使用成像流式细胞仪T细胞同种异体反应性测定

该程序的总体目标是使用成像流式细胞术测量 T 细胞同种异体反应性。这种方法可以帮助回答移植免疫学中的关键问题，例如受者的 T 细胞中有多少比例对供体同种异体抗原有反应。该技术将流式细胞术的多参数定量能力与荧光显微镜的成像能力相结合，允许对单个 T 细胞抗原呈递的细胞突触进行高通量检查。

演示该程序的是我实验室的博士后 Sajad Moshkelgosha。首先将零点 5 乘以 10 接种到第六个树突状细胞。放入 96 孔细胞培养板的每个孔中，然后是 1 乘以 10 至第 6 个 T 细胞，最终体积为每孔总体积高达 50 微升的培养基。

将冷培养物在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下孵育 4 小时。然后，在室温下向每个孔中加入 3 倍培养体积的 1 点 5% 甲醛的 PBS 溶液，持续 30 分钟。固定结束时，将细胞从每个孔转移到相应的 5 ml 聚苯乙烯管中。

在室温避光，在 100 μL 洗涤缓冲液中，用适当的荧光染料偶联抗体对细胞进行 30 分钟的染色。接下来，在一毫升洗涤缓冲液中洗涤细胞，并将沉淀重悬于含有鬼笔环肽 FITC 的烫发/洗涤缓冲液中。在避光室温下再放置 30 分钟后，用 1 mL 新鲜烫发/洗涤缓冲液洗涤细胞。

沉淀重悬于渗透/洗涤缓冲液中的目标核染料中，在室温下避光孵育最后 30 分钟。在 1 毫米的渗透/洗涤缓冲液中洗涤细胞，然后单独在洗涤缓冲液中洗涤 1 次。然后，将细胞重悬于 50 至 100 μL 的新鲜洗涤缓冲液中。

将细胞转移到小加盖微量离心管中。为了分析细胞间的相互作用，首先保留一个通道用于明场图像采集并加载第一个对照管。关闭明场通道后，在工作区窗口中，为与该区域上的纵横比一起使用的每个通道创建一个新的散点图。

Ingate 纵横比接近 1 的 singlet。对于每种荧光染料，检查阳性群体并根据需要调整照明盒中的激光电压。在通道框中，为染色中使用的荧光染料选择合适的通道。

然后，单击 record（录制）。当事件数达到指定阈值时，采集将自动停止。采集完所有单一染色对照后，加载第一个实验样品管，并在适当的分析通道（包括明场通道）下采集数万个事件。

要生成补偿矩阵，请将单染色对照数据文件加载到补偿向导中，并为实验选择合适的荧光通道。确认选择了正确的阳性群体后，双击矩阵中的一个值，并将图形添加到每个通道的分析区域。单击 finish 将补偿矩阵另存为 CTM 文件。

将 RIF 文件加载到相应的分析软件中。将 RIF 文件转换为数据分析 DAF 文件。打开第一个示例文件。

绘制明场通道中成像强度变化率的均方根。然后，绘制抗原呈递细胞标志物的纵横比与面积的关系图。对包含单个抗原呈递细胞的双峰进行门。

绘制纵横比与 T 细胞标记物面积的关系图。包含单个 T 细胞的双合体上的 Ingate。要识别彼此接触的单元格，请在分析菜单下，使用蒙版选项打开蒙版管理器，并将新的蒙版 T 单元格对象命名为 mask。

单击函数按钮，然后在对话框中选择对象。选择检测到 T 细胞标志物的通道，然后单击 OK（确定）。以相同的方式在适当的通道中为抗原呈递细胞标志物创建掩码。绘制抗原呈递细胞对象掩模中的 T 细胞标志物荧光强度与 T 细胞对象掩模中的抗原呈递细胞荧光强度的关系图。

然后，绘制一个仅包含彼此接触的细胞的门。最后，手动查看该门内事件的鬼笔环肽 FITC 图像，以使用标记图像功能标记这些图像，以区分成熟的免疫突触和简单的细胞间接触。在这里，显示了移植后 7 天从耐受和非耐受的 B6 心脏同种异体移植物受者获得的脾 CD4 阳性 T 细胞的膜接触门，并与 B6 骨髓衍生的树突状细胞共孵育，如图所示。

突触和非突触事件由绿色十字线表示。Brighfield 和荧光通道分析还允许可视化单个突触和非突触事件。事实上，来自 B6 心脏的不耐受和耐受的 CDA 受体的突触很容易与 T 细胞抗原呈递细胞界面处存在致密的 FITC 阳性脊区分开来。

经过进一步开发，该技术可能能够应用于临床环境，例如，减少或撤销免疫抑制或预测人类转录受体的移植物结果。