Name: 分离和新型表面标记组合来标识肝祖亚群富集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解如何使用流式细胞术和新型表面标记组合从小鼠肝脏中分离高纯度肝祖细胞亚群。该方法有助于深入研究肝损伤过程中的细胞生物学特性及其再生机制。

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本工作获得了亚历山大·冯·洪堡基金会索菲娅·科瓦列夫斯卡娅奖对VLK的资助。

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作者无竞争性财务利益。

不同原因引起的肝脏炎症和损伤会触发肝脏的再生过程，伴随前体细胞的扩增和活化2,3。这些肝脏前体细胞具有干细胞特性，可能在多种肝脏疾病的发病机制中发挥重要作用。
长期以来，肝前体细胞的异质性一直被广泛认为存在。通过采用CD133和gp38这一新型表面标志物组合对肝前体细胞亚群进行重新评估，可鉴定出携带不同表面标志物并在肝损伤过程中表达特定炎症相关基因集合的亚群12。本文所述方法可实现对稀有细胞的直接流式细胞术分析，并可在多种肝损伤模型中对其进行直接比较。这一点尤为重要，因为不同类型的损伤可激活多种前体细胞亚群，这可能反映了导管反应中所观察到的细胞异质性3,4,11,12</sup...

肝脏再生主要与肝细胞的自我更新能力相关。然而，在慢性肝损伤过程中，前体细胞会被激活并扩增，这一现象与其分化为肝细胞和胆管细胞的能力有关1,2,3,4。这一点尤为重要，因为在慢性损伤期间，肝细胞的增殖并不有效。尽管已有多种针对前体细胞的遗传谱系示踪研究，但它们在肝脏再生中的作用仍存在争议5,6,7,8。此外，前体细胞的激活已被证实与肝脏纤维化反应增强相关，这引发了关于其在损伤过程中确切作用的疑问9,10。
基因表达研究长期提示祖细胞区室具有异质性，这些研究通过显微解剖或基于细胞分选的方法分离出仅表达单一表面标志物的祖细胞1,11。事实上，最近一项研究利用gp38（podoplanin）这一新型表面标志物组合，明确地将先前已知的祖细胞单一标志物与不同亚群关联起来12。重要的是，这些亚群不仅在表面标志物表达上存在差异，在损伤过程中还表现出功能上的改变12。
已采用多种动物模型来研究前体细胞的活化及肝脏再生过程。不同类型的损伤似乎会促进不同亚群前体细胞的活化12，这或许可以解释在人类中观察到的导管样反应的表型差异4。因此，对前体细胞进行复杂的表型和功能分析，对于理解其在损伤中的作用以及导管样反应在肝病中的真正意义至关重要。
除了表面标志物组合之外，细胞分离方案中的关键差异进一步加剧了基于以往研究得出结论的复杂性2。大量研究探讨了祖细胞的作用，而这些研究中祖细胞的分离方案存在显著差异（例如，肝脏解离（酶的组合及处理时间）、密度介质以及离心速度）2。近期已开发并发表了一种优化的分离技术，该技术可提高稀有细胞群体的存活率，并更真实地反映细胞亚群的组成情况12。本文旨在提供该肝脏细胞分离方法及亚群分析的更详细实验方案，以便准确重复该技术。此外，本方案还包含了与先前分离方法的比较，以展示新旧方案之间的差异。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>酚红-free DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>配制 1% 储存液</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 冲洗液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>加入 0.5% (v/v) BSA 并置于冰上保存</td></tr><tr><td>酚红-free DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>计数微球 Count Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR 封闭试剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD31 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD45 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>抗-生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 纯化抗体</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 纯化抗体</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>稀释比例：1:200，标记造血细胞</td></tr><tr><td>CD31 生物素标记</td><td>BioLegend</td><td>102504</td><td>稀释比例：1:200，标记内皮细胞</td></tr><tr><td>ASGPR1 纯化抗体</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>稀释比例：1:100，标记肝细胞</td></tr><tr><td>Podoplanin APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>稀释比例：1:1,400，标记前体细胞</td></tr><tr><td>Podoplanin 生物素标记</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>稀释比例：1:1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>使用 3 &amp;micro;L，标记前体细胞</td></tr><tr><td>CD133 生物素标记</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>CD34 生物素标记</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>稀释比例：1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>稀释比例：1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 生物素标记</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>使用 10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b, &amp;kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b, &amp;kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a, &amp;kappa; 生物素标记</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a, &amp;kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>叙利亚仓鼠 IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>叙利亚仓鼠 IgG 生物素标记</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊 IgG 对照纯化抗体</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>稀释比例：1:800</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 滤网</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>包含 RLT 裂解缓冲液</td></tr></tbody></table>

利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

在慢性肝损伤过程中，前体细胞会通过一种称为导管样反应的过程发生扩增，该过程还伴随炎性细胞浸润和上皮细胞活化。目前对这类炎症反应中前体细胞群体的研究主要依赖单一表面标志物，通过组织学分析或基于流式细胞术的技术进行鉴定。然而，新发现的表面标志物揭示了肝前体/干细胞区室中存在功能各异的多个亚群。本文所述方法介绍了利用新型表面标志物组合对前体细胞亚群进行分离及详细的流式细胞术分析。此外，还展示了如何通过自动化磁珠分选和FACS分选技术实现各前体细胞亚群的高纯度分离。尤为重要的是，采用新型且简化的酶解离肝脏组织方法，能够以高于现有其他方法的活性高效分离这些稀有细胞群体。该方法对于进一步研究前体细胞具有重要意义

关键词：肝前体细胞，导管样反应，流式细胞术，细胞分选，酶解离，炎症，肝损伤，细胞亚群 体外 或用于分离高质量RNA以分析基因表达谱。

本实验采用一种新型酶混合液消化肝脏，可获得包含实质和非实质肝脏细胞的单细胞悬液（图1 和 图2a）。在使用ACK裂解红细胞后，可直接对单细胞悬液进行流式细胞术分析（图1 和 图2）。设门策略包括排除双联体细胞和死细胞（图2a）。选择CD45、CD31和ASGPR1阴性的细胞进行设门，该细胞群包含肝脏前体细胞，可根据其gp38和CD133的表达情况进行分群（图2a）。在健康成年小鼠肝脏中，gp38+CD133+ 和 gp38-CD133+ 细胞是CD45-CD31-ASGPR1- 细胞中最丰富的细胞亚群（图2a、2b）。这些亚群在其他已知与前体细胞相关的表...

肝脏损伤伴随前体细胞的扩增，这些前体细胞构成一个异质性的细胞群体。对该细胞区室进行新的分类，有助于区分多个细胞亚群。本文所述方法展示了通过流式细胞术分析及高纯度分离各类亚群的技术流程，所获细胞可用于后续多种实验分析。

在慢性肝损伤过程中，前体细胞会扩增，这一过程称为导管反应，同时还伴有炎性细胞的出现……

本肝脏消化方案的总体目标是通过流式细胞术评估各类肝前体细胞亚群，并利用一种新型表面标志物组合将这些细胞高纯度地分离出来，用于后续深入分析。该方法有助于解答关于肝前体细胞生物学的多个问题，例如，不同亚群的特异性特征是什么，以及在肝损伤过程中其远端成因是什么。该技术的主要优势在于能够实现前体细胞的高纯度和高活性分离，这对于体外分析至关重要。尽管这种消化技术有助于了解前体细胞的生物学特性，但实际上也可用于分离造血细胞和内皮细胞群体。为从小鼠肝脏制备单细胞悬液，将肝叶转移至干燥的培养皿中，使用解剖刀将组织切成约2毫米见方的均匀小块。将组织块分装至每肝两支15毫升圆锥形离心管中，每管含有2.5毫升消化缓冲液。将样本置于37摄氏度水浴中，轻度振荡，分别在5分钟和10分钟时进行处理。消化15分钟后，使用去尖端的1,000微升移液器轻轻吹打肝脏组织块。然后将离心管放回水浴中，静置2分钟使组织块沉降。接着，将上清液分两次过滤，每次约 700 微升，通过预先用 800 微升收集缓冲液润湿的 100 微米滤网。然后用新鲜的消化缓冲液替换已去除的上清液。当肝组织不再可见时，将消化管中的全部上清液通过滤网过滤。通过离心收集所有细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升室温的氯化铵钾裂解缓冲液中，裂解1分钟后加入5毫升新鲜收集缓冲液终止反应。再次通过离心收集细胞。然后，小心吸除上清液，避免扰动松散的沉淀。将细胞重悬于4 mL预冷的新鲜收集缓冲液中，置于冰上。为了通过流式细胞术测定肝组织样本的细胞数量，首先在1.5 mL聚苯乙烯管中加入20 µL肝细胞悬液、174 µL PBS和6 µL碘化丙啶。加入计数微球以实现细胞定量，并将微球与细胞混合物上样至流式细胞仪。通过前向散射与侧向散射参数设门，排除碎片。通过前向散射高度对前向散射面积设门排除双联体，并排除碘化丙啶阳性的死细胞。然后，将30 µL样品上样至流式细胞仪并记录事件。为了对肝细胞进行染色以通过流式细胞术分析前体细胞亚群，将2×10⁵个细胞等分试样转移至1.5 mL反应管中，并通过离心收集细胞沉淀。将沉淀物重悬于冰上的 Fc 封闭液中，孵育 5 分钟。然后向相应的试管中加入 50 µL 感兴趣的细胞表面染色抗体混合液，在冰上避光孵育 20 分钟。孵育结束后，每份样品用 400 µL 染色缓冲液洗涤。 将沉淀物重悬于 100 微升适当的二抗混合液中，冰上避光孵育 20 分钟。然后用另外 400 微升染色缓冲液洗涤细胞。再将沉淀物重悬于含有碘化丙啶的 300 微升染色缓冲液中。使用流式细胞仪检测样品。为通过磁性微珠分离法富集前体细胞群体，将 1.5–2×10⁶ 个细胞转移至适量的 15 毫升锥形管中，并通过离心收集细胞。用含 BSA 的 400 微升 HBSS 重悬细胞沉淀。加入40微升抗CD31磁珠和30微升抗CD45磁珠，于4摄氏度孵育15分钟。接着，用5毫升含BSA的HBSS洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于100微升去死细胞磁珠中，室温孵育15分钟。在细胞孵育的同时，使用三毫升含BSA的HBSS缓冲液平衡每份肝脏所需的适当尺寸的阳性选择柱。然后向细胞中加入900微升含BSA的HBSS缓冲液，并通过100微米的聚酰胺滤膜过滤细胞。将经过滤的、与磁珠孵育过的细胞上样至柱中，用离心管收集流出液。当所有细胞流经柱子后，用含有 BSA 的 HBSS 缓冲液洗涤柱子三次，每次三毫升。通过离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于 100 微升洗涤缓冲液和 Fc 封闭剂中。收集来自四至六个肝脏的细胞沉淀，或不超过 1×10⁶ 个阴性筛选细胞。孵育5分钟后，在冰上用生物素标记的抗GP38抗体对细胞进行标记，持续10分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并重悬于400微升洗涤缓冲液和5微升抗生物素微珠中。在4摄氏度下孵育15分钟后，立即用5毫升洗涤缓冲液洗涤细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜洗涤缓冲液中。将重悬的细胞置于预冷的15孔管架上，开始自动磁性分离。然后离心穿流液，并将沉淀物重悬于适合后续实验分析的相应溶液中。通过门控筛选CD45、CD31以及去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein one receptor）呈阴性的细胞，可富集肝前体细胞，随后可根据其糖蛋白38（gp38）和CD133的表达情况进行分群。在健康成年小鼠肝脏中，gp38阳性CD133阳性细胞以及gp38阴性CD133阳性细胞是CD45阴性CD31阴性ASGPR1阴性细胞中最丰富的细胞群体，它们在多种既往与前体细胞相关的表面标志物表达上表现出明显差异。如上所述，采用磁性微珠法分离这些前体细胞，可获得纯度超过90%、且具有高活力的肝细胞。在尝试分离这些稀有细胞时，必须考虑肝脏消化步骤中所使用的酶，因为不同的酶可能优先获得特定的前体细胞亚群，并显著降低CD133的表达水平。需要牢记的是，细胞的纯度和得率取决于肝脏单细胞悬液的轻柔制备过程，而大量的细胞碎片和死亡细胞污染会对此实验方案的成功产生负面影响。

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

分离和新型表面标记组合来标识肝祖亚群富集

本文介绍了从小鼠全肝脏中分离表达CD133的肝干细胞和肿瘤干细胞的方法，该过程包括组织消化、细胞富集和流式细胞术分离。我们还提供了单细胞分离和克隆扩增的先进技术方案。...

CD133+ 肝干细胞的分离与克隆扩增

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文提供了一种详细的组织解离和细胞分馏方法，可用于富集来自人肺近端和远端区域的活体上皮细胞。本文中，这些方法被应用于通过三维类器官培养模型对肺上皮祖细胞进行功能分析。...

人肺上皮前体细胞的分离与富集用于类器官培养

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。...

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。...

活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

了解如何使用流式细胞术和新型表面标记组合从小鼠肝脏中分离高纯度肝祖细胞亚群。该方法有助于深入研究肝损伤过程中的细胞生物学特性及其再生机制。

利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

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