细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

这种双点 MARCM 方案的总体目标是进行高分辨率细胞谱系分析和更好的基因功能研究。脑组织由大量不同的神经元组成，研究神经元在发育过程中如何组装在一起的机制是一项挑战。该技术的主要优点是用两种不同的颜色标记源自共同神经元祖细胞的神经元。

这允许检索单个神经元的诞生信息。因此，这项技术可以帮助研究人员探索神经发育背后的细胞和分子机制。今天演示该程序的是 Pei-Chi Chung。

俞教授实验室的一名技术员。首先将双点 MARCM 即用型雄性和雌性混合在苍蝇食品小瓶中，并在小瓶中加入新鲜酵母。将交叉的双点 MARCM 准备好的苍蝇保持在 25 摄氏度两天，以提高交配的机会，然后再收集受精蛋。

为避免幼虫孵化时过度拥挤，请轻敲交叉的双点 MARCM 即用果蝇，然后转移到新鲜发酵的小瓶中。培养双点 MARCM 后代，直到它们达到所需的发育阶段。在这里，幼虫阶段的果蝇将受到热休克以诱导 flippase 表达。

将果蝇瓶转移至 37 摄氏度水浴中 10、20、30、40 和 50 分钟，以确定 flippase 表达的最佳热休克。生成感兴趣的双点 MARCM 克隆。热冲击的时间决定了清零产生的阶段，而热休克期决定了将产生多少清零。

在 25 摄氏度下培养受热休克的双点 MARCM 动物，直到所需的发育阶段。然后进行染色和封片。将 PBS 添加到镊子保护皿中。

然后，将双点 MARCM 动物转移到培养皿中。在通过解剖显微镜观察时，使用镊子从双点 MARCM 动物中解剖大脑。首先，从果蝇的身体上取下头部。

然后轻轻去除角质层，不要损伤大脑。接下来，小心地去除显示为白色纤维的气管。将大脑转移到含有 4% 甲醛和 PBS 的玻璃点板上。

并在室温下固定 20 分钟。通过用 1% PBT 冲洗果蝇脑 3 次来开始染色程序。然后用 1% PBT 洗涤 3 次。

每次摇晃 30 分钟。将果蝇脑与一抗混合物在 4 摄氏度下孵育过夜或在室温下孵育 4 小时。冲洗并清洗苍蝇脑 3 次，每次用 1% PBT 洗涤，像以前一样摇晃。

然后将果蝇脑与二抗混合物在室温下孵育 4 小时或在 4 摄氏度下过夜。像以前一样冲洗和清洗大脑后，用抗淬灭试剂将大脑安装在微载玻片上。然后放置盖玻片以覆盖和保护苍蝇大脑。

使用透明指甲油密封微盖玻片和微玻片的边缘。最后，使用所选的共聚焦显微镜系统从样品中捕获双点 MARCM 克隆的荧光图像。该图显示了双点 MARCM 克隆的结果，这是一种通过诱导 flippase 衍生的 VL2p 前背嗅投射神经元。

在胚胎阶段介导 adPN 神经母细胞中的有丝分裂重组。第一张图显示了神经发生模式。在这张大脑共聚焦显微镜图像中，VL2p adPN 显示为绿色，并与洋红色的多细胞神经母细胞 adPN 相关。

该图像显示了外侧角中的细胞。触角叶的神经元形态在这里可以看到。此图显示了 DL1 adPN 的数据。

如图所示，DL1 adPN 的开发时间比 VL2p adPN 晚出现。DC3 adPN 的双点 MARCM 克隆的诱导表明，这种神经元类型出现在发育的后期。该图显示双点 MARCM 事件发生在 adPN 谱系内的 GAL4 阴性神经元中。

一旦掌握，这项技术可以帮助研究人员分析神经谱系并提供不同的标记来区分神经元和神经母细胞克隆。此外，双点 MARCM 可以产生纯合突变克隆以探索分子机制。在杂合子遗传背景中。