Name: 细胞迁移研究在垂直化学和氧梯度聚二甲基硅氧烷的聚碳酸酯微流体装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 了解利用PDMS-PC微流控装置研究哺乳动物细胞在化学与氧梯度垂直组合条件下的迁移行为。该方法可在常规培养箱中进行，简化实验设置，适用于癌症转移和药物测试研究。

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本论文的研究工作得到了中国台湾国家卫生研究院（NHRI）创新研究基金（IRG）（项目编号：EX105-10523EI）、中国台湾科技部（MOST 103-2221-E-001-001-MY2、104-2221-E-001-015-MY3、105-2221-E-001-002-MY2）、中央研究院主题研究计划（AS-105-TP-A06）以及纳米科学与纳米技术研究计划的资助。作者谨此感谢 Rachel A. Lucas 女士对稿件的校对工作。

1. 微流控装置的制备
注意：整个微流控装置均采用软光刻复制 molding 工艺制备13。
<ol>
	<li>微流控器件中PDMS层模具的制备
	<ol>
		<li>使用 commercially available 的绘图或制图软件设计微流控通道图案。将文件提交给公司进行高分辨率透明光刻掩模打印14。</li>
		<li>用丙酮（≥99.5%）、异丙醇（IPA；≥99.9%）和缓冲氧化物刻蚀液（BOE；6:1 NH4F.HF）清洗硅片。用去离子水（DI水）冲洗，并用氮气枪吹干硅片。</li>
		<li>将约20 g负性光刻胶SU-8 2050旋涂在硅片上，先以500 rpm转速旋转15秒，再以2,000 rpm转速旋转30秒。 
		&#8203;注意：旋涂条件应确保在经过光学光刻后，硅片上的SU-8 2050光刻胶层厚度约为75 µm。</li>
		<li>将硅片在65 °C热板上软烘3分钟，然后在95 °C下烘9分钟。软烘后，使用掩模对准器在紫外光下通过设计好的透明掩模对硅片进行曝光；总曝光能量应约为300 mJ/cm2。曝光后烘烤（PEB）：先在65 °C下烘2分钟，再在95 °C下烘7分钟。</li>
		<li>PEB完成后，将硅片浸入SU-8显影液中，在强烈搅拌或超声浴（37 kHz，有效超声功率180 W）中处理7分钟。用丙酮和IPA冲洗硅片，以去除残留的SU-8。</li>
		<li>将硅片与100 µl硅烷（1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷）放入直径为6 cm的培养皿中，置于连接隔膜真空泵的干燥器内，以实现硅片表面的硅烷化处理，防止后续发生非预期键合。开启泵15分钟，关闭后密封干燥器并保持真空状态30分钟。</li>
		<li>将硅烷化处理后的硅片从干燥器中取出，并用胶带固定在直径为15 cm的培养皿上，用于后续的软光刻工艺：</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS层的制备与组装
	<ol>
		<li>PDMS预聚物的制备
		<ol>
			<li>按10:1（v/v）的比例混合PDMS单体（基体）和固化剂。将混合物置于干燥器装置中脱气60分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>嵌入聚碳酸酯（PC）的上层制备
		<ol>
			<li>将2 g PDMS预聚物转移至具有上层流体通道图案的模具中，形成一层薄PDMS。将模具放入干燥器装置中，对PDMS脱气60分钟。</li>
			<li>将模具置于60 °C烘箱中过夜，使PDMS固化。确保模具处于水平位置。</li>
			<li>将模具冷却至室温。再向模具中倒入13 g PDMS预聚物，并在干燥器装置中脱气60分钟。</li>
			<li>缓慢将一片厚度为1 mm的PC薄膜嵌入新鲜的PDMS层中，作为气体扩散屏障；如有需要，排除所有气泡。</li>
			<li>将模具再次放入60 °C烘箱中过夜，确保其处于水平位置。</li>
			<li>将固化的PDMS冷却至室温。使用手术刀将器件切割成约5.5 × 5 cm2的面积，确保能覆盖所有通道图案，然后将PDMS块从模具上剥离。</li>
			<li>使用直径为2 mm的活检打孔器打孔，作为进样口和出样口。将制备好的上层PDMS-PC层避尘保存，以备后续组装。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>底层PDMS层的制备
		<ol>
			<li>将11 g PDMS预聚物倒入用于底层的模具中。将模具放入干燥器中对PDMS脱气60分钟。将模具在60 °C烘箱中过夜，使PDMS固化。确保模具平放于水平面上。</li>
			<li>将PDMS冷却至室温。将器件切割成约5.5 × 5 cm2的面积，确保能覆盖所有通道图案，然后从模具上剥离。将制备好的底层PDMS层避尘保存，以备后续组装。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PDMS膜的制备
		<ol>
			<li>将约4 g PDMS预聚物旋涂在已硅烷化处理的空白硅片上，先以100 rpm转速旋转90秒，再以3,000 rpm转速旋转4秒。将旋涂后的硅片在60 °C烘箱中过夜烘烤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>器件的组装
		<ol>
			<li>将制备好的PDMS-PC上层和带有旋涂PDMS膜的硅片放入O2等离子体表面处理仪中，使待键合表面朝上。以90 W功率进行O2等离子体处理40秒，以活化PDMS表面。</li>
			<li>在O2等离子体处理后立即进行上层与PDMS膜的键合。在键合层上方放置一个重物（约600 g），并将整体放入60 °C烘箱中过夜，以促进键合。</li>
			<li>将键合后的结构冷却至室温，使用手术刀将与上层键合的膜切割成约5.5 × 5 cm2的面积，确保能覆盖所有通道图案。将键合结构从硅片上剥离，并使用直径为2 mm的活检打孔器在化学梯度通道的进样口和出样口处打孔。</li>
			<li>将已键合膜的上层和制备好的底层PDMS层放入O2等离子体表面处理仪中，使待键合表面朝上，以90 W功率进行等离子体处理40秒，以活化PDMS表面。</li>
			<li>表面处理后立即进行上下层的键合。在整套键合器件上方放置一个重物（约600 g），并将其放入60 °C烘箱中过夜。</li>
			<li>将整个制备完成的器件从烘箱中取出，并冷却至室温。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 微流控细胞迁移实验
注意：本文以常用细胞系人肺腺癌肺泡基底上皮细胞（A549）和一种趋化因子基质细胞衍生因子（SDF-1α）为例进行说明。对于研究其他细胞和趋化因子的研究人员，请根据具体情况相应调整实验流程。
<ol>
	<li>第0天：细胞准备
	<ol>
		<li>在含有DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺替代物、10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）抗生素-抗真菌溶液的完全生长培养基中培养A549细胞株。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化传代。</li>
		<li>通过在室温下以140 x g离心3分钟制备实验用细胞悬液。对于微流控装置实验，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并接种至少1 x 106 T75 培养瓶中加入 10 ml 完全培养基培养细胞。 
		&#8203;注意：所有细胞培养操作均在37 °C、5% CO₂的培养箱中进行2 大气</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天：设备准备
	<ol>
		<li>将装置放入 O2 等离子机并用O处理2 在90 W功率下等离子处理40秒，使微流控通道表面具有亲水性。</li>
		<li>表面处理完成后，立即将两根14 G钝头针直接插入PDMS层上化学梯度通道入口处直径为2 mm的孔中进行安装。确保针头不会堵塞微流控通道。抽取0.8 ml ddH₂O2使用带有钝头14 G针头的1 ml注射器注入ddH₂O。2从出口向化学梯度通道注入O，直至两个入口处的针头均有水流流出。</li>
		<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将纤维连接蛋白原液稀释，配制1 ml浓度为50 µg/ml的纤维连接蛋白溶液。</li>
		<li>使用带有钝头14 G针头的1 ml注射器，从化学梯度通道的出口注入纤连蛋白溶液，直至溶液从两个入口端的针头处流出。</li>
		<li>在常规细胞培养箱中将整个装置孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：细胞接种与显微成像
	<ol>
		<li>细胞接种
		<ol>
			<li>吸弃自第0天起培养的细胞的培养基，用5 ml DPBS洗涤细胞2次。吸弃DPBS，加入2 ml胰蛋白酶-EDTA，于培养箱中孵育5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
			<li>等待细胞脱离并悬浮于溶液中后，向培养瓶中加入8 ml无血清培养基（DMEM/F12 + 1% (v/v) 抗微生物-抗真菌溶液）。将全部液体转移至15 ml锥形离心管中，在室温下以140 × g离心5分钟。</li>
			<li>离心后吸弃上清液，加入适量无血清培养基，调节细胞终密度为 1 x 106 细胞/毫升。取出第1天制备的微流控装置，使用血细胞计数板或其它自动细胞计数仪器对细胞进行计数。</li>
			<li>使用1 ml注射器和钝头14 G针头，从化学梯度通道的出口注入无血清培养基，直至两个入口端的针头均有培养基流出。随后，从化学梯度通道的出口注入200 µl细胞悬液。</li>
			<li>在显微镜下观察装置中的细胞培养腔，以确认细胞已引入微流控通道。将装置放入湿润容器中（例如， 一个装有ddH₂O的塑料盒2将细胞放入细胞培养箱中孵育5小时，以促进细胞在装置表面的贴附。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>化学梯度生成试剂的制备
		<ol>
			<li>将化学物质（SDF-1α）用无血清培养基配制至所需浓度（100 ng/ml）。分别将含化学物质和不含化学物质的无血清培养基吸入两个独立的3 ml注射器中，并连接高纯度导管。将注射器安装在注射泵上，设定流速为1 µl/min，备用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>氧气梯度生成试剂的制备
		<ol>
			<li>配制15 ml 1 M NaOH溶液和15 ml 200 mg/ml邻苯三酚溶液。将NaOH溶液和邻苯三酚溶液分别吸入两个15 ml注射器中，注射器分别连接高纯度PTFE管和高纯度管。将注射器安装在注射泵上，设置流速为5 µl/min，备用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>微流控装置设置
		<ol>
			<li>孵育5小时后，将整个装置取出并置于直径15 cm的培养皿中。使用黏性橡皮泥将装置固定在培养皿内。将培养皿转移至孵育箱中的活细胞成像显微镜下进行观察。</li>
			<li>将用于生成化学梯度的注射器管路连接至化学梯度通道的入口，将出口连接至通向废液储液池的管路。启动用于生成化学梯度的注射泵。</li>
			<li>将装有 NaOH 和邻苯三酚的注射器中的高纯度管路连接至氧气梯度通道的入口，将出口管路连接至废液收集装置。启动用于生成氧气梯度的注射泵。</li>
			<li>加入约 15 ml ddH₂O2将O加入培养皿中以保持装置湿润。设置活细胞成像显微镜进行时间序列图像采集，每15分钟拍摄一次图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：数据收集与分析
	<ol>
		<li>将捕获的图像文件传输至计算机。使用开源图像分析软件 ImageJ，结合用于手动追踪的开源插件（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html）以及免费的 Chemotaxis Tool 软件（http://ibidi.com/xtproducts/en/Software-and-Image-Analysis/Manual-Image-Analysis/Chemotaxis-and-Migration-Tool）进行图像分析。15,16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 梯度的表征
注意：可在细胞实验之前或之后对化学梯度和氧气梯度进行表征。
<ol>
	<li>化学梯度的数值模拟
	<ol>
		<li>使用计算流体动力学（CFD）模拟来评估微流控系统的层流特性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧气梯度的实验表征
	<ol>
		<li>制备浓度为 5 mg/ml 的水溶液，溶质为氧敏感性荧光染料三(2,2′-联吡啶)合钌(III)氯化物六水合物。</li>
		<li>将氧敏感性染料溶液分别吸入两个 3 ml 注射器中，注射器连接高纯度管路，并安装在注射泵上，设置流速为 1 µl/min（与生成化学梯度时所用流速相同）。</li>
		<li>将注射器连接的管路接入化学梯度通道的入口，出口连接管路通向废液储液池。启动用于生成化学梯度的注射泵。</li>
		<li>使用倒置荧光显微镜测量荧光强度，激发光通过 470 ± 20 nm 光学滤光片，发射光通过 515 nm 长通发射滤光片，由冷却 CCD 相机采集信号。</li>
		<li>将装有 NaOH 和连苯三酚的注射器通过高纯度管路连接至氧气梯度通道的入口，出口连接管路用于收集废液。启动用于生成氧气梯度的注射泵。</li>
		<li>采集在细胞培养腔中流动的氧敏感性染料的荧光图像。</li>
		<li>停止氧气梯度生成的流动，断开所有与氧气生成通道相连的管路。将气体钢瓶的高纯度管路连接至氧气梯度通道的出口。</li>
		<li>向连接氧气梯度通道的管路中分别通入空气、高纯氮气和高纯氧气，采集细胞培养腔中氧敏感性染料流动时的荧光图像。</li>
		<li>根据参考文献 10 和 11 中所述的 Stern-Volmer 方程，通过分析荧光图像来估算氧气梯度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

制备嵌有PC薄膜的PDMS微流控装置最关键的步骤是：（1）在将PC薄膜插入PDMS预聚物以制备PDMS-PC上层结构时，必须排除所有气泡；（2）确保所有PDMS固化过程均在水平良好的平面上进行。对于细胞迁移实验，最关键的步骤包括：（1）在实验过程中，彻底消除微流控装置、管路和注射泵内的气泡；（2）在进行活细胞成像以观察细胞迁移时，确保微流控装置放置在水平良好的平面上；（3）通过向培养皿中添加ddH2O保持装置湿润，并确保水分不会蒸发干涸。
为了成功制备无分层的PDMS-PC杂化微流控器件，在插入PC膜过程中必须彻底去除所有气泡。插入PC膜时，可将其从一定角度（约15至30度）缓慢插入PDMS预聚物表面，以防止在插入过程中产生气泡。如有必要，可将嵌入PC膜的整个PDMS预聚物置于连接真空泵的干燥器中抽真空10分钟，以排除 trapped 气泡。若抽真空后PC膜上浮，可用移液器吸头将PC膜压回至固化的PDMS层上。必要时，可重复抽真空和按压过程。
在细胞实验中，微流控细胞培养要求不能有气泡。连接系统时，必须确保整个微流控装置（包括注射泵、管路和微流控芯片）中不引入任何气泡。如果由于培养箱内实验温度升高导致气体溶解度下降，从而在微流控系统中产生气泡，可提前将所有实验组件（包括注射器和管路）及试剂（包括培养基、邻苯三酚和氢氧化钠）放入培养箱中预热（使用前至少20分钟），以尽量减少温差。注射泵在运行过程中，其内部电机通常会产生热量。一般情况下，可将注射泵置于培养箱内运行；但需在实验过程中监测培养箱温度。若实验期间温度升高，则需采取额外的降温措施。可采用多种可行的降温方法，例如在培养箱内放置冰盒、减少放入培养箱内的注射泵数量，或使用带有强制冷却系统的培养箱。
本文开发的PDMS-PC微流控细胞培养装置能够稳定地生成垂直的化学和氧气梯度，用于细胞迁移研究。该装置的局限性在于所生成的氧气梯度分布依赖于由化学反应清除作用驱动的氧气通量与通过装置从周围环境扩散至培养基中的氧气扩散之间的平衡。因此，装置内部的氧气梯度分布无法任意调控。与现有的微流控细胞培养平台相比，本文开发的装置是首个能够在化学梯度与氧气梯度联合作用下进行细胞培养研究的系统。整个装置可采用传统的软光刻复制 molding 工艺制备，无需繁琐的对准步骤和昂贵的仪器设备。梯度分布可通过数值模拟与实验表征相结合的方式进行优化，以提供更接近生理微环境的培养条件 体外 细胞研究。通过使用以PC膜作为气体扩散屏障的空间限制化学反应方法，可在无需高压气体钢瓶和复杂气体流量控制装置的情况下生成氧浓度梯度。此外，该装置每天仅需少量化学试剂（少于10 ml）即可维持氧梯度。由于氧张力控制局限于微流控通道周围区域，不会干扰环境中的氧浓度，因此整个装置可置于常规细胞培养孵箱内，无需额外的温度、湿度和CO₂控制。2 控制仪器。因此，所开发的设备在生物实验室中具有重要的实际应用潜力。
由于技术限制，现有文献中很少研究细胞在不同氧张力条件下的行为。借助本文开发的装置，可便捷地在氧浓度梯度条件下进行细胞培养，从而极大地推动了氧梯度环境下细胞研究的发展。此外，类似的运行原理还可应用于产生其他生理相关的气体梯度，如二氧化碳和一氧化氮，用于 体外 细胞培养研究17这些功能表明，PDMS-PC微流控装置在多种细胞培养应用中具有巨大潜力，包括药物测试以及细胞增殖和迁移实验，有望推动相关研究进展 体外 细胞培养研究

可溶性因子和氧张力的空间分布能够调控多种重要的细胞功能 体内1,2,3,4为了更深入地研究它们对细胞的影响，一个 体外 一种能够稳定产生化学和氧气梯度的细胞培养平台备受关注。多种可溶性因子在生物活动中发挥关键作用，并影响细胞行为。近年来，随着微流控技术的进步，已开发出多种能够稳定生成化学梯度的微流控装置，用于研究细胞迁移。5此外，多项研究还揭示了氧张力的必要性 体外 细胞培养6,7,8然而，细胞培养中氧气张力的控制主要依赖于直接添加化学除氧剂或使用配备加压气体钢瓶的细胞培养箱。直接添加化学物质会改变细胞培养基的成分，进而影响细胞的响应。而氧气可控培养箱需要特殊的培养箱设计、精确的气体流量控制以及大量氮气，才能实现低氧条件。此外，该装置无法控制氧气的空间分布，这限制了在不同氧气张力和梯度条件下对细胞行为的研究。为克服这些局限性，已开发出多种微流控装置，用于在细胞培养应用中生成氧气梯度。9然而，大多数系统使用加压气体驱动，可能导致蒸发和气泡产生问题。因此，它们通常需要复杂的仪器设备，且在长期细胞培养研究中可能不够稳定可靠。
为了克服这些挑战，并进一步研究化学梯度与氧梯度在细胞迁移中的相互作用，我们开发了一种由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流控细胞培养装置，其中嵌入了聚碳酸酯（PC）薄膜10。该装置由两层微流控通道层组成，中间以PDMS膜隔开。上层为PDMS-PC层，用于生成氧梯度；下层由PDMS构成，用于生成化学梯度并进行细胞培养。该装置能够在无需使用气体钢瓶和复杂流体控制系统的情况下，同时生成相互垂直的化学梯度和氧梯度。在该装置中，PDMS提供了优异的光学透明性、气体通透性以及细胞培养与成像所需的生物相容性。嵌入的PC薄膜则作为气体扩散屏障，实现高效的氧张力控制。在微流控通道中，我们采用一系列蛇形通道结构来生成化学梯度。由于其可靠性高且实验设置简便，该设计已被广泛应用于各类微流控装置中的化学梯度生成。此外，可通过预先利用数值模拟改变通道几何结构，从而设计所需的化学梯度分布。在氧梯度生成方面，我们采用了本实验室先前开发的空间限域化学反应方法10,11,12，可在无需氮气吹扫的情况下，从指定区域清除氧气。为便于生物实验室的实际应用，整个实验装置可兼容常规细胞培养孵箱。通过整合上述方法，我们能够在无需大型气体钢瓶和复杂仪器的条件下，同时生成稳定的化学梯度和氧梯度，用于研究细胞迁移行为。

<table><tbody><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-八氟辛基三氯硅烷</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302118</td><td></td></tr><tr><td>4'' 硅假片</td><td>Wollemi Technical, Taoyuan, 中国台湾</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, 中国台湾</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG 双曝光掩模对准器</td><td>M&amp;R Nano Technology, Taoyuan, 中国台湾</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>钝头针头</td><td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td><td>14 号规格</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Z359629</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>缓冲氧化物刻蚀液</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, 中国台湾</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>用于装置内化学梯度的数值模拟</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（IPA）</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, 中国台湾</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi 智能荧光细胞成像仪</td><td>NanoEnTek, Seoul, Korea</td><td>DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td>机械对流烘箱</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>等离子体处理系统</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>用于氧气等离子体表面处理</td></tr><tr><td>聚碳酸酯（PC）膜</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan 中国台湾</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>焦性没食子酸</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>可移除粘性胶泥</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Mach 1.6R 台式离心机</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>ELS Technology, Hsinchu, 中国台湾</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Feather, Osaka, Japan</td><td>5005093</td><td>用于 PDMS 切割</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx, Houston, TX</td><td>Fusion 400</td><td></td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PTFE 管</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

用于在垂直化学和氧气梯度下研究细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

本文报道了一种由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流控装置，其内嵌有聚碳酸酯（PC）薄膜，用于研究细胞在化学梯度与氧气梯度联合作用下的迁移行为。化学梯度和氧气梯度均可显著影响细胞迁移。 体内然而，由于技术限制，针对其效应的研究还很少 体外本研究开发的装置利用一系列蛇形通道生成所需的化学梯度，并采用空间受限的化学反应方法产生氧气梯度。化学梯度与氧气梯度方向相互垂直，以便于直观解读细胞迁移结果。为高效生成氧气梯度并最大限度减少化学试剂消耗，装置中嵌入了聚碳酸酯（PC）超薄薄膜作为气体扩散屏障。所开发的微流控装置可通过注射泵驱动，并可在细胞迁移实验期间置于常规细胞培养箱中，从而简化实验设置并优化细胞培养条件。在细胞实验中，我们利用该装置研究了腺癌人肺泡基底上皮细胞 A549 在趋化因子（基质细胞衍生因子 SDF-1α）与氧气梯度联合作用下的迁移行为。实验结果表明，该装置能够稳定生成相互垂直的趋化因子和氧气梯度，且具有良好的细胞相容性。迁移实验结果显示，氧气梯度可能在引导细胞迁移过程中发挥关键作用，而细胞在复合梯度条件下的行为无法通过单一梯度条件下的结果进行预测。该装置为研究人员提供了一种强大且实用的工具，可用于研究细胞培养环境中化学梯度与氧气梯度之间的相互作用，从而推动更接近生理条件的细胞迁移研究 体内类微环境。

制备的PDMS-PC杂化微流控细胞培养装置。图1展示了该微流控装置的照片与示意图。底层包含四级蛇形通道，可通过两个独立入口引入试剂，并以六种不同的混合比例生成溶液。理论上，从两个入口引入的两种溶液之间的六种不同混合比例分别为1:0、4:1、3:2、2:3、1:4和0:1（左:右）。这些不同混合比例的溶液可在下游的细胞培养腔室中建立化学浓度梯度。顶部与底部层之间由一层PDMS膜隔开。在上层中，用于氧清除化学反应的试剂通过两个独立入口进入微流控通道。这些试剂在流入细胞培养腔室上方之前迅速混合并发生反应，从而清除来自底部通道的氧气，且不与细胞培养环境发生直接化学接触。嵌入的PC薄膜相较于PDMS具有更小的气体扩散系数，可作为扩散屏障，提高氧清除效率。氧气随后通过下游区域的PDMS逐渐重新扩散回细胞培养腔室，沿流动方向形成氧浓度梯度。由于氧清除化学反应在空间上受限，仅局部氧分压受到影响。因此，该装置可在常规细胞培养箱中使用，而无需改变培养箱整体的氧分压。在细胞迁移实验中，将细胞接种于细胞培养腔室内进行观察。培养基和化学试剂通过注射泵以精确控制的流速引入装置中。
表征设备内部产生的化学物质和氧气梯度。 由于微流控具有层流特性，其流动行为可通过计算流体动力学（CFD）模拟进行预测。本文中，我们构建了一个三维模型，并使用商用多物理场建模软件进行了模拟。图2(a)展示了基于荧光强度测量获得的细胞培养室宽度方向上荧光素浓度分布的实验表征结果与数值模拟结果的对比。实验结果与模拟结果的一致性表明，该CFD模型能够较好地估算设备内部产生的化学梯度。图2(b)绘制了细胞培养室中模拟生成的SDF-1α梯度。图3显示了在细胞实验前将氧敏感型荧光染料引入细胞培养室后测得的氧气梯度表征结果。结果表明，利用上述方案可建立一个约1%至16%的氧气梯度。
细胞迁移实验结果。 作为示例，我们对A549细胞在四种不同趋化因子（SDF-1α）和氧气梯度组合条件下的迁移行为进行了研究：（1）无趋化因子梯度且无氧气梯度作为对照组，（2）有趋化因子梯度但无氧气梯度，（3）有氧气梯度但无趋化因子梯度，以及（4）同时存在趋化因子和氧气梯度。 图4 展示了整个实验装置的照片。所有实验均在常规细胞培养孵育箱中进行，整个装置（包括微流控设备、注射泵和活细胞成像显微镜）均置于其中。细胞迁移实验结果如 图5 所示。图5(a) 显示了使用活细胞成像分析仪在实验过程中采集的图像，图5(b) 和 (c) 则利用ImageJ软件及其插件对四种条件下的细胞迁移轨迹和平均移动方向进行了绘图分析。结果显示，对照组中细胞的平均迁移距离接近于零，表明细胞在实验中呈随机运动。相比之下，在仅有趋化因子梯度的条件下，细胞的平均移动方向朝向左侧，即SDF-1α浓度较高的方向。该结果表明A549细胞具有SDF-1α趋化性行为，这在此前已有报道。在仅有氧气梯度的实验中，细胞的平均移动方向向上，即朝向氧张力较低的区域。更有趣的是，在趋化因子梯度与氧气梯度相互垂直的实验条件下，细胞的平均移动方向向上，而在水平方向（趋化因子梯度方向）上未见明显移动。
<img alt="用于细胞培养的微流控芯片示意图，含化学梯度和氧气梯度；PDMS-PC层组装结构。" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图1：制备完成的PDMS-PC微流控细胞培养装置。（a）所制备装置的实验照片，该装置可稳定生成垂直的化学梯度和氧气梯度，用于细胞迁移研究。化学梯度通道中填充了蓝色和黄色食用染料，以显示细胞培养腔内梯度的形成情况。氧气梯度通道中填充了红色食用染料。比例尺为1 cm。（b）微流控装置的示意图。顶层由PDMS制成，内嵌PC层作为气体扩散屏障，以实现对细胞培养腔内氧气梯度的有效调控。（c）用于制备顶层和底层的母模结构。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光素扩散图；COMSOL 与实验对比，微流控腔室装置，浓度梯度。" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 微流控细胞培养装置内化学梯度分布。 （a）细胞培养腔室内沿宽度方向（Y 方向）的荧光素浓度梯度，通过数值模拟与实验表征获得。模拟结果与实验测量梯度之间的相似性表明，该模拟可准确预测化学梯度。插图显示了为模拟构建的三维（3D）模型。（b）用于细胞迁移研究的细胞培养腔室内 SDF-1α 趋化因子梯度的数值模拟结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氧分压与位置关系图；细胞培养室流动示意图；实验表征。" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3： 微流控细胞培养装置内的氧浓度梯度。 沿细胞培养室流动方向实测得到的氧浓度梯度。通过氧敏感型荧光染料结合图像分析对梯度进行估算。对培养室从左至右的氧梯度进行表征，结果显示在整个培养室宽度方向上梯度分布具有一致性。
<img alt="带有注射泵、微流控装置和活细胞成像显微镜的细胞培养孵育装置。" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4： 实验装置照片。 整个装置，包括微流控装置、注射泵和活细胞成像显微镜，均置于常规细胞培养孵育箱内，以在实验期间提供优化的细胞培养条件。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="梯度条件下的细胞迁移；显示微柱装置和运动分析的示意图及图表。" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5： 在垂直的 SDF-1α 与氧气梯度条件下细胞迁移研究结果。 （a）细胞迁移实验开始前和 12 小时后的图像。可通过活细胞成像显微镜拍摄的时间序列图像分析细胞迁移路径。（b）在四种不同梯度组合条件下（无梯度、仅趋化因子梯度、仅氧气梯度、以及同时存在趋化因子和氧气梯度）捕获图像所分析得到的细胞迁移路径及平均迁移距离。图像每 15 分钟采集一次。比例尺为 250 µm。（c）在四种不同梯度组合下，细胞在垂直方向（氧气梯度方向）和水平方向（趋化因子梯度方向）的平均迁移距离图。数据表示为三次独立实验的均值 ± 标准差，每次实验分析 10 个细胞。具有统计学显著差异的结果（非配对 Student t 检验，p &lt; 0.01）用不同字母（a 和 b）标注。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

化学梯度和氧气梯度的控制对于细胞培养至关重要。本文报道了一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯（PDMS-PC）微流控装置，能够稳定地生成用于细胞迁移研究的化学梯度与氧气梯度组合，且可在无需复杂仪器的生物实验室中实际应用。

本文报道了一种由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流控装置，该装置嵌入了聚碳酸酯（PC）薄膜，用于研究细胞在……条件下的迁移行为

本实验的总体目标是建立一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置，用于研究在不同组合的垂直化学梯度和氧气梯度下哺乳动物细胞的迁移行为。该方法有助于解答哺乳动物细胞迁移研究中的关键问题，包括这些梯度对不同类型细胞或具有其他基因的细胞迁移的影响。该技术的主要优势在于，整个实验装置可在常规培养箱中完成，从而为细胞培养提供最佳条件，且无需繁琐的设置和庞大的仪器设备。该技术的应用可进一步拓展至癌症细胞转移能力的诊断，因为利用微流控装置可表征细胞运动性以及多种与生理相关的梯度。该方法可为哺乳动物细胞迁移提供深入见解，还可应用于其他细胞研究，例如针对药物浓度与氧张力组合的体外细胞药物筛选测试。将两克聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物转移至具有顶层流体通道图案的模具上，形成一层薄薄的PDMS。然后，将模具置于真空干燥装置中，对PDMS脱气60分钟。脱气完成后，将模具放入60摄氏度的烘箱中过夜，使PDMS固化。确保模具处于水平平面。将模具冷却至室温后，再向模具中倒入13克PDMS预聚物，随后在真空干燥装置中脱气60分钟。缓慢将一片厚度为1毫米的聚碳酸酯（PC）薄膜嵌入新鲜的PDMS层中，作为气体扩散屏障。排出所有存在的气泡。然后，将模具放入60摄氏度的烘箱中过夜。确保模具处于水平面。将固化后的PDMS冷却至室温后，用手术刀将其切割成约5.5厘米×5厘米的面积，以完全覆盖所有通道图案。然后，将PDMS芯片从模具上剥离。接着，使用直径为2毫米的活检打孔器在进样口和出样口位置打孔。将制备好的上层PDMS-PC层存放于无环境灰尘处，以备后续组装。组装装置时，先将制备好的PDMS-PC上层和带有旋涂PDMS膜的晶圆放入氧气等离子体表面处理仪中，使待键合表面朝上。用90瓦的氧气等离子体处理PDMS表面40秒。在对PDMS膜进行氧气等离子体表面处理后，立即将顶层键合到PDMS膜上。在键合后的各层上方放置一个重物，并将其置于60摄氏度的烘箱中过夜，以促进键合。待键合后的各层冷却至室温后，用手术刀将与顶层键合的膜切割成约5.5厘米×5厘米的面积。从硅片上剥离键合结构，并使用直径为2毫米的活检打孔器在化学梯度通道的入口和出口处打孔。然后，将带有膜的上层和制备好的PDMS底层放入氧气等离子体表面处理仪中，使键合面朝上。为活化PDMS表面，请以90瓦功率进行40秒的等离子体处理。在表面处理后立即贴合顶层和底层以进行键合。将重物置于整个键合装置的上方，并在60摄氏度的烘箱中放置过夜。第二天，将制备好的整个装置从烘箱中取出，并冷却至室温。按照文字方案中的描述，在装置中进行细胞的准备，以开始微流控细胞迁移实验。在第二天，吸除自第零天起培养的细胞的培养基，并用五毫升 DPBS 洗涤细胞两次。吸除 DPBS 后，加入两毫升胰蛋白酶-EDTA，然后将细胞在培养箱中孵育五分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。待细胞从培养瓶中脱离并悬浮于溶液中后，向培养瓶中加入 8 mL 无血清培养基。将所有液体转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 140 ×g 离心 5 分钟。离心结束后，吸除上清液，并加入适量无血清培养基，调整细胞终浓度为每毫升含 100 万个细胞。然后，取出如文本方案中所述在第一天制备的微流控装置。使用带有钝头14号针头的1毫升注射器，通过化学梯度通道的出口注入无血清培养基，直至培养基从入口两端的针头均流出。接着，从化学梯度通道的出口注入200微升细胞悬液。在显微镜下观察装置中的细胞培养腔，以确认细胞已引入微流控通道。随后，将装置放入湿润的容器中，并置于细胞培养孵育箱内孵育5小时，以促进细胞在装置表面的贴附。同时，用无血清培养基配制所需浓度的化学物质。用两个独立的3毫升注射器分别吸取含化学物质和不含化学物质的无血清培养基，并连接至高纯度导管。随后，将注射器安装在注射泵上，设置流速为1 µL/min，以备后续使用。接下来，配制15 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液和15 mL的200 mg/mL邻苯三酚溶液。将氢氧化钠溶液吸入一个连接高纯度PFTE管路的15毫升注射器中，将焦性没食子酸溶液吸入另一个连接高纯度管路的15毫升注射器中。将注射器安装在注射泵上，设定流速为5 µL/min，备用。五小时孵育结束后，取出整个装置，置于直径15 cm的培养皿中。使用黏性橡皮泥将装置固定在培养皿中，然后将培养皿转移至培养箱内的活细胞成像显微镜上。将注射器的管路连接至化学梯度通道的入口，以生成化学梯度。随后，将出口连接至通向废液储液池的管路。打开用于生成化学梯度的注射泵。接着，将装有氯化钠和连苯三酚的注射器通过高纯度管路连接至氧气梯度通道的入口。将管路连接至出口以收集废液，然后启动用于生成氧气梯度的注射泵。向培养皿中加入约 15 毫升双蒸水，以保持装置湿润。然后，设置活细胞成像显微镜进行时间序列图像采集，每 15 分钟拍摄一次图像。按照文本方案中所述进行数据采集与分析，以及梯度的表征。图中展示了在微流控装置中生成用于细胞迁移的化学梯度的代表性结果。数值模拟结果与使用荧光素溶液作为化学物质的实验表征结果高度一致。其他化学物质（如趋化因子SDF-1α）的梯度也可通过模拟预先估算。可通过氧敏感型荧光染料在实验中表征该装置内产生的氧浓度梯度。通常，装置内可稳定建立从上游1%到下游16%的氧浓度梯度。图中显示的是使用活细胞成像显微镜在实验过程中采集的典型时间推移图像。图像分析后，可计算 A549 细胞的迁移轨迹及其平均移动距离。在无梯度条件下，细胞呈现随机迁移，平均移动距离接近零。仅存在 SDF-1 alpha 趋化因子梯度时，细胞表现出趋化行为，并如预期般向趋化因子高浓度方向迁移。仅存在氧气梯度时，细胞会向低氧方向移动，表现出趋氧性行为，而这种行为在哺乳动物细胞中尚未得到充分研究。有趣的是，在同时存在趋化因子和氧气梯度的情况下，细胞仍趋向低氧梯度方向移动，表明氧气梯度具有主导作用。这一现象有待进一步研究。 在进行该实验操作时，重要的是在器件制备过程中注意调平设备，并在细胞迁移实验中微流控装置组装时彻底排除气泡。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备PDMS-PC微流控装置，并设置实验以研究哺乳动物细胞在化学梯度与氧气梯度联合作用下的迁移行为。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

细胞迁移研究在垂直化学和氧梯度聚二甲基硅氧烷的聚碳酸酯微流体装置

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