利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

本肝脏消化方案的总体目标是通过流式细胞术评估各类肝前体细胞亚群，并利用一种新型表面标志物组合将这些细胞高纯度地分离出来，用于后续深入分析。该方法有助于解答关于肝前体细胞生物学的多个问题，例如，不同亚群的特异性特征是什么，以及在肝损伤过程中其远端成因是什么。该技术的主要优势在于能够实现前体细胞的高纯度和高活性分离，这对于体外分析至关重要。

尽管这种消化技术有助于了解前体细胞的生物学特性，但实际上也可用于分离造血细胞和内皮细胞群体。为从小鼠肝脏制备单细胞悬液，将肝叶转移至干燥的培养皿中，使用解剖刀将组织切成约2毫米见方的均匀小块。将组织块分装至每肝两支15毫升圆锥形离心管中，每管含有2.5毫升消化缓冲液。

将样本置于37摄氏度水浴中，轻度振荡，分别在5分钟和10分钟时进行处理。消化15分钟后，使用去尖端的1,000微升移液器轻轻吹打肝脏组织块。然后将离心管放回水浴中，静置2分钟使组织块沉降。

接着，将上清液分两次过滤，每次约 700 微升，通过预先用 800 微升收集缓冲液润湿的 100 微米滤网。然后用新鲜的消化缓冲液替换已去除的上清液。当肝组织不再可见时，将消化管中的全部上清液通过滤网过滤。

通过离心收集所有细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升室温的氯化铵钾裂解缓冲液中，裂解1分钟后加入5毫升新鲜收集缓冲液终止反应。再次通过离心收集细胞。

然后，小心吸除上清液，避免扰动松散的沉淀。将细胞重悬于4 mL预冷的新鲜收集缓冲液中，置于冰上。为了通过流式细胞术测定肝组织样本的细胞数量，首先在1.5 mL聚苯乙烯管中加入20 µL肝细胞悬液、174 µL PBS和6 µL碘化丙啶。

加入计数微球以实现细胞定量，并将微球与细胞混合物上样至流式细胞仪。通过前向散射与侧向散射参数设门，排除碎片。通过前向散射高度对前向散射面积设门排除双联体，并排除碘化丙啶阳性的死细胞。

然后，将30 µL样品上样至流式细胞仪并记录事件。为了对肝细胞进行染色以通过流式细胞术分析前体细胞亚群，将2×10⁵个细胞等分试样转移至1.5 mL反应管中，并通过离心收集细胞沉淀。

将沉淀物重悬于冰上的 Fc 封闭液中，孵育 5 分钟。然后向相应的试管中加入 50 µL 感兴趣的细胞表面染色抗体混合液，在冰上避光孵育 20 分钟。孵育结束后，每份样品用 400 µL 染色缓冲液洗涤。

将沉淀物重悬于 100 微升适当的二抗混合液中，冰上避光孵育 20 分钟。然后用另外 400 微升染色缓冲液洗涤细胞。再将沉淀物重悬于含有碘化丙啶的 300 微升染色缓冲液中。

使用流式细胞仪检测样品。为通过磁性微珠分离法富集前体细胞群体，将 1.5–2×10⁶ 个细胞转移至适量的 15 毫升锥形管中，并通过离心收集细胞。用含 BSA 的 400 微升 HBSS 重悬细胞沉淀。

加入40微升抗CD31磁珠和30微升抗CD45磁珠，于4摄氏度孵育15分钟。接着，用5毫升含BSA的HBSS洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于100微升去死细胞磁珠中，室温孵育15分钟。

在细胞孵育的同时，使用三毫升含BSA的HBSS缓冲液平衡每份肝脏所需的适当尺寸的阳性选择柱。然后向细胞中加入900微升含BSA的HBSS缓冲液，并通过100微米的聚酰胺滤膜过滤细胞。将经过滤的、与磁珠孵育过的细胞上样至柱中，用离心管收集流出液。

当所有细胞流经柱子后，用含有 BSA 的 HBSS 缓冲液洗涤柱子三次，每次三毫升。通过离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于 100 微升洗涤缓冲液和 Fc 封闭剂中。收集来自四至六个肝脏的细胞沉淀，或不超过 1×10⁶ 个阴性筛选细胞。

孵育5分钟后，在冰上用生物素标记的抗GP38抗体对细胞进行标记，持续10分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并重悬于400微升洗涤缓冲液和5微升抗生物素微珠中。在4摄氏度下孵育15分钟后，立即用5毫升洗涤缓冲液洗涤细胞。

将沉淀重悬于1毫升新鲜洗涤缓冲液中。将重悬的细胞置于预冷的15孔管架上，开始自动磁性分离。然后离心穿流液，并将沉淀物重悬于适合后续实验分析的相应溶液中。

通过门控筛选CD45、CD31以及去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein one receptor）呈阴性的细胞，可富集肝前体细胞，随后可根据其糖蛋白38（gp38）和CD133的表达情况进行分群。在健康成年小鼠肝脏中，gp38阳性CD133阳性细胞以及gp38阴性CD133阳性细胞是CD45阴性CD31阴性ASGPR1阴性细胞中最丰富的细胞群体，它们在多种既往与前体细胞相关的表面标志物表达上表现出明显差异。如上所述，采用磁性微珠法分离这些前体细胞，可获得纯度超过90%、且具有高活力的肝细胞。

在尝试分离这些稀有细胞时，必须考虑肝脏消化步骤中所使用的酶，因为不同的酶可能优先获得特定的前体细胞亚群，并显著降低CD133的表达水平。需要牢记的是，细胞的纯度和得率取决于肝脏单细胞悬液的轻柔制备过程，而大量的细胞碎片和死亡细胞污染会对此实验方案的成功产生负面影响。