细胞迁移研究在垂直化学和氧梯度聚二甲基硅氧烷的聚碳酸酯微流体装置
2017年2月23日
化学梯度和氧梯度的控制对于细胞培养至关重要。本文报道了一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯 （PDMS-PC） 微流体装置，能够可靠地产生用于细胞迁移研究的化学和氧梯度组合，无需复杂的仪器即可在生物实验室中实际使用。
本实验的总体目标是在垂直化学梯度和氧梯度的各种组合下建立用于哺乳动物细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置。该方法可以帮助回答哺乳动物细胞迁移研究中的关键问题，包括这些梯度对不同类型细胞或具有 ote 基因的细胞迁移的影响。该技术的主要优点是整个实验设置可以在传统培养箱中进行，以获得最佳的细胞培养条件，而无需繁琐的设置和笨重的仪器。
该技术的意义延伸到癌细胞转移能力的诊断，因为可以使用微流体装置表征细胞运动和各种生理相关的梯度。这种方法可以提供对哺乳动物细胞迁移的见解。它还可以应用于其他细胞研究，例如对药物浓度和氧张力的组合进行基于体外细胞的药物测试。
将两克聚二甲基硅氧烷或 PDMS 预聚物转移到模具上，并带有顶层流体通道图案，以形成一层薄薄的 PDMS。然后，将模具放入干燥器装置中，使 PDMS 脱气 60 分钟。脱气后，将模具放入 60 摄氏度的烤箱中过夜，以进行 PDMS 固化。
确保模具位于水平面上。将模具冷却至室温后，将另外 13 克 PDMS 预聚物倒入模具上，然后在干燥器设置中对 PDMS 进行脱气 60 分钟。将一毫米厚的聚碳酸酯或 PC 薄膜缓慢嵌入新鲜的 PDMS 层中，作为气体扩散屏障。
驱逐存在的所有气泡。然后，将模具放入 60 摄氏度的烤箱中过夜。确保模具位于水平面上。
将固化的 PDMS 冷却至室温后，用手术刀将设备切割成大约 5.5 x 5 平方厘米的区域，可以覆盖所有通道模式。然后，从模具中取出 PDMS 实验室。接下来，使用直径为 2 毫米的活检打孔器为入口和出口打孔。
将制造的顶部 PDMS-PC 层存放在远离环境灰尘的地方，以备以后组装。要组装器件，首先将制造的 PDMS-PC 顶层和带有自旋编码 PDMS 膜的晶圆放入氧等离子体表面处理机中，键合面朝上。用 90 瓦的氧气等离子体处理 PDMS 表面 40 秒。
氧等离子体表面处理后立即将顶层粘合到 PDMS 膜上。在粘合层的顶部放一个重物，并将它们放入 60 摄氏度的烤箱中过夜以促进粘合。一旦粘合层冷却到室温，用手术刀将粘合到顶层的膜切割成大约 5.5 x 5 平方厘米的面积。
使用直径为 2 毫米的活检打孔器从硅晶片上剥开粘合结构，并在化学梯度通道的入口和出口处打孔。然后，将膜粘合的顶层和制造的 PDMS 底层放入氧气等离子体表面处理机中，粘合表面朝上。要激活 PDMS 表面，请使用 90 瓦的等离子体 40 秒。
表面处理后立即将顶层和底层连接在一起进行粘合。将重物放在整个粘合设备的顶部，并在 60 摄氏度的烤箱中放置过夜。第二天，将整个制造的设备从烤箱中取出并冷却至室温。
按照文本方案中的说明，通过在设备中制备细胞来开始微流体细胞迁移测定。第 2 天，从从第 0 天开始培养的细胞中吸出培养基，并用 5 ml DPBS 洗涤细胞两次。吸出 DPBS 并加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA，然后在培养箱中孵育细胞 5 分钟，以将细胞从培养瓶表面分离。
细胞分离并悬浮在溶液中后，向培养瓶中加入 8 mL 无血清培养基。将所有液体转移到 15 mL 锥形管中，并在室温下以 140 倍 G 离心 5 分钟。离心后，吸出上清液并加入适量的无血清培养基，使最终细胞密度为 100 万个细胞/毫升。
然后，按照文本方案中的说明取出第一天准备的微流体装置。使用带有 14 号钝针头的 1 毫升注射器，通过化学梯度通道的出口注入无血清培养基，直到培养基从入口处的两个针头流出。然后，从化学梯度通道的出口注入 200 μL 细胞悬液。
在显微镜下观察设备中的细胞培养室，以确认细胞已被引入微流体通道。然后，将设备放入潮湿容器中，并在细胞培养箱中放置 5 小时，以促进细胞粘附在设备表面。同时，在无血清培养基中制备所需浓度的化学品。
将含和不含化学品的无血清培养基吸入两个独立的 3 mL 注射器中，这些注射器连接到高纯度管上。然后，将注射器放在注射泵上，流速为每分钟 1 微升，以备后用。接下来，制备 15 毫升 1 毫升 1 摩尔氢氧化钠溶液和 15 毫升每毫升 200 毫克的邻苯三酚溶液。
将氢氧化钠溶液吸入连接到高纯度 PFTE 管路的 15 毫升注射器中，然后将邻苯三酚溶液吸入连接到高纯度管路的 15 毫升注射器中。将注射器安装在注射泵上，流速为每分钟 5 微升，以备后用。孵育 5 小时后，取出整个装置并将其放在直径为 15 厘米的培养皿上。
使用胶粘剂腻子将设备固定在培养皿中，然后将培养皿转移到培养箱中的活细胞成像显微镜中。将注射器的管路连接到化学梯度通道的入口，以产生化学梯度。然后，将出口连接到通向废液储液罐的管道。
打开带有注射器的注射泵以产生化学梯度。接下来，将含有氯化钠和邻苯三酚的注射器的高纯度管路连接到氧梯度通道的入口。将管道连接到出口以收集废液，并打开带有注射器的注射泵以产生氧气梯度。
在培养皿中加入约 15 毫升双蒸水，以保持装置湿润。然后，设置活细胞成像显微镜进行延时图像捕获，并每 15 分钟拍摄一次图像。按照文本协议中的说明进行数据收集和分析以及梯度表征。
此处显示的是微流体装置内产生的用于细胞迁移的化学梯度的代表性结果。数值模拟结果与以荧光素溶液为化学成分的实验表征吻合较好。也可以使用模拟预先估计其他化学物质（如趋化因子 SDF-1 α）的梯度。
可以使用氧敏感荧光染料对装置内产生的氧梯度进行实验表征。通常，可以在设备内稳定地建立从上游 1% 到下游 16% 的氧梯度。这里显示的是实验期间使用活细胞成像显微镜收集的典型延时图像。
图像分析后，可以计算 A549 细胞的迁移轨迹及其平均运动。在没有梯度的情况下，细胞显示随机迁移，平均移动接近于零。仅使用 SDF-1 α 趋化因子梯度，细胞表现出趋化行为，并按预期向高趋化因子梯度方向迁移。
在只有一个氧梯度的情况下，细胞向低氧方向移动，显示出哺乳动物细胞尚未得到充分研究的气动行为。有趣的是，在趋化因子和氧梯度下，细胞都向低氧梯度移动，表明氧梯度具有主导作用。这一观察结果需要进一步研究。
在尝试此程序时，重要的是要记住在制造过程中将设备调平干净，并在细胞迁移实验期间消除微流体设备设置内的气泡。观看此视频后，您应该对如何准备 PDMS-PC 微流控设备并设置实验以研究化学梯度和氧梯度组合下的哺乳动物细胞迁移有很好的了解。
概述
本研究提出了一种由聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯（PDMS-PC）制成的微流控装置，旨在为细胞迁移研究创建化学和氧气梯度。该装置允许在受控条件下研究哺乳动物细胞迁移，从而促进与癌症转移和药物测试相关的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 微流控
- 细胞迁移研究
背景
- 理解细胞迁移对癌症研究至关重要。
- 化学和氧气梯度影响细胞行为。
- 现有方法可能需要复杂的设置和设备。
- 该装置旨在简化实验过程。
研究目的
- 开发用于研究细胞迁移的PDMS-PC微流控装置。
- 评估化学和氧气梯度对不同细胞类型的影响。
- 为生物实验室提供实用工具。
使用的方法
- PDMS-PC微流控装置的制造。
- 细胞培养和迁移测定的准备。
- 细胞悬液注入装置。
- 在受控梯度下观察细胞行为。
主要结果
- 该装置成功产生了稳定的化学和氧气梯度。
- 观察并记录了细胞迁移模式。
- 该方法对各种细胞类型都有效。
- 获得的见解可以为癌症转移研究提供参考。
结论
- PDMS-PC微流控装置是细胞迁移研究的宝贵工具。
- 它允许探索复杂的生物学问题。
- 这种技术可以增强对生理环境下细胞行为的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microfluidic platforms enabling controlled chemical and oxygen gradients address a critical gap in modeling cell migration under physiologically relevant conditions. This capability enhances predictive confidence in early discovery and preclinical research, particularly for oncology and cell-based drug testing. Integrating such devices into R&D workflows supports mechanistic de-risking and more accurate assessment of cell motility drivers relevant to metastasis and therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell migration mechanisms under orthogonal chemical and oxygen cues.
- Supports functional validation of targets involved in chemotaxis and aerotaxis.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing gradient-specific migration effects.
- Improves predictive confidence for prioritizing migration-related targets.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible microenvironment for quantitative migration assays.
- Standardizes gradient generation for consistent assay outputs across experiments.
- Enables scalable, multiplexed evaluation of compound effects on migration under dual gradients.
- Supports robust screening of candidate modulators in physiologically relevant settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro migration studies with in vivo-like microenvironmental complexity.
- Improves translational continuity by modeling tumor microenvironmental gradients.
- Enables risk-adjusted advancement of compounds with migration-modulating activity.
- Supports biomarker discovery linked to migration phenotypes under combined gradients.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic device bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven migration studies under controlled gradients. It is positioned for use from target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the interplay of chemokine and oxygen gradients in cell migration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative migration readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides trajectory and movement data for comparative analysis across gradient conditions.
- Translational Research: Models disease-relevant microenvironments to inform preclinical decision-making.
- Enterprise Reuse: Offers a platform adaptable to diverse cell types and gradient combinations for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in migration studies.
- Operational Value: Simplifies setup by enabling experiments in standard incubators and minimizes reagent consumption.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing physiologically relevant migration data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and compounds affecting cell motility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and live-cell imaging analysis.
- Needs access to standard cell culture, syringe pumps, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for gradient generation and data analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and gradient conditions with protocol optimization.
- Careful device leveling and bubble elimination are critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Fabrication of the PC-embedded Top Layer
2:59
Assembly of the Device
4:42
Microfluidic Cell Migration Assay
8:38
Results: Characterization of Chemical and Oxygen Gradients Established within the Microfluidic Device, and Study of Cell Migration Under Gradient Combinations
10:35
Conclusion
