis identifiés en utilisant cette méthode ne parviennent souvent pas à la hauteur des attentes au cours des étapes de validation en aval dans les modèles d&#39;infection. Nous proposons que médicaments contre la tuberculose est mieux réalisée dans un modèle d&#39;infection de la cellule hôte intracellulaire. Néanmoins, les modèles intracellulaires possèdent de nombreux obstacles technologiques et biologiques au développement de criblage à haut débit (HTS). Un grand obstacle est la complexité du processus d&#39;infection, illustrée par de nombreuses étapes et l&#39;élimination complexe de bactéries extracellulaires par lavage entre-deux. Un deuxième obstacle majeur est le long temps requirements, comme la détection de la croissance, normalement effectuée par comptage CFU sur les plaques de culture, est un processus qui prend plus de 3 semaines. Une solution pour remplacer CFU chiffres a été fournie par microscopie à fluorescence automatisée en combinaison avec des bactéries fluorescentes. Cependant, cette solution nécessite un investissement initial de l&#39;équipement qui est hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche. Un simple, à faible coût, et la méthode de HTS pertinente maladie améliorerait considérablement le processus de découverte de médicaments. Dans cette étude, nous présentons un nouveau système modulaire qui HTS vise à fournir une réponse rapide et hautement évolutive, mais économique, dosage approprié pour déterminer l&#39;activité des composés contre intracellulaire M. tuberculosis. Ce système est composé de trois modules: (i) intracellulaire, (ii) la cytotoxicité, et (iii) des essais in-bouillon. Le résultat final combiné fournit une description complète des propriétés du composé, avec des informations supplémentaires quant au mode d&#39;action potentiel. cette scSystème écologisation a été utilisé dans plusieurs projets avec diverses banques de composés qui ciblent le mode d&#39;action, y compris l&#39;analyse de la synergie des médicaments 9, la stimulation de l&#39; autophagie 10, et l&#39;inhibition de M. tuberculosis -secreted facteur de virulence (non publié). Les composés de mode d&#39;action inconnu ont également été étudiés 11. Une version modifiée de cette méthode a également été adoptée par notre partenaire industriel comme la principale méthode de criblage pour identifier de nouveaux composés contre la tuberculose intracellulaire M. 11.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N- Diméthylformamide (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M Acide hydrocholorique (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well flat bottom white plate</td><td>plate Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95-well flat bottom clear plate</td><td>plate Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Scelleuse de plaques transparentes</td><td>Spectrophotomètre Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre à microplaques</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Applied Biosystems</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose (TB), est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Avec la propagation accrue de la tuberculose multirésistante (TB-MR), il est urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les infections à M. tuberculosis. Traditionnellement, les composés sont évalués en fonction de leur activité antibactérienne dans des conditions de croissance in vitro en bouillon ; cependant, les résultats sont souvent trompeurs pour les agents pathogènes intracellulaires comme M. tuberculosis, car les conditions de dépistage phénotypique dans le bouillon sont significativement différentes des conditions réelles de la maladie dans le corps humain. Le dépistage des inhibiteurs qui agissent à l’intérieur des macrophages a toujours été difficile en raison de la complexité, de la variabilité de l’infection et de la lenteur du taux de réplication de M. tuberculosis. Dans cette étude, nous présentons une nouvelle approche pour évaluer rapidement l’efficacité des composés sur la viabilité de M. tuberculosis dans un modèle d’infection par les macrophages. En utilisant la combinaison d’un test de cytotoxicité et d’un test de viabilité de M. tuberculosis en bouillon, nous avons pu créer un système de dépistage qui génère une analyse complète des composés d’intérêt. Ce système est capable de produire des données quantitatives à faible coût, ce qui est à la portée de la plupart des laboratoires, tout en étant hautement évolutif pour s’adapter aux grands environnements industriels.

Criblage intracellulaire à haut débit en utilisant M. tuberculosis exprimant le gène de la luciférase La figure 2A et le tableau 1 contiennent les données brutes recueillies par le luminomètre, exprimés en unités luminescentes relatives (RLU), montrant l&#39;effet d&#39;une concentration croissante de la rifampicine aux antituberculeux de M. tuberculosis dans les cellules THP-1....

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir une évaluation multidimensionnelle de la manière dont les composés affectent la survie de M. tuberculosis à l'intérieur des macrophages humains. Cette méthode repose sur un test d'efficacité basé sur la luciférase. Combiné à un test de cytotoxicité et à un test de CMI, il peut fournir des informations utiles sur la modification des composés HIT dans le développement de médicaments contre la tuberculose.Le principal avantage de notre méthode est qu'elle permet de gagner du temps et de la main-d'œuvre. Elle remplace un dosage par unités formant colonies (UFC) par un dosage basé sur la luciférase. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés à assurer une consistance lors du pipetage manuel par rapport à l'automatisation.Une technique de pipetage rigoureuse est essentielle. Faites croître les cellules THP1 dans du RPMI en milieu complet, tout en maintenant une densité cellulaire de 0,2 à un million de cellules par millilitre de milieu entre les passages.Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l'OD600 d'une suspension bactérienne en croissance active. Calculez ensuite la densité bactérienne à l'aid

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Cette vidéo montre un test en bouillon pour déterminer l’efficacité d’un antibiotique contre Mycobacterium tuberculosis. La culture bactérienne est incubée avec différentes concentrations d’un antibiotique bactéricide. L’efficacité bactéricide est mesurée en évaluant la présence de bactéries viables à l’aide d’un dosage de la résazurine.

Évaluation de l’efficacité d’un composé d’essai contre les mycobactéries dans un bouillon

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Le charcoal agar resazurin assay (CARA) est une méthode semi-quantitative à débit moyen pour évaluer l’activité des agents d’essai contre les mycobactéries qui se répliquent, qui ne se répliquent pas ou qui sont les deux.  Le CARA permet d’évaluer rapidement l’activité dépendante du temps et de la concentration et de déterminer les paramètres à suivre à l’aide d’essais d’unités formant colonies (UFC).

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.

Système de culture automatisé destiné à être utilisé dans les essais précliniques de thérapies dirigées par l’hôte pour la tuberculose

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Découvrez un système de criblage à haut débit pour identifier des inhibiteurs de Mycobacterium tuberculosis intracellulaire. Cette méthode par bioluminescence évalue l'efficacité et la cytotoxicité sur macrophages humains.

Système d'efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire

Explorer plus de vidéos