Name: 细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学习双点MARCM技术进行神经元谱系追踪与基因功能研究。该方法利用两种颜色标记共同前体细胞来源的神经元，实现高分辨率成像，帮助研究人员深入理解神经发育的细胞与分子机制。

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本工作由科技部（MOST 104-2311-B-001-034）以及中国台湾中央研究院细胞与个体生物学研究所资助。

1. 使用所需转基因构建适用于tsMARCM的果蝇11,13
<ol>
	<li>从携带转基因的个体果蝇中生成可用于tsMARCM技术的原始果蝇品系11 （参见 表1）。通过将多个转基因整合到同一果蝇品系中，进行标准的果蝇遗传杂交实验，具体方案此前已有描述。13.
	<ol>
		<li>在一条亲本品系中，组装转基因 FRT40A, UAS-mCD8::GFP （第一个报告基因，mCD8::GFP；该转基因的表达由上游激活序列启动子调控，表达产物为小鼠分化簇8蛋白的膜锚定型报告分子，该蛋白与绿色荧光蛋白融合） UAS-rCD2RNAi （抑制第二个报告基因表达的抑制子；针对大鼠分化簇2表达的RNA干扰） rcd2) 在2号染色体的左臂上nd 染色体。放置 组织特异性的-GAL4 X 或 3 上的驱动程序rd 染色体，如果可能的话。</li>
		<li>在另一亲本品系中，组装转基因的 FRT40A, UAS-rCD2::RFP （第二个报告基因，rCD2::RFP；另一种膜锚定报告基因，由rCD2蛋白与红色荧光蛋白融合而成），以及 UAS-GFPRNAi （抑制mCD8::GFP表达的抑制子；针对表达的RNAi） gfp) 在2号染色体的左臂上nd 染色体。放置 热激（hs）-FLP 或组织特异性-FLP 在 X 或 3 上rd 染色体，如果可能的话。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从携带转基因的个体果蝇中生成可用于tsMARCM的新版本果蝇14 （参见 表1）。通过将多个转基因整合到同一果蝇品系中，进行标准的果蝇遗传杂交实验，相关方案此前已有描述。13.
	<ol>
		<li>在一条亲本品系中，组装转基因的 FRT 位点和 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i （一个组合的转基因） mCD8::GFP 以及在同一侧臂中共同插入抑制rCD2::RFP表达的抑制子nd 或 3rd 染色体（适当配对的转基因） FRT 和 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i 如图所示 表1）。放置 组织特异性GAL4 除所选染色体之外的其他染色体上的驱动因子 FRT 尽可能选择合适的位点。</li>
		<li>在另一亲本品系中，组装转基因的 FRT 位点和 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi （另一个组合的转基因） rCD2::RFP 以及在同一臂的2中抑制mCD8::GFP表达的抑制子nd 或 3rd 染色体（适当配对的转基因） FRT 和 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi 如图所示 表1）。放置 hs-FLP 或 组织特异性FLP 除所选染色体以外的其他染色体上 FRT 尽可能选择合适的位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 杂交具备 tsMARCM 条件的果蝇以在其子代中产生 tsMARCM 克隆
<ol>
	<li>将已准备好用于tsMARCM的果蝇进行杂交（例如， 将步骤1.1.1或1.2.1中的10–15只雄蝇与步骤1.1.2或1.2.2中的20–30只处女雌蝇共同放入一个装有新鲜制备酵母糊（涂于管壁）的果蝇培养管中。</li>
	<li>将已交配的tsMARCM准备果蝇在25 °C下维持2天，以提高收集受精卵前的交配成功率。</li>
	<li>定期将已交配的tsMARCM准备果蝇转移至新添加酵母的试管中，以避免过度拥挤（轻敲试管使果蝇沉降，或使用二氧化碳麻醉果蝇以方便转移；每10 mL果蝇培养基试管中保留的受精卵不超过80–100个，以防孵化幼虫过多）。</li>
	<li>培养 tsMARCM 动物（即， 受精卵；tsMARCM 动物基因型的一个示例，如实验中所用 图3是 hs-FLP[22]，w/w；UAS-mCD8::GFP，UAS-rCD2RNAi，FRT40A,GAL4-GH146/UAS-rCD2::RFP,UAS-GFPRNAi,FRT40A; +; +）在25 °C下连续转移至小瓶中培养，直至发育至所需阶段（例如， 胚胎、幼虫或蛹</li>
	<li>将含有tsMARCM动物且处于相同发育阶段的转移小管分别置于37 °C水浴中处理10、20、30、40和50分钟，以确定诱导FLP表达从而产生目标tsMARCM克隆的最佳热激时间。若采用组织特异性启动子驱动FLP表达，则可省略此步骤。FLP 正在用于tsMARCM实验（hs-FLP 神经谱系分析首选该方法；此前已有文献描述了选择该方法的原因15). 
	注意：若希望在后续的tsMARCM实验中获得更多的tsMARCM克隆，请使用最佳热激时间重复步骤2.5；通常，更长的热激时间会诱导出更多的FLP表达 hs-FLP[22] 与……相比 hs-FLP[1] 相同的热激时间</li>
	<li>将热激后的tsMARCM动物在25 °C下培养至适当的发育阶段，然后进行步骤3。</li>
</ol>
3. 准备、染色并封片含有 tsMARCM 克隆的果蝇大脑
<ol>
	<li>准备镊子保护皿。将硅胶弹性体试剂盒的A组分（30 g）和B组分（3 g）与活性炭（0.25 g）混合。将混合物倒入适当的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用镊子在镊子保护皿中的1×磷酸盐缓冲液（PBS）内解剖tsMARCM动物的幼虫、蛹或成虫脑组织。注：果蝇脑组织解剖方案已有先前文献描述16。</li>
	<li>在玻璃凹孔板中，用含4%甲醛的1×PBS在室温下固定果蝇脑组织20分钟。后续所有步骤均在此玻璃凹孔板中处理果蝇脑组织。</li>
	<li>用含1% Triton X-100的1×PBS（即1% PBT）冲洗果蝇脑组织三次，随后在1% PBT中每次孵育30分钟，共洗涤三次（冲洗：迅速移除PBT并加入新的PBT；洗涤：移除PBT后加入新的PBT，并将果蝇脑组织置于新PBT中使用旋转摇床孵育）。</li>
	<li>在4 °C下过夜或在室温下孵育4小时，使果蝇脑组织与一抗混合物反应。一抗混合物示例：大鼠抗CD8抗体（1:100）、兔抗DsRed抗体（1:800）和小鼠抗Bruchpilot（Brp）抗体（1:50），溶于含5%正常山羊血清（NGS）的1% PBT中。</li>
	<li>用1% PBT冲洗果蝇脑组织三次，然后在1% PBT中每次洗涤30分钟，共三次。</li>
	<li>在4 °C下过夜或在室温下孵育4小时，使果蝇脑组织与二抗混合物反应。二抗混合物示例：与绿色荧光染料偶联的山羊抗大鼠IgG抗体（1:800）、与黄色荧光染料偶联的山羊抗兔IgG抗体（1:800）和与远红荧光染料偶联的山羊抗小鼠IgG抗体（1:800），溶于含5% NGS的1% PBT中。</li>
	<li>用1% PBT冲洗果蝇脑组织三次，然后在1% PBT中每次洗涤30分钟，共三次。将脑组织用抗淬灭试剂封片于载玻片上。盖上盖玻片以覆盖并保护果蝇脑组织。用透明指甲油密封盖玻片与载玻片的边缘。将封好的果蝇脑组织标本于4 °C保存。</li>
</ol>
4. 获取、处理和分析 tsMARCM 克隆的荧光图像
<ol>
	<li>使用选定的共聚焦显微镜系统，对步骤3.8中制备的样品中的tsMARCM克隆进行荧光成像。</li>
	<li>使用所选共聚焦显微镜系统配套的图像处理软件，将 tsMARCM 共聚焦荧光图像的投影堆栈生成二维平面图像（参见 图3B-3E, 3G-3J, 3L-3O, 和 3Q-3T 用于展示共聚焦荧光图像的平面化示例）。</li>
	<li>使用适当的图像处理软件，对tsMARCM克隆的多细胞-NB侧的细胞数量进行计数例如， 的 &#34;细胞计数仪&#34; ImageJ 中的功能17；参见 图3E, 3J, 3O，以及 3T （例如神经元的细胞体）</li>
</ol>

<ol><li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li>
<li>Goodman, C. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodman%2C+CS+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
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<li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li>
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<li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li>
<li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).</li>
<li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li>
<li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

方案中的关键步骤
步骤 1.1.1、1.2.1、2.3、2.5 和 3.2 对获得良好的 tsMARCM 结果至关重要。在步骤 1.1.1 和 1.2.1 中，应优先选用在神经前体细胞中不表达 GAL4 的组织特异性-GAL4 驱动子。在步骤 2.3 中，应避免果蝇培养瓶中的个体过于拥挤。由于热激后 FLP 的诱导潜伏期、GAL4 表达水平以及神经前体细胞（即 神经母细胞 NBs 和中间神经前体细胞 GMCs）的平均分裂时间尚不明确，建议在步骤 2.5 中对相同基因型和发育阶段的不同样本采用不同的热激时间（10、20、30、40 和 50 分钟），以确定最佳热激时间，从而获得理想的 tsMARCM 克隆比例。此外，在步骤 3.2 进行果蝇脑解剖时需格外小心，以获取完整的脑组织样本，这对于准确计数神经元数量至关重要。对于希望将 tsMARCM 技术应用于研究其他染色体臂上基因功能的研究人员（例如 2R、3L 和 3R），应参照表 1 中所列的 FRT、UAS-mCD8.GFP....

大脑由大量且多样化的神经元组成，赋予动物感知、处理和应对外界挑战的能力。成年个体的神经元 果蝇 中枢脑在发育过程中源自数量有限的神经干细胞，称为神经母细胞（NBs）1,2参与大脑神经发生的大多数NBs在 果蝇 进行不对称分裂，产生具有自我更新能力的神经母细胞（NBs）和神经节母细胞（GMCs），随后GMCs再经历一次分裂，生成两个子细胞，这些子细胞分化为神经元3 (图1A）。由于神经元形态复杂，且识别特定神经元存在困难，研究人员开发了一种正向镶嵌标记技术——利用可抑制细胞标记物的镶嵌分析（mosaic analysis with a repressible cell marker, MARCM），该技术能够从大量未标记的邻近神经元中实现单个神经元或少量神经元亚群的可视化4.
MARCM 利用 Flippase（FLP）/FLP 识别靶点（FRT）系统，在携带阻遏基因杂合等位基因的分裂前体细胞中介导同源染色体之间的位点特异性重组，该阻遏基因的表达通常抑制报告基因的表达4。有丝分裂后，重组染色体被分配到两个子细胞中，使得一个细胞含有阻遏基因的纯合等位基因，而另一个细胞则完全缺失阻遏基因——报告基因在该细胞及其后代中的表达不再受到抑制4。当在神经母细胞（NBs）或成神经细胞（GMCs）中随机诱导 FLP 时，MARCM 实验中通常可观察到三种克隆模式：单细胞和双细胞-GMC 克隆，可用于单细胞分辨率下神经元形态的描绘；以及多细胞-NB 克隆，可揭示源自同一神经母细胞的全部神经元的形态模式（图1B）。MARCM 技术已广泛应用于黑腹果蝇（Drosophila）神经生物学研究中，包括神经元类型鉴定以重建全脑连接网络、神经谱系分析以揭示神经元的发育历史、细胞命运决定相关基因功能的表型表征，以及神经元形态发生和分化研究5,6,7,8,9,10。由于传统的 MARCM 仅在诱导的有丝分裂重组事件后标记两个子细胞之一（及其谱系），来自未标记一侧的潜在有用信息因此丢失。这一局限性使得基本的 MARCM 系统难以应用于许多快速转换细胞命运的神经谱系的高分辨率分析，或难以对不同个体中相同神经元的基因功能进行精确分析11,12。
双标记MARCM（tsMARCM）是一种先进的系统，可利用两种不同的颜色标记源自同一前体细胞的神经元，从而能够从双生细胞的两侧获取有用信息，克服了原始MARCM系统的局限性11（图2A–2C）。在tsMARCM系统中，两个基于RNA干扰（RNAi）的抑制子位于前体细胞中同源染色体的反式位点上，这些抑制子的表达可独立抑制各自报告基因的表达（图2B）。在FLP/FRT系统介导的位点特异性有丝分裂重组发生后，这两个基于RNAi的抑制子被分配到双生细胞中，从而允许不同报告基因的表达（图2B）。在tsMARCM实验中通常可观察到两种克隆模式：单细胞关联的单细胞克隆和两细胞GMC（成神经细胞）关联的多细胞NB（神经母细胞）克隆（图2C）。来自双生细胞一侧的信息可作为另一侧的参照，从而实现高分辨率的神经谱系分析，例如对标记神经元进行出生时间测定，以及在不同个体动物中对相同神经元进行表型分析，以精确研究神经基因功能11,12。本文提供了一个逐步操作的实验方案，描述如何开展tsMARCM实验，可供其他实验室用于拓展对果蝇（Drosophila）神经系统发育（以及其他组织发育，如适用）的研究。

<table><tbody><tr><td>二氧化碳（CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>本地供应商</td><td>n.a.</td><td>麻醉果蝇</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫</td><td>本地供应商</td><td>n.a.</td><td>分选、杂交和转移果蝇</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech（或其他供应商）</td><td>PBS001</td><td>解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>固定果蝇脑组织</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>正常山羊</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD8 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>兔抗 DsRed 抗体</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>小鼠抗 Brp 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>nc82</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>与 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗大鼠 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>与 Alexa Fluor 546 偶联的山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>与 Alexa Fluor 647 偶联的山羊抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>SlowFade gold 抗淬灭试剂</td><td>Molecular Probes</td><td>S36936</td><td>封片并防止荧光淬灭&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 孔玻璃培养皿</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>制备黑色 Sylgard 培养皿，以保护解剖镊子在脑组织解剖过程中的使用</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>制备黑色 Sylgard 培养皿</td></tr><tr><td>Dumont #5 解剖镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>解剖和封片果蝇脑组织</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>封片果蝇脑组织</td></tr><tr><td>1.5 号盖玻片</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>封片果蝇脑组织</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>本地供应商</td><td>不可用</td><td>密封盖玻片于载玻片上</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>在 25 &amp;deg;C 下培养果蝇</td></tr><tr><td>（或其他供应商）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>在 37 &amp;deg;C 下诱导果蝇热激反应</td></tr><tr><td>（或其他供应商）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>清洗和免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>（或其他供应商）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>分选、杂交和转移果蝇；解剖、漂洗、清洗和免疫染色果蝇脑组织</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss（或其他供应商）</td><td>LSM 700（或其他型号）</td><td>成像 tsMARCM 克隆</td></tr><tr><td>图像处理软件 1&lt;br/&gt; （&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Zeiss LSM 图像浏览器）&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>不可用</td><td>投影共聚焦图像的图层堆栈</td></tr><tr><td>图像处理软件 2&lt;br/&gt; （&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，ImageJ）&amp;nbsp;</td><td>不可用</td><td>不可用</td><td>计数 tsMARCM 克隆的细胞数量</td></tr></tbody></table>

利用双色标记克隆分析系统进行细胞谱系追踪与基因功能研究

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

利用可抑制细胞标记的嵌合分析（Mosaic analysis with a repressible cell marker, MARCM）是一种正向嵌合标记系统，已广泛应用于Drosophila神经生物学研究中，用于描绘复杂的神经元形态，并在整体未标记且未受干扰的生物体中对特定神经元亚群的基因功能进行操控。MARCM系统中的遗传嵌合体通过分裂中的前体细胞内同源染色体之间的位点特异性重组实现，在有丝分裂过程中产生被标记（MARCM克隆）和未被标记的子细胞。MARCM方法的一种扩展技术称为双色标记MARCM（twin-spot MARCM, tsMARCM），可利用两种不同的荧光颜色同时标记来自同一前体细胞的两个子代细胞。该技术的开发旨在从两个半谱系中同时获取有用信息。通过系统分析不同组合的tsMARCM克隆，tsMARCM系统能够实现高分辨率的神经谱系图谱构建，揭示由共同前体细胞产生的标记神经元的精确出生顺序。此外，tsMARCM系统还拓展了基因功能研究，允许对不同个体中相同类型的神经元进行表型分析。本文中，我们描述了如何应用tsMARCM系统以促进对Drosophila神经系统发育的研究。

tsMARCM 系统已被用于促进神经谱系分析和基因功能研究，通过获取源自共同神经母细胞（NBs）的神经元的重要信息。该系统已被用于鉴定大多数（即使不是全部）神经元类型，确定每种神经元类型的细胞数量，并明确这些神经元的出生顺序11,12,18（详见讨论部分中关于使用 tsMARCM 进行神经谱系分析或基因功能研究的说明）。在此，我们以标记有 GAL4-GH146 的四个 anterodorsal 嗅觉投射神经元（adPNs，在果蝇 Drosophila 嗅觉系统的 ALad1 神经谱系中）的 tsMARCM 克隆为例，说明如何进行 tsMARCM 实验1,2。在胚胎期诱导 FLP 表达后，在一个 tsMARCM 克隆中检测...

本文介绍了一种嵌合标记技术的实验方案，该技术可使源自同一前体细胞的神经元以两种不同的颜色进行可视化。这有助于开展神经谱系分析，能够对单个神经元进行出生时间标记，并在不同个体的相同神经元中研究基因功能。

利用可抑制细胞标记物的嵌合分析（MARCM）是一种阳性嵌合标记系统，已广泛应用于黑腹果蝇（Drosophila）神经生物学研究……

本双标记MARCM技术方案的总体目标是进行高分辨率的细胞谱系分析，并更深入地研究基因功能。脑组织包含大量多样化的神经元，研究发育过程中神经元如何组装在一起的机制具有挑战性。该技术的主要优势在于，能够用两种不同的颜色标记来自共同神经元前体的神经元。这些技术能够获取单个神经元信息产生的时间点，因此该技术可帮助研究人员探索神经发育背后的细胞和分子机制。今天演示该实验操作的是 Pei-Chi Chung。来自余教授实验室的一名技术人员。首先，将双标记 MARCM 准备好的雄性和雌性果蝇与新鲜酵母一同放入一个装有果蝇培养基的试剂瓶中。将杂交用的双标记 MARCM 准备果蝇在 25 摄氏度下培养两天，以提高交配几率，随后收集受精卵。为避免幼虫孵化后过于拥挤，轻敲已交配的双标记MARCM准备果蝇，转移至新加入酵母的培养管中。培养双标记MARCM后代，直至其发育至所需阶段。此处，将对处于幼虫阶段的果蝇进行热激处理，以诱导flippase表达。将果蝇培养管转移至37摄氏度水浴中，分别处理10、20、30、40和50分钟，以确定flippase表达的最佳热激条件，从而获得目标 twin-spot MARCM 克隆。热激的时间点决定清除事件发生所处的发育阶段，而热激持续时间则决定将产生多少个清除事件。将热激的双标记 MARCM 动物在 25 摄氏度下培养至所需发育阶段，随后进行染色和封片。向镊子保护皿中加入 PBS。然后，将双标记MARCM动物转移至培养皿中。在解剖显微镜下，用镊子从双标记MARCM动物中解剖出脑组织。首先，将果蝇的头部从身体上分离。然后轻轻去除表皮，注意不要损伤脑组织。接着，小心移除呈白色纤维状的气管。将脑组织转移至含有4%甲醛和PBS的玻璃凹板中。室温下固定 20 分钟。开始染色程序，用 1% PBT 清洗果蝇脑组织 3 次，随后再用 1% PBT 洗涤 3 次。每次振荡孵育30分钟。将果蝇脑组织与一抗混合液在4°C下孵育过夜，或在室温下孵育4小时。用1% PBT缓冲液冲洗并洗涤果蝇脑组织三次，每次30分钟，振荡条件同前。然后将果蝇大脑与二抗混合液在室温下孵育四小时，或在4摄氏度下过夜孵育。按照之前的方法用缓冲液漂洗和洗涤大脑后，将大脑用抗淬灭试剂封片于载玻片上，再加盖盖玻片以覆盖并保护果蝇大脑。用透明指甲油密封盖玻片与微型载玻片的边缘。最后，使用选定的共聚焦显微镜系统采集样品中双标记MARCM克隆的荧光图像。该图展示了双标记MARCM克隆的结果，即通过诱导Flippase产生的VL2p前背侧嗅觉投射神经元。为了在胚胎阶段介导 adPN 神经母细胞中的有丝分裂重组。此第一张示意图展示了神经发生模式。在这张大脑的共聚焦显微镜图像中，VL2p adPNs 显示为绿色，与呈品红色的多细胞神经母细胞 adPNs 相关联。此图像显示了侧角中的细胞。此处可见嗅觉球神经元的形态学结构。该图像展示了DL1 adPNs的数据。如图所示，DL1 adPNs 在发育过程中出现的时间晚于 VL2p adPNs。通过诱导 DC3 adPNs 的双标记 MARCM 克隆，证明该神经元类型在发育后期出现。此图像显示，在 adPN 谱系中，双标记 MARCM 事件发生于一个 GAL4 阴性的神经元内。一旦掌握，该技术可帮助研究人员分析神经谱系，并提供不同的标记物以区分神经元与神经母细胞克隆。此外，在杂合遗传背景下，双色标记 MARCM 技术还可产生纯合突变克隆，以探究分子机制。

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细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

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