Name: 使用成像流式细胞仪T细胞同种异体反应性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用成像流式细胞仪测定T细胞同种异体反应性的方法，用于移植免疫学研究。该技术可高通量分析T细胞与抗原呈递细胞间的免疫突触，有助于预测移植受者的移植物结局。

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S.C.J. 获得了国际心肺移植学会研究奖学金以及加拿大皇家内科与外科医师学会德特韦勒旅行奖学金的资助。S.M. 的部分资助来自国际心肺移植学会职业发展奖（授予 S.C.J.）。S.S. 获得了美国国立卫生研究院研究牛津生物医学研究中心的支持。J.H. 是英国肾脏研究基金会高级非临床研究员。本研究由以下拨款资助 A.B. 和 K.W.：惠康信托项目基金（082519Z07Z）、英国心脏基金会项目基金（PG/10/62.28504）以及欧盟第七框架计划（ONE Study；BioDRIM）。作者谨此感谢 Michael Parsons 以及多伦多 Sinai 健康体系 Lunenfeld-Tanenbaum 研究所的流式细胞术核心设施，为使用 ImageStream Mark X 仪器提供了使用权限和技术支持。

1. 准备所需的试剂和材料
<ol>
	<li>制备含有 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）（“洗涤缓冲液”）。制备含有 2% FCS 和 0.1% 非离子型去污剂的 PBS（“透化洗涤缓冲液”；参见材料表）。制备含有 1.5% 甲醛的 PBS。 
	注意：小心！甲醛具有腐蚀性，且可能具有致癌性，操作时必须佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>制备含有 2% FBS 和 0.5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS，用于磁性细胞分离（“MCS 缓冲液”）。</li>
	<li>在二甲基亚砜（DMSO）中配制 50 µg/mL 的鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素（Phalloidin-FITC）。在 DMSO 中配制 1 mg/mL 的细胞核染料（例如，1 mg/mL 的 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）或双苯并咪唑染料；参见材料表）。准备适用于目标细胞和成像流式细胞仪的荧光染料标记抗体。</li>
	<li>获取动物组织（例如，淋巴结和脾脏）作为 T 细胞来源，以及同种异体动物组织（例如，脾脏和骨髓）作为抗原呈递细胞或前体细胞的来源。</li>
	<li>准备细胞培养基（例如，添加 10% FBS 的罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）1640 或杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）），并加入 50 µM 2-巯基乙醇、青霉素和链霉素，并准备 24 孔和/或 96 孔细胞培养板。</li>
</ol>
2. 准备抗原呈递细胞
注意： 理论上，任何抗原呈递细胞（APC）群体均可通过此方法进行检测。本实验中以小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DCs）作为抗原呈递细胞。已有多种方案可用于制备此类细胞（例如，参考文献34和35）。简要而言，采用以下方案。
<ol>
	<li>从股骨和胫骨中冲洗骨髓至 RPMI 1640 或 DMEM 培养基中。</li>
	<li>将悬浮细胞通过70-µm 细胞滤筛，用于去除小块骨组织和碎片。</li>
	<li>离心沉淀细胞，然后在室温下用氯化铵缓冲液裂解红细胞5分钟。</li>
	<li>通过离心沉淀细胞（400 × g，5 分钟），并重悬细胞沉淀。</li>
	<li>用 5 - 10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞沉淀，并重新悬浮细胞沉淀。</li>
	<li>通过使用生物素标记的抗CD3抗体标记细胞，在细胞分离柱上富集造血前体细胞5 µg/mL），抗-B220（5 µg/mL），抗MHC II类分子（1 µg/mL），以及抗 CD11b（5 µg/mL）抗体。</li>
	<li>通过离心（400 × g，5 分钟）沉淀细胞，并重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞与抗生物素磁珠（见材料表）孵育 4 °C 10分钟</li>
	<li>洗涤细胞并离心收集（400 × g，5 分钟），用 1 mL MCS 缓冲液重悬细胞，然后使用预先加入 3 mL MCS 缓冲液并置于磁铁架上的大型正向选择（LS）磁性细胞分离柱去除标记细胞。用 3 mL MCS 缓冲液洗涤柱子 3 次；穿流液中将含有目标细胞。</li>
	<li>将流穿柱的细胞在添加了2 ng/mL重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和2 ng/mL重组人转化生长因子β1（TGFβ1）的RPMI 1640或DMEM培养基中培养6天。每2天更换一半新鲜完全培养基，其中含2 ng/mL GM-CSF和TGFβ1。 
	注意： 人TGFβ1在小鼠细胞中具有活性。这些数据是使用这些未成熟DCs生成的。其他细胞（例如， B细胞和成熟的树突状细胞可能适合作为抗原提呈细胞，但尚未在此检测中进行测试。</li>
	<li>将DCs用90%血清/10% DMSO进行冻存，并置于液氮中保存；使用当天复苏。使用前，用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板上计数活DC数量。在用于第4部分前，将细胞沉淀重悬于适当密度的培养基中（见步骤4.1）。</li>
</ol>
3. 准备T细胞
<ol>
	<li>采用阴性筛选方法，以避免无意中向细胞传递激活或抑制信号。 
	注意： 本示例中，准备用于分析的 CD4+ T 细胞。
	<ol>
		<li>为从小鼠脾脏中分离 CD4+ T 细胞，使用注射器活塞将脾脏组织研磨通过 70-µm 细胞滤器。用洗涤缓冲液冲洗滤器。</li>
		<li>通过离心（400 × g，5 分钟）沉淀悬浮细胞，随后在室温下用氯化铵缓冲液重悬沉淀，裂解红细胞，孵育 5 分钟。</li>
		<li>再次离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，并重悬沉淀。</li>
		<li>用 5–10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，重悬沉淀。</li>
		<li>使用生物素标记的抗体对 CD8、主要组织相容性复合体 II 类（MHC II，1 µg/mL）和 CD19（5 µg/mL）进行细胞染色。4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，重悬沉淀。</li>
		<li>根据制造商说明，将细胞与抗生物素磁性微珠（见材料表）孵育。</li>
		<li>用 10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，重悬沉淀。</li>
		<li>将细胞重悬于 1 mL MCS 缓冲液中，通过置于磁铁上的磁性细胞分离柱（预先用 3 mL MCS 缓冲液平衡）富集 CD4+ T 细胞。用 3 mL MCS 缓冲液洗涤柱子 3 次。穿流液即为富集的 T 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用常规流式细胞术，取一部分阴性筛选后的细胞评估 T 细胞纯度。使用荧光染料标记的链霉亲和素偶联物（用于识别应被去除的生物素标记细胞）以及识别目标 T 细胞群体（本例中为 CD4）的抗体或抗体组合进行染色；纯度 ≥85% 可接受23。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数 T 细胞（活率 ≥90% 可接受）。 
		注意： MCS 缓冲液含有 EDTA，在进行实验前必须去除。为此，通过离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤。再次离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，并以适当密度重悬于培养基中（见步骤 4.1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 共同孵育T细胞与DC细胞
<ol>
	<li>以2:1的T细胞:DC比例，在24孔或96孔细胞培养板中接种T细胞和DC。确保最终培养体积≤500 µL 24孔板或≤50 µL 96孔板 
	注意： 较小的体积可促进细胞间的相互作用，并为后续的固定缓冲液留出空间。
	<ol>
		<li>根据经验调整精确的细胞数量，但作为一般性指导，使用 1 x 106 T 细胞和 0.5 x 106 每孔（96孔板）树突状细胞数量。此数量应视为细胞的最低数量，因为细胞数量过少将导致免疫突触计数困难。
		<ol>
			<li>为增加细胞数量，设置重复孔并合并 之后 步骤5（固定） 
			注意： 设置重复孔时，建议先在所有孔中接种树突状细胞（DCs），然后在所有孔中接种T细胞；这样可以最大限度地减少各孔之间孵育时间的差异。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板在 4 h 内孵育 37 °C 在5% CO₂环境中2 大气</li>
</ol>
5. 在培养板中固定细胞
<ol>
	<li>向每个孔中加入细胞培养体积3倍的1.5%多聚甲醛PBS溶液，在室温下孵育30分钟；在将细胞从培养板上移除之前进行固定非常重要，以尽量减少细胞间相互作用的破坏。</li>
	<li>将培养板中的细胞转移至离心管中，用于后续的洗涤和染色。在此阶段，需额外保留部分细胞用于单染对照。除这些对照外，其余全部细胞均应使用抗体混合液进行染色（参见步骤4.1.1）。</li>
</ol>
6. 染色细胞
<ol>
	<li>在 100 µL 洗涤缓冲液中加入所需荧光染料标记的抗体混合物，室温避光孵育 30 分钟，对细胞进行染色。 
	注意： 抗体混合物包括 T 细胞特异性抗体和 APC 特异性抗体。荧光染料的选择应确保能够通过成像流式细胞仪的配置加以区分。在本实验中，使用了蓝色荧光染料标记的 CD11b（5 µg/mL，参见材料表）和 APC 标记的 CD90.2（5 µg/mL）。</li>
	<li>用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。 弃去上清液。将细胞重悬于含 FITC 标记鬼笔环肽（phalloidin FITC）的破膜/洗涤缓冲液中（终浓度为 0.05–0.5 µg/mL），室温避光孵育 30 分钟。 
	注意： 对小鼠细胞而言，约 0.1 µg/mL 的 FITC 标记鬼笔环肽浓度效果良好，但最佳浓度可能因供应商、细胞类型及成像流式细胞仪的不同而有所差异。</li>
	<li>用 1 mL 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。将细胞重悬于含核染料的破膜/洗涤缓冲液中（适当浓度，例如，约 25 µg/mL 的 7-AAD），室温避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1 mL 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。再用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤一次，离心收集细胞沉淀后，重悬于 50–100 µL 洗涤缓冲液中，并转移至小型带盖微量离心管中。</li>
	<li>立即进行数据采集，或在 4 °C 避光保存数天后进行成像流式细胞仪检测。 
	注意： 此方法已成功用于保存细胞长达 7 天。更长时间的保存可能可行，但尚未经过验证。</li>
</ol>
7. 获取数据
<ol>
	<li>根据制造商的说明初始化并配置成像流式细胞仪。在采集任何数据之前，确保流动核心的稳定性。</li>
	<li>预留一个通道用于明场图像采集。在关闭明场通道的情况下，采集单染对照数据。
	<ol>
		<li>点击“Load”按钮，将含有完全染色样本（即已用所有必需荧光染料染色的样本）的试管插入支架中。</li>
		<li>在“workspace”窗口中，选择并创建一个新的散点图，以长宽比（aspect ratio）对面积（area）作图，并圈选长宽比接近1的单细胞群体。对所使用的每个通道分别创建一个新的散点图（通道强度位于横轴）。</li>
		<li>针对每种荧光染料，检查阳性细胞群，如有需要，在“Illumination”框中调整激光电压。</li>
		<li>卸下当前试管，加载第一个单染试管。</li>
		<li>在“Acquisition Settings”框中，输入样本名称，并设置应采集的事件数；若为单染对照（用于补偿控制），采集 1,000 - 2,000 个事件即可。</li>
		<li>在“Channels”框中，选择每个样本所对应的染色通道。对于单染对照，应选择所有通道，但明场和侧向散射通道需关闭。点击“Acquisition”框下方的“Record”按钮；当事件数达到设定阈值时，采集将自动停止。</li>
		<li>点击“Return”按钮卸下试管。对每个单染对照重复步骤 7.2.4 - 7.2.6。根据细胞仪型号及软件版本，在采集过程中可能无法设置 图1 中所示的全部门控（更精确的门控将在分析阶段完成；见第8节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集方式与单染样本（步骤 7.2）相同，但在“Channels”框中需选择所有所需通道，包括明场通道。
	<ol>
		<li>在记录数据前，检查各通道强度是否适合识别目标细胞群。若不合适，调整激光设置，并按照步骤 7.2 所述，使用新设置重新记录单染对照数据。</li>
		<li>对每个样本，采集数万条事件数据。 
		注意：在大多数情况下，细胞间接触事件仅占总细胞数的极小部分（大多数为单个细胞）。通常建议最终膜接触门控中至少包含 100 个事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 分析数据
<ol>
	<li>使用制造商网站上提供的免费分析软件，对成像流式细胞仪获取的数据进行分析（需创建用户账户；参见材料表）。</li>
</ol>
<img alt="细胞分选流式细胞术图谱；显示细胞双联体、信号比值及荧光数据的图表。" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 用于鉴定同种反应性免疫突触的设门策略。A. 通过明场通道（通道4，Ch04）分析细胞图像的强度轮廓变化率的均方根（梯度RMS），如文中所述，将合焦事件从所有事件中筛选出来。 B. 在合焦事件中，通过绘制明场通道的长宽比与面积的关系图，可将双细胞团（doublets）与单细胞区分开。单细胞在长宽比接近1且面积较小的区域成簇分布，而双细胞团则集中在长宽比接近0.5且面积较大的区域。 C. 随后将 APC 的荧光强度（此处为树突状细胞 [DC] 标记物 CD11c）与 T 细胞标记物（此处为 CD90.2）的荧光强度作图，并圈选双阳性事件。可通过查看靠近门控边界的事件图像来优化门控边界。 D. 通过绘制APC标记物（CD11c，Ch02）的面积与长宽比的关系图，对T-APC双联体进行优化，使其仅包含一个APC。 E. 通过绘制T细胞标记物（CD90.2，Ch06）的面积与长宽比的关系图，进一步筛选这些单个APC双联体，使其仅包含一个T细胞。 F. 最后，通过绘制细胞核染色通道（7-AAD，Ch05）的斑点计数直方图，并圈选仅包含2个7-AAD阳性斑点的事件，从而筛选出仅含有两个细胞核的事件。即， 细胞核）。对该门控内的事件，按照文中所述方法分析膜接触与突触形成情况。 图2数据以盲法方式进行分析，不涉及治疗分组信息，且源自一项已发表的先前实验。23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
注意： 本节描述了设门策略，如图1所示。成像流式细胞术数据的分析应以盲法方式进行，即分析者在分析时不知晓样本的处理分组。尽管我们认为免疫突触与非突触接触通常较易区分（见下文及图2和图3），但采用盲法可最大限度减少图像分析本身固有的主观性所带来的偏倚。
<ol start="2">
	<li>通过将单染对照数据文件加载到补偿向导中来生成补偿矩阵。加载单染文件后，选择实验中使用的荧光通道。 
	注意： 软件会自动生成补偿矩阵，但应手动验证以确保选择了正确的阳性细胞群。
	<ol>
		<li>双击矩阵中的数值，将图表添加到分析区域。如有必要，创建新门以排除死细胞/双联体/假阳性信号；该新优化的阳性细胞群可在每个通道的下拉菜单中通过矩阵框进行选择。</li>
		<li>对每个通道重复此操作。 单击“Finish”以保存补偿矩阵（.ctm 文件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将原始文件（.rif）加载到分析软件中并应用补偿矩阵，从原始文件生成数据分析文件（.daf）。</li>
	<li>数据加载完成后，进行设门以识别T细胞-抗原呈递细胞接触事件。 
	注意： 典型的设门策略包括识别合焦事件，根据大小标准（事件的面积与长宽比）选择双联体，并将T细胞-APC双联体定义为同时表达T细胞标记物和APC标记物的双阳性事件图1A-C). 
	注意： 长宽比是某个事件的宽度与其高度的比值，可用于区分单细胞（比值接近1）与双联细胞（比值接近0.5）。</li>
	<li>通过绘制明场通道中成像强度轮廓变化率的均方根（梯度均方根，gradient RMS）来识别合焦事件图1A)。单击梯度RMS直方图以显示各个分箱中的细胞事件，然后绘制门控以排除失焦事件。</li>
	<li>根据明场通道的面积与长宽比作图，并绘制一个基于事件形状和大小来识别双联体的门控图1B）。复查位于该门边界内侧和外侧的事件图像，可帮助分析人员优化门的大小和位置。随后，构建双峰事件的图谱，其中T细胞标记物的强度位于一个轴上，抗原呈递细胞（APC）标记物的强度位于另一轴上。绘制包含两种标记物均为阳性的双峰事件的T-APC双峰门。</li>
	<li>在T细胞-APC双细胞事件中，筛选仅包含一个T细胞和一个APC的事件。
	<ol>
		<li>通过绘制 APC 标记物的长宽比与面积的关系图，并对包含单个 APC 的双联体进行设门来实现此操作图1D）。绘制T细胞标记物的长宽比与面积的关系图，并对包含单个T细胞的双联体进行设门（图1E). 
		注意： 通过绘制斑点计数函数在细胞核染色荧光上的直方图，并对仅含有两个斑点的事件进行设门，可进一步优化结果。图1F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在某些情况下，双细胞中的两个细胞可能并不相互接触；为识别相互接触的细胞，需分别定义抗原呈递细胞和T细胞的物体掩膜。
	<ol>
		<li>使用分析菜单中的“Masks”选项打开 Masks 管理器并定义新掩膜。 输入名称，例如“T细胞对象掩膜”。单击“Function”按钮，在弹出的对话框中选择“Object”。</li>
		<li>选择检测T细胞标记物的通道（例如， Ch06)。点击“OK”。 
		注意： “对象（M06，Ch06，紧密）”显示在函数框中。此默认对象掩膜通常效果良好，但可能需要优化。</li>
		<li>重复此过程，以在相应通道中创建 APC 对象掩膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在确定 APC 和 T 细胞的掩膜后，通过绘制 APC 对象掩膜中 T 细胞标记物的荧光强度与 T 细胞对象掩膜中 APC 荧光强度的关系图来判断细胞膜接触。在该图中绘制一个门控区域，仅包含相互接触的细胞。 
	注意： 通常，双阳性与双阴性细胞群较为清晰分明（图2A). 双阳性与双阴性细胞群之间的分界可通过观察分界区域细胞的明场图像来确定，以确保相互接触的细胞位于门控范围内，而未接触的细胞被排除在外。</li>
	<li>在此阶段，手动检查该门控内事件的鬼笔环肽FITC图像，以区分成熟的免疫突触与简单的细胞-细胞接触。 使用“标记图像”功能来标记这些图像。 
	注意： 该门控内标记事件（免疫突触）的百分比可作为所研究T细胞群直接同种反应性的指标。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

成像流式细胞术已被用于证明单克隆T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间，或在超抗原存在条件下免疫突触的形成24,25,26,27,28。该方法利用了这样一个事实：在有效的T细胞-APC接触后，T细胞会重排其肌动蛋白细胞骨架，并将其极化至接触部位21。这种重排依赖于TCR信号传导，因此是T细胞活化的早期指标19,20,21。本文所述方法将这一策略改进用于多克隆T细胞群体中异反应性T细胞频率的测定。因此，该方法未来可能为临床移植中供体反应性检测的开发提供基础。
尽管尚未进行直接比较，但检测同种反应性免疫突触似乎比传统的混合淋巴细胞反应（MLR）具有更强的预测能力。例如，先前的研究表明，在上述耐受诱导方案中，MLR的结果无法可靠地与移植物结局相关联2。
已开发出多种检测人类临床耐受状态的检测方法9,10,11，但这些方法无法测量效应细胞对同种异体抗原的应答功能。 相比之下，IFNγ ELISPOT 检测法8能够测定效应T细胞功能，但无法全面捕捉可能与急性和慢性移植物排斥反应相关的细胞因子分泌谱，例如IL-1738,39。 限制性稀释试验4操作繁琐，而trans-vivo检测法6则需要使用小鼠，两者均存在显著的实际应用局限性，难以在临床环境中推广。近年来，通过对混合淋巴细胞反应（MLR）中应答T细胞的TCR序列分析来评估增殖细胞的方法有所改进，可能具有应用价值，但与本文所述检测方法一样，仍需在临床研究中进一步验证18,40。
免疫突触检测实验的进一步发展需要回答若干重要问题。首先，目前建立的实验方法仅能检测直接同种反应性。直接途径涉及由供体来源的抗原呈递细胞（APC）呈递同种异体MHC/肽复合物。这类细胞通常在移植后很快被清除，随后的同种抗原呈递主要由受体自身的APC完成，其可通过半直接途径呈递完整的供体MHC，或通过间接途径在自身MHC上呈递经过加工的供体抗原。其中，间接途径是慢性移植物排斥反应的重要驱动因素33,41。
原则上，使用本实验方法应可检测间接性免疫突触，但间接同种反应性T细胞的频率远低于直接同种反应性T细胞42,43，这意味着需要分析更大量的事件。第二个需考虑的因素是，我们仅使用CD4+ T细胞测试了该方法，而CD8+ T细胞也是抗供体反应的重要组成部分。同样，使用本方法应可检测CD8+ T细胞与抗原呈递细胞之间的突触。另一项局限性在于，该方法在最终的膜接触门控步骤中需要对细胞图像进行人工审阅和分析，目前我们正在致力于实现该步骤的自动化。
最后，该方法需要在人体受试者中进行测试和开发，目前正使用人类样本开展初步研究。进一步的T细胞亚群表型分析（即效应，记忆，调节 等等。将免疫突触的检测与移植受者中异反应性T细胞库的表征相结合，将是一种强大的研究方法，并将成为未来研究的重要方向。

实体器官移植已彻底改变了终末期肾、肝、心和肺疾病患者的治疗方式。 然而，由于供体与受体在主要和次要组织相容性抗原上存在差异，若不使用免疫抑制药物，受体T细胞会迅速排斥同种移植物。这些药物具有多种不良反应，包括增加癌症风险和器官功能障碍。因此，一个重要的临床目标是将免疫抑制剂的剂量降低至能够防止同种移植物排斥反应所需的最低水平。这一水平可能因个体间固有免疫系统的激活程度、供体与受体间同种抗原错配程度，以及患者之间的免疫功能、药代动力学和药效动力学差异而有所不同。
遗憾的是，移植临床医生目前尚无任何工具可准确评估个体患者中供体的免疫反应性1。 混合白细胞反应（MLR）虽可检测供体反应性，但无法可靠预测移植物的预后2,3。有限稀释试验、细胞因子ELISPOT以及trans-vivo试验，要么仅能测量有限范围的免疫应答，要么缺乏临床实用性4,5,6,7,8。基因表达谱已揭示出与操作性耐受9,10,11,12和排斥反应13,14,15相关的特征性标志，但这些标志在不同人群间并不总是具有普适性16，最终在个体患者中的应用价值可能有限。 基于测序的外周血T细胞T细胞受体（TCR）分析17，或在MLR中增殖的T细胞的TCR分析18也已被开发，但仍需进一步验证。
从概念上讲，理想的检测方法应能识别受体T细胞被供体抗原激活的最早必要步骤。 由于长时间培养细胞（如混合淋巴细胞反应）可能引入人为假象，因此这种检测最好无需测量下游事件，例如细胞增殖或效应功能。然而，同样理想的是，该检测应依赖于T细胞功能的某些方面，因为纯描述性评估 （例如，TCR测序）可能无法区分无能T细胞与功能性T细胞。
大量研究表明，T细胞与抗原呈递细胞之间的长时间接触是免疫突触形成的必要条件，而免疫突触的形成是T细胞应答的关键初始步骤19,20,21,22我们最近报道，在动态过程中 体外 延时成像显示，约5 - 10%的小鼠CD4+ T细胞与同种异体骨髓来源树突状细胞（BMDCs）形成持久性接触23. 在排斥移植物的动物中，长时间接触的频率增加；而在先前对相同抗原产生耐受的小鼠中，该频率仍保持在未移植小鼠的水平23. 在存在受体调节性T细胞（Tregs）时，长时间相互作用减少，而在其缺失时增加；我们使用人T细胞和同种异体单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）也观察到类似现象。23.
然而，在多克隆T细胞群体中逐个统计长时间接触事件十分耗时且劳动强度大。因此，我们采用成像流式细胞术来检测同种异体免疫突触的形成。成像流式细胞术结合了传统流式细胞术的多参数数据采集与分析能力以及荧光显微镜的单细胞成像能力。其他研究者已利用该技术研究单克隆T细胞的免疫突触形成24,26,27，或在超抗原存在条件下的免疫突触形成28。然而在这些实验条件下，应答T细胞的频率通常在30%至100%之间，而同种反应性T细胞一般仅占总T细胞库的5%至15%29,30,31,32。重要的是，我们已证明成像流式细胞术能够提供与同种反应性T细胞频率高度一致的测量结果23，并且多克隆T细胞群体中突触频率的变化可预测移植物的预后23。目前，该方法已优化用于检测CD4+ T细胞的直接同种反应性，但原则上也可进一步开发用于研究CD8+ T细胞及间接识别途径。间接同种反应性被认为在移植术后较晚期阶段变得愈发重要33。我们目前正在开发该方法以使用人源细胞，从而可在患者中进行测试。因此，未来该整体方法可能在移植受者中具有应用价值，可用于移植前、移植后即刻以及长期随访期间T细胞应答的功能性评估，尤其是在需要减少药物用量的阶段。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Various</td><td>Varies</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸，0.5 M 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>非离子型去垢剂 Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>溶液为 37% 甲醛，需稀释 25 倍以获得 1.5% 溶液</td></tr><tr><td>细胞筛网，70 &amp;mu;m 孔径</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素 D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr><tr><td>别藻蓝蛋白偶联的抗小鼠 CD90.2 抗体</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>太平洋蓝偶联的抗小鼠 CD11b 抗体</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>eBioscience 已用 eFluor 450 替代太平洋蓝</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD3 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 MHC II 类分子抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 B220 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD8 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD19 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 磁性细胞分选仪</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>人 TGF&amp;beta;1 对小鼠细胞具有活性</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>成像流式细胞仪；详情请访问 http://www.emdmillipore.com/</td></tr><tr><td>IDEAS 软件</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>免费下载（需注册）：https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>细胞培养基&amp;nbsp;</td><td>Various</td><td>Varies</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Various</td><td>Varies</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板</td><td>Various</td><td>Varies</td><td></td></tr></tbody></table>

使用成像流式细胞术测量t细胞同种异体反应性

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

移植受者对供体抗原免疫反应性的检测对于成功减少或撤除免疫抑制治疗可能至关重要。混合白细胞反应（MLR）、有限稀释分析以及 体内跨细胞 迟发型超敏反应（DTH）检测已被应用于该问题的研究，但这些方法的预测能力有限，和/或存在显著的实际应用局限性，从而降低了其使用价值。 成像流式细胞术是一种将流式细胞术的多参数定量能力与荧光显微镜的成像功能相结合的技术。我们近期采用成像流式细胞术方法，定义了能够与供体抗原呈递细胞（APCs）形成成熟免疫突触的受体T细胞所占的比例。利用一个特征明确的小鼠心脏移植模型，我们已证明该频率的 体外 T-APC膜接触事件中的免疫突触可强烈预测移植排斥、耐受以及依赖诱导性调节性T细胞维持移植物存活等情况下的移植结局。 T-APC 相互作用频率在急性排斥反应小鼠来源的 T 细胞中增加，而在对同种异体抗原无应答的小鼠来源的 T 细胞中减少。向体系中加入调节性 T 细胞后 体外 系统减少了T-APC间长时间的接触。重要的是，在多克隆扩增的天然人调节性T细胞中也观察到相同效应，这类细胞已知可在人源化小鼠模型中控制人组织的排斥反应。该方法的进一步发展可能有助于更深入地表征移植受者中同种反应性T细胞亚群。未来，利用人细胞对该方法进行进一步开发和评估，可能为筛选适合减少免疫抑制治疗的患者提供检测基础，并可用于临床评估耐受诱导疗法的效果。

该方法用于研究CD4+ 心脏异位移植前对供体同种抗原产生耐受的小鼠中T细胞的同种反应性 CBA 小鼠 (H-2k）接受了一项耐受诱导方案，该方案包括供体特异性（B6，H-2b输血联合非耗竭型CD4抗体治疗，在接受B6心脏移植前一个月进行。该方案可实现长期同种异体移植物存活，且此存活依赖于Foxp3+ 调节性T细胞36,37移植后7天，脾脏CD4+ T细胞取自已耐受和未耐受的B6心脏同种异体移植物受体，并根据本方案与B6骨髓来源的树突状细胞共孵育。 图2 显示本实验的代表性数据。膜接触门如图所示。 图 2A，绿色十字准线标记在突触事件上（左图，1）和非突触事件上（右图）。 图2B 显示了该事件的明场和荧光通道。为减少偏倚，数据由对分组信息设盲的观察者进行分析。23如在多个示例中所示 图3，均来自非耐受个体 (图3A-B) 和耐受化（图3C-D在B6心脏的CBA受体中，突触可通过T-APC界面处存在致密的FITC阳性嵴而与非突触接触轻易区分。这些结果表明，受体T细胞形成的免疫突触的可视化检测可反映受体中同种反应性的程度。
<img alt="流式细胞术数据分析，CD11c/CD90 散点图与荧光显微镜，膜接触检测" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 具有膜接触和免疫突触形成的T-APC双细胞的鉴定 最终双峰门控中的事件（图1F) 进行分析。 A. 在树突状细胞（DC）对象掩膜中的APC标记物荧光信号相对于在T细胞对象掩膜中的APC标记物荧光信号进行作图分析。 一些双联体事件包含一个 APC 和一个 T 细胞，但二者之间无细胞-细胞接触，出现在图中左下角（图像未显示）。因此可设定一个膜接触门，仅包含 T 细胞与 APC 发生接触的双联体。对该门内每个事件的图像，在鬼笔环肽-FITC 通道中审查肌动蛋白细胞骨架重排的证据，并可使用分析软件进行标记。左侧面板显示一个免疫突触事件（标记为 1，绿色十字线指示），右侧面板显示一个无免疫突触形成的膜接触事件（标记为 2，绿色十字线指示）。免疫突触形成的判定需手动审查这些图像，如 B 所示。 B. 上排显示的是具有免疫突触的双细胞聚集体的明场和荧光通道图像（对应于 A 中的事件 1）；下排显示的是具有膜接触但未形成突触的双细胞聚集体图像（对应于 A 中的事件 2）。数据在不知悉分组处理信息的情况下进行分析，来源于此前已发表的实验。23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光显微镜结果；显示明场下的 CD11c、CD90 标记物及鬼笔环肽染色合并图像。" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. T-APC 突触形成的示例。 CBA 小鼠在接受 B6 供体的心脏异体移植物后，未进行预处理（A–B）或在非耗竭型抗 CD4 抗体保护下通过 B6 全血诱导耐受（C–D）。7 天后，检测脾脏 CD4+ T 细胞与 B6 树突状细胞（DC）之间突触的形成情况。A. 来自未耐受动物的三个无突触形成的双细胞聚集体（doublets）示例，显示存在膜接触。B. 来自未耐受动物的三个免疫突触示例。C. 来自耐受动物的三个无突触形成的双细胞聚集体示例，显示存在膜接触。D. 来自耐受动物的三个免疫突触示例。突触的形成由 T-APC 界面处明亮的 FITC 阳性环状结构（Ch03）指示。数据根据治疗分组进行盲法分析，来自此前已发表的实验23。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体/染料</td>
			<td>荧光素</td>
			<td>通道</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>eF450</td>
			<td>Ch02</td>
			<td>5 µg/mL，需根据实验条件进行滴定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>APC</td>
			<td>Ch06</td>
			<td>5 µg/mL，需根据实验条件进行滴定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>FITC</td>
			<td>Ch03</td>
			<td>0.05 - 0.5 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>-</td>
			<td>Ch05</td>
			<td>25 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 本研究中使用的抗体和染料。 表中列出了荧光染料偶联的抗体、染料、供应商及推荐浓度。同时，表中还显示了用于检测每种荧光染料的成像流式细胞仪通道。

本文介绍了一种利用成像流式细胞术在混合T细胞群体中检测同种反应性的方法。

使用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性

移植受者对供体抗原的免疫反应性检测可能对于成功减少或撤除免疫抑制治疗至关重要...

本实验的总体目标是利用成像流式细胞术来检测T细胞的同种反应性。该方法有助于回答移植免疫学中的关键问题，例如受体T细胞中有多少比例对供体同种抗原具有反应性。该技术结合了流式细胞术的多参数定量能力与荧光显微镜的成像功能，从而实现对单个T细胞与抗原呈递细胞突触的高通量分析。演示该操作的是来自我实验室的博士后 Sajad Moshkelgosha。首先，将 0.5 × 10⁶ 个树突状细胞接种至 96 孔细胞培养板的每孔中，随后加入 1 × 10⁶ 个 T 细胞，最终每孔培养基总体积补至 50 µL。将低温培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。然后，向每孔加入三倍于培养液体积的含1.5%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下固定30分钟。固定结束后，将每孔中的细胞转移至相应的5毫升聚苯乙烯管中。在避光条件下，用100 µL洗涤缓冲液中的适当荧光染料偶联抗体对细胞染色，室温孵育30分钟。随后，用1 mL洗涤缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于含有鬼笔环肽-FITC的破膜/洗涤缓冲液中。再次于避光条件下室温孵育30分钟后，用1 mL新鲜的破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞。将沉淀物重悬于含感兴趣核染料的破膜/洗涤缓冲液中，室温避光孵育30分钟。先用一毫升破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，再单独用洗涤缓冲液洗涤一次。然后，将细胞重悬于50至100微升新鲜洗涤缓冲液中。将细胞转移至带盖的小型微量离心管中。为分析细胞间相互作用，首先保留一个通道用于明场图像采集，并加载第一个对照管。关闭明场通道后，在工作区窗口中，为每个使用的通道创建一个新的散点图，以面积比为参数。圈入选取长宽比接近1的单细胞群体。针对每种荧光染料，检查阳性细胞群，并根据需要在照明框中调整激光电压。在通道框中，选择与染色所用荧光染料对应的适当通道。然后，点击记录。当事件数量达到预设阈值时，采集将自动停止。在完成所有单染对照样本的采集后，加载第一个实验样本管，并在适当的分析通道（包括明场通道）下采集数万次事件。为生成补偿矩阵，将单染对照数据文件加载到补偿向导中，并为实验选择适当的荧光通道。确认已正确选择阳性细胞群后，双击矩阵中的数值，并为每个通道将图形添加到分析区域。单击“完成”以将补偿矩阵保存为 CTM 文件。将RIF文件载入相应的分析软件中。将RIF文件转换为用于数据分析的DAF文件。打开第一个样品文件。绘制明场通道中成像强度变化率的均方根。然后，绘制抗原呈递细胞标记物的长宽比与面积的关系图。圈选包含单个抗原呈递细胞的双细胞团。绘制T细胞标志物的长宽比与面积的关系图。对包含单个T细胞的双联体进行设门。为了鉴定相互接触的细胞，在分析菜单下使用掩膜（masks）选项打开掩膜管理器，并将新掩膜命名为T细胞对象掩膜。单击功能按钮，在弹出的对话框中选择“对象”。选择检测T细胞标记物的通道，然后单击“确定”。以相同方式在相应通道中为抗原呈递细胞标记物创建掩膜。将抗原呈递细胞对象掩膜中的T细胞标记物荧光强度与T细胞对象掩膜中的抗原呈递细胞荧光强度进行对照作图。然后，绘制一个门控，仅包含相互接触的细胞。最后，手动检查该门控内事件的鬼笔环肽FITC图像，利用标签图像功能标记这些图像，以区分成熟的免疫突触与简单的细胞间接触。此处所示为移植后7天来自耐受与非耐受B6心脏异体移植物受体的脾脏CD4阳性T细胞，与B6骨髓来源树突状细胞共孵育后获得的膜接触门控。绿色十字标记出突触性和非突触性事件的位置。亮场和荧光通道分析还可实现对单个突触性和非突触性事件的可视化。事实上，通过T细胞与抗原呈递细胞接触界面处存在致密的FITC阳性脊状结构，可轻松区分来自未耐受和已耐受CDA小鼠的B6心脏移植受体中的突触性连接与非突触性接触。随着进一步的发展，该技术未来可能应用于临床环境，例如用于减少或撤除免疫抑制剂，或预测人体移植受者的移植物预后。

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