Name: 从个体到群体度评价环境化学物质对蜜蜂发展的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解评估农药残留对蜜蜂个体及蜂群发育影响的方法。该实验通过体内喂养基础幼虫饲料，观察杀虫剂对蜜蜂的剂量依赖性毒性效应，为生态毒理学研究提供重要数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由行政院农业委员会动植物防疫检疫局资助，项目编号为105AS-13.2.3-BQ-B1；并由科技部（MOST）资助，项目编号为103-2313-B-197-002-MY3。

1. 准备工作
<ol>
	<li>配制 1 L 的 50% 糖浆。将 1 kg 蔗糖溶解于 1 L 去离子水（ddH2O）中。</li>
	<li>在基础幼虫饲料（BLD）中配制吡丙醚（PPN）溶液。配制 1.1 L 浓度为 10,000 ppm 的 PPN 原液，并取 100 mL PPN 溶液加入 1 L 灭菌去离子水（ddH2O）中稀释。4 °C 保存。</li>
	<li>将 PPN 原液用 BLD 稀释至终浓度分别为 0.1、1、10 和 100 mg/kg（ppm），用于后续实验。</li>
	<li>配制含 PPN 的糖浆（用于蜂群水平实验）。将 PPN 原液加入 50% 糖浆中，稀释至终浓度为 10 和 100 ppm，用于后续实验。</li>
	<li>蜜蜂饲养。 
	注：本实验地点为中国台湾宜兰市的国立宜兰大学（NIU）养蜂场；（GPS 坐标：N24.747278，E121.746200）。
	<ol>
		<li>每周检查蜜蜂（Apis mellifera L.）蜂群的食物存量，必要时补充 1 升 50% 糖浆（当蜂蜜储存区为空时）。将健康蜂群定义为每个蜂群具有 9 个巢脾的蜜蜂巢房，且蜂王正常产卵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 100 mL 基础幼虫饲料（BLD）。将 6% D-葡萄糖、6% 果糖和 1% 酵母提取物溶解于灭菌去离子水（ddH2O）中，并添加 50% 蜂王浆。4 °C 保存，但不超过 3 天。 
	注：实验前预热至 35 °C，并在 3 天内使用完毕。</li>
</ol>
2. 体内 喂养方法
注意： 体内 取食方法已根据汉利氏方法进行了修改 等20
<ol>
	<li>蜜蜂幼虫的选择与标记
	<ol>
		<li>插入蜂王隔离板，将一个健康蜂群的9个巢脾分为4个巢脾和5个巢脾两部分，限制蜂王在4个巢脾的区域内活动。在4个巢脾的区域内至少保留一个空巢脾，供蜂王产卵。</li>
		<li>蜂王产卵1天后，检查巢框上卵的出现情况，并将卵保留在蜂箱内72小时（第4th 天）直至1日龄幼虫孵化。从试验蜂箱中手动取出一个含有1日龄工蜂幼虫（24小时内孵化）的巢框，并用蜂刷将工蜂从巢框上清除。</li>
		<li>用透明载玻片（尺寸 = 长 × 宽 × 厚 = 29.7 mm × 21 mm × 0.1 mm）覆盖框架，并用图钉将透明载玻片固定在框架边缘图1A).</li>
		<li>每种处理随机选取50只一日龄幼虫（4龄）th 天）并在透明载玻片上用永久性记号笔标记每个子代细胞图1A 和 1B). 
		注意：使用永久性记号笔在框架和透明载玻片上标注每种处理的信息，以避免不同处理之间的混淆。取出已标记的载玻片并妥善保存以备后续使用 体内 喂养与观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 喂养。
	<ol>
		<li>在第1、2、3天，根据幼虫日龄的摄食量，分别用移液器向每个标记的育雏细胞中加入不同浓度的PPN-BLD（0.1、1、10和100 ppm），加样体积分别为10 μL、10 μL和20 μL。对照组加入等量的BLD（不含PPN）。由此，每个标记育雏细胞中PPN-BLD的总剂量累积为4、40、400和4,000 pg。 
		注意：通过标记的透明滑片识别已标记的育雏巢房，并在饲喂后移除这些透明滑片。使用新鲜的BLD进行饲喂，以防止工蜂清理育雏巢房。</li>
		<li>将经PPN处理的载玻片放回原始菌落，以进行进一步观察。 
		注意：每种处理在四个菌落中设置四个生物学重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第7天观察经处理的幼虫。
	<ol>
		<li>为观察经PPN处理的幼虫，将标记好的透明载玻片放回框架中，记录标记的蛹室内的死亡率和封盖率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第13天观察处理后的蛹及羽化率
	<ol>
		<li>去除封盖子房中的蜂蜡。</li>
		<li>将软头镊子插入蜂房中，轻轻夹住蛹，然后缓缓取出。</li>
		<li>将蛹转移至24孔细胞培养板中，每孔底部垫有双层实验室用纸巾。记录蛹在转移过程中的损伤和死亡情况。</li>
		<li>将24孔组织培养板置于34 °C、70%相对湿度的培养箱中孵育，直至出芽约 8天。</li>
		<li>观察并记录蛹及羽化的蜜蜂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计学
	<ol>
		<li>计算记录的数据，并以均值 ± 标准差表示。</li>
		<li>使用SAS软件进行方差分析（ANOVA），并采用最小显著差异（LSD）检验方法分析不同处理间均值的差异。将统计学显著性定义为 P-值 &#60;0.05。表格中同一列内不同的字母表示经统计分析存在显著性差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蜂群水平上PPN的毒性
<ol>
	<li>建立蜜蜂群体。
	<ol>
		<li>插入一个蜂王隔离栅，垂直分隔健康蜂群中的9个巢脾，分为4个巢脾（A部分）和5个巢脾（B部分），同时限制蜂王仅在4个巢脾的区域内活动。在4个巢脾区域中至少保留一个空巢脾，供蜂王产卵。 
		注意：在蜂王所在区域上方再放置另一个蜂王隔离栅，防止蜂王在两部分之间移动。</li>
		<li>蜂王产卵1天后，检查巢脾上是否有卵出现。用手从A部分取出含有卵的合适巢脾，并用蜂刷清除巢脾上的工蜂。</li>
		<li>用透明载玻片覆盖巢脾，并用图钉将透明载玻片固定在巢脾边缘。</li>
		<li>随机选择100个含有卵的幼虫巢房，使用永久性记号笔在透明载玻片上标记每个巢房。将这100个巢房指定为第1组。使用永久性记号笔在巢脾和透明载玻片上写明各处理组的信息，以避免不同处理组之间的混淆。</li>
		<li>将标记好的巢脾放回A部分饲养3天，然后将蜂王转移到B部分进行产卵。</li>
		<li>1天后，检查B部分的巢脾，选择一个合适的巢脾，并按照步骤3.1.4的方法标记100个含有卵的幼虫巢房。将这100个巢房指定为第2组。</li>
		<li>将标记好的巢脾放回B部分饲养3天，然后将蜂王转移回A部分进行产卵。</li>
		<li>在A部分和B部分之间再重复进行6次蜂王交换，并依次按数字编号分组（图2）。总共应有9个组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第13天用含PPN的糖浆处理蜜蜂蜂群（图2）。
	<ol>
		<li>在塑料蜂饲喂盒（宽 × 长 × 高 = 20 cm × 30 cm × 3.5 cm）中加入1 L含10或100 ppm PPN的50%糖浆，并将饲喂盒放置在实验蜂群巢脾上方。 
		注意：第1组在第13天不接受PPN处理，因为其幼虫巢房已经封盖。</li>
		<li>对照组使用1 L不含PPN的50%糖浆进行饲喂，方法同步骤2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第5天统计1日龄幼虫数量，并记录每组100个标记巢房的卵孵化率（图2）。蜜蜂卵通常需要3天孵化为0日龄幼虫；因此，在第1天检查并标记100个含卵的巢房，并在第5天统计每组1日龄幼虫的数量，以计算孵化率百分比。</li>
	<li>在第11天统计封盖的幼虫巢房数量，并记录每组100个标记巢房的幼虫封盖率（图2）。6至7日龄的幼虫巢房会被工蜂用蜂蜡封盖，以供幼虫化蛹。</li>
	<li>观察蛹的发育情况，并在第17天记录每组100个标记巢房的羽化率（图2）。
	<ol>
		<li>去除封盖幼虫巢房的蜂蜡，用尖端柔软的镊子轻轻取出蛹。将蛹转移至24孔细胞培养板中，每个孔下方垫有双层实验室纸巾。</li>
		<li>将24孔细胞培养板置于34 °C、70%相对湿度的培养箱中，直至成蜂羽化。</li>
		<li>持续观察并记录每组蛹的发育及成蜂羽化情况，直至第9组（共49个实验日）。 
		注意：每种处理设置四个生物学重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>计算记录的数据，并以均值 ± 标准差（SD）表示。</li>
		<li>采用Student双尾t检验分析每组中不同处理对之间的显著差异（例如 0 ppm/10 ppm、10 ppm/100 ppm 和 0 ppm/100 ppm）。若P值 &#60; 0.05，则定义为具有统计学显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ruffi nengo, S. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287268867_Integrated_pest_management_to_control_Varroa_destructor_and_its_implications_to_Apis_mellifera_colonies">Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies.</a> Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).</li>
<li>Mullin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+miticides+and+agrochemicals+in+North+American+apiaries%2C+implications+for+honey+bee+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health.</a> PLoS One. 5, e9754(2010).</li>
<li>Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282222257_Distributions_of_neonicotinoid_insecticides_in_the_Commonwealth_of_Massachusetts_A_temporal_and_spatial_variation_analysis_for_pollen_and_honey_samples">Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples.</a> Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).</li>
<li>Tsai, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ep/article/view/25732">Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan.</a> Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).</li>
<li>Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , 
 <a target="_blank" href="https://pride.stpi.narl.org.tw/">https://pride.stpi.narl.org.tw/</a> (2016).</li>
<li>Kevan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167880999000444">Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity.</a> Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).</li>
<li>Kevan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0006320775900452">Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada.</a> Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).</li>
<li>Crane, E., Walker, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+E+%22The+impact+of+pest+management+on+bees+and+pollination%22">The impact of pest management on bees and pollination</a>. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).</li>
<li>Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19920232241">Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products.</a> Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).</li>
<li>Chauzat, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+pesticide+residues+in+pollen+loads+collected+by+honey+bees+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France.</a> J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).</li>
<li>Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13592-011-0011-2">Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax.</a> Apidologie. 42 (3), 378(2011).</li>
<li>Sanchez-Bayo, F., Goka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+residues+and+bees-a+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pesticide residues and bees-a risk assessment.</a> PLoS One. 9 (4), e94482(2014).</li>
<li>Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. <a target="_blank" href="http://www.apidologie.org/articles/apido/abs/2010/03/m09141/m09141.html">Pesticides and honey bee toxicity-USA.</a> Apidologie. 41, 312-331 (2010).</li>
<li>Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+olfactory+associative+behavior+of+honeybee+workers+due+to+contamination+of+imidacloprid+in+the+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage.</a> PLoS One. 7, e49472(2012).</li>
<li>Urlacher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+chlorpyrifos+levels+in+forager+bees+and+comparison+with+levels+that+disrupt+honey+bee+odor-mediated+learning+under+laboratory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions.</a> J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1226861516300012">The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field.</a> J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).</li>
<li>Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDennehy%2C+TJ+%22Whitefly+Resistance+to+Insecticides+in+Arizona%3A+2002+and+2003+Results%22">Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results</a>. , San Antonio, TX, USA. 
 <a target="_blank" href="http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf">http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf</a> 1926-1938 (2004).</li>
<li>Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , 
 <a target="_blank" href="http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf ">http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf </a> (2010).</li>
<li>Fourrier, J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0132985">Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees.</a> PLoS One. 10, e0132985(2015).</li>
<li>Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.2003.11101097">Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella.</a> J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).</li>
<li>Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+honey+bees%2C+apis+mellifera%2C+in+vitro+1%2C+effects+of+sugar+concentrations+on+survival+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development.</a> J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).</li>
<li>Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1987.11100743">Technique for rearing worker honey bees in the laboratory.</a> J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).</li>
<li>Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002220119290085I">Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro.</a> J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).</li>
<li>Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Apis+mellifera+pupal+melanization+program+is+affected+by+treatment+with+a+juvenile+hormone+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue.</a> J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).</li>
<li>Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+juvenile+hormone+analog+pyriproxyfen+affects+ecdysteroid-dependent+cuticle+melanization+and+shifts+the+pupal+ecdysteroid+peak+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct.+Dev%22%5BJournal%5D)">The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera).</a> Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).</li>
<li>Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-dependent+protein+patterns+in+integument+and+cuticular+pigmentation+in+Apis+mellifera+during+pharate+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development.</a> J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).</li>
<li>Brouwers, E. V. M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1984.11100616">Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation.</a> J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).</li>
<li>Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1985.11100649">Composition of freshly harvested and commercial royal jelly.</a> J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

蜂王限制产卵法和蜂王交换法是本方案中建立用于田间试验的蜜蜂群体的关键步骤。蜂王限制产卵法可实现蜜蜂生命周期的同步化，从而使研究人员能够选取同日龄的1日龄幼虫，用于不同剂量农药的处理。在蜂王交换法中，将蜂王在A部分（4个巢框）和B部分（5个巢框）之间进行交换，以获得不同发育阶段的蜜蜂个体，用于田间试验，评估农药及其残留物的影响。此外，在田间试验中使用透明载玻片标记并记录大量选定的蛹室。然而，蜂王过度产卵时有发生，可能导致可供产卵的空蛹室不足。因此，采用蜂王交换法时需提前准备空巢框。 alternatively，也可采用蜂王限制产卵法在蜂箱中制备不同组别的蜜蜂用于试验。将巢框分为A部分2个框和B部分7个框，并将蜂王置于A部分（2个框）内，可限制蜂王仅在这2个框内产卵。
对于 体内 饲喂方法，将PPN-BLD加入每个育虫室中。蜜蜂对BLD的接受度高于糖浆。16,20蜜蜂幼虫可以在由蜂王浆、糖类、酵母提取物和蒸馏水组成的人工饲料上存活并生长<sup cla...

环境中农药的存在是影响蜜蜂生存的最严重问题之一1,2,3。多项研究已证实，蜜蜂蜂群及蜂产品中普遍存在农药残留。在中国台湾，每年每公顷平均施用农药量为11-12 kg（2005年至2013年数据）。中国台湾的农药使用量高于欧盟国家和拉丁美洲国家4,5。换言之，养蜂环境正面临严重的农药胁迫，尤其在中国台湾，其他一些国家也可能存在类似情况。
蜜蜂Apis mellifera 是农业系统中主要的传粉昆虫之一6，同时还能生产蜂蜜等有价值的产品。然而，蜜蜂会接触到多种农药，这些农药可能在蜜蜂采集喷洒过农药的花朵中的花蜜和花粉时被带回蜂巢7,8。此外，养蜂人为了控制蜂巢内部的病虫害问题，也可能直接使用农药，从而使蜜蜂暴露于农药之中9,10,11。由于蜜蜂幼虫的发育依赖于工蜂饲喂，因此幼虫、雄蜂甚至蜂王都可能接触到被农药污染的花蜜和花粉12。因此，有必要评估各种农药对蜜蜂的毒性作用13。
人们已做出诸多努力来评估环境中的农药残留问题。Yang et al. 研究了神经毒性杀虫剂吡虫啉对蜂巢中蜜蜂幼虫发育的影响，报道指出亚致死剂量的吡虫啉会导致成年蜜蜂出现嗅觉关联行为异常14。此外，Urlacher et al. 在实验室条件下考察了有机磷杀虫剂毒死蜱对工蜂学习能力的亚致死效应15。在我们之前的研究中，评估了昆虫生长调节剂（IGR）吡丙醚（PPN）对蜜蜂幼虫的影响16。
本文介绍了评估化学物质对蜜蜂发育影响的方法。描述并应用了蜜蜂饲喂方法，可用于个体蜜蜂或整个蜂群。首先，我们在蜂群中测试了不同浓度的农药污染基础幼虫饲料（BLD）对幼虫的影响，以评估农药对个体蜜蜂的体内（in vivo）作用。随后，我们通过在蜂箱中使用含有农药污染的糖浆来模拟农药在自然环境中的实际暴露条件。在本方法中，PPN作为一种广泛用于防治害虫昆虫的农药17，已被证实对蜜蜂幼虫和蛹的发育具有危害性16,18,19，将作为指示剂代表农药在田间产生的负面效应。

<table><tbody><tr><td>蜜蜂箱</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>W1266</td><td>蜜蜂饲养</td></tr><tr><td>蜂王隔离板（置于巢框之间）</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1575</td><td>限制蜂王活动范围&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蜂王隔离板（置于顶部）</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1566</td><td>顶部蜂王限制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蜂刷</td><td>SAN-YI Honey Factory, 中国台湾</td><td>W1414</td><td>轻柔清理巢框上的蜜蜂</td></tr><tr><td>饲喂器</td><td>SAN-YI Honey Factory, 中国台湾</td><td>P0219</td><td>向蜂群饲喂糖浆</td></tr><tr><td>透明胶片</td><td>Wan-Shih-Chei, 中国台湾 (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)</td><td>1139</td><td>在巢框上标记幼虫区域（材料：聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET）（尺寸 = 长 × 宽 × 厚 = 29.7 mm × 21 mm × 0.1 mm）</td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>TCP011024</td><td>饲养从蜂巢中取出的蛹</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Tomin medical equipmenco., LTD.</td><td>TM-321</td><td>制备灭菌去离子蒸馏水 (ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>将PPN加入蜜蜂幼虫食物池中</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-550RD</td><td>饲养从蜂巢中取出的蛹</td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD</td><td>KCS34155</td><td>饲养从蜂巢中取出的蛹</td></tr><tr><td>蜂王浆</td><td>国立宜兰大学 (NIU)</td><td>NIU</td><td>制备基础幼虫饲料（BLD）</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>制备基础幼虫饲料（BLD）</td></tr><tr><td>D-(-)-果糖</td><td>Sigma</td><td>F0127</td><td>制备基础幼虫饲料（BLD）</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>CONDA, pronadisa</td><td>1702</td><td>制备基础幼虫饲料（BLD）</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>台湾糖业公司</td><td>E01071010</td><td>制备蜜蜂饲料用糖浆</td></tr><tr><td>烯虫醚（11%）</td><td>利农化学股份有限公司</td><td>登记证号 1937</td><td>实验中使用的昆虫生长调节剂（IGR）</td></tr></tbody></table>

评估环境化学品对蜜蜂从个体到群体水平发育的影响

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

养蜂环境中农药的存在是影响蜜蜂生存最严重的问题之一。蜜蜂在喷洒过农药的花朵上觅食后，可能将农药带回蜂巢。受农药污染的食物会在工蜂之间传递，进而被用来饲喂幼虫，因此可能影响蜜蜂的发育。因此，环境中的残留农药可能成为对蜜蜂种群造成长期损害的因素，并逐渐导致蜂群崩溃。本方案中描述并应用了蜜蜂饲喂方法，可用于单只蜜蜂或整个蜂群。此处使用了一种广泛用于控制害虫、但对蜜蜂幼虫和蛹的发育有害的昆虫生长调节剂（IGR）——吡丙醚（PPN）作为示例农药。该方法也可应用于其他潜在有害化学物质或蜜蜂病原体的进一步研究。

在蜜蜂田间试验中，将蜂王限制在4框区域内产卵。此步骤可提高单框内的蜂蛹密度，便于后续观察。每个处理组均进行标记，并通过透明观察板清晰记录蜜蜂的发育情况。in vivo 方法将PPN-BLD饲喂给蜂巢内的蜜蜂幼虫，以精确评估PPN对蜂群中蜜蜂发育的影响。采用in vivo 饲喂方法有助于观察化学处理对蜂巢的影响。
对于每一种PPN-BLD剂量，共标记并处理了五十个育雏巢房。加入PPN-BLD后，将处理过的巢脾放回原始蜂群中，在自然条件下进行观察。PPN-BLD对蜜蜂幼虫阶段的负面影响易于观察，呈现出剂量依赖性效应。表1列出了在较高两个剂量（10和100 ppm）下于幼虫阶段死亡的蜜蜂数量。如表1所示，在0.1和1 ppm两个剂量下，封盖率、出房时间及羽化率与0 ppm组（添加BLD食物）或未饲喂对照组相比无显著差异，仅在1 ppm剂量下出现显著更高比例...

在此我们展示 一种向单只蜜蜂及蜂群饲喂含农药食物的方法。该方法通过评估农药对单只蜜蜂的影响来研究其效应。 体内 基础幼虫饲料的饲喂以及蜂巢群体的自然状态

养蜂环境中农药的存在是影响蜜蜂生存的最严重问题之一。农药可能...

本实验的总体目标是评估在蜂群的自然条件下，环境中农药残留对单个蜜蜂个体的影响。该方法的主要优势在于，它能够同时研究农药或其他相关污染物对单个蜜蜂以及整个蜂群的影响。由于蜜蜂蛹较为脆弱，操作难度较大，因此该方法的可视化演示至关重要。本实验操作将由我实验室的博士生 Ko Chong-Yu 演示。实验前，每群蜜蜂饲喂1升50%的糖浆。每周补充一次食物储备，健康的蜂群应具有九框蜂巢和一只正在产卵的蜂王。首先，在蜂群中找到蜂王，并将其所在一侧的至少一个巢脾替换为一个空巢脾。然后插入蜂王隔离栅，将蜂王限制在一个包含至少一个空巢脾的四个巢脾区域内。次日，检查巢脾上是否有新产的卵，并将这些卵与蜂王分离，放置 72 小时。然后移除这些巢框，刷去工蜂，准备处理蜂房中的幼虫。每种处理需用透明载玻片覆盖巢框中随机选取的50只一日龄幼虫。用图钉固定载玻片，并用永久性记号笔在载玻片上标记识别信息。现在使用预热至35摄氏度的BLD，配制体积为100 mL、浓度范围为0.1至100 ppm的PPN处理液。接下来三天，对蜂群育雏区进行处理。处理幼虫时，打开蜂房盖，向每个育雏蜂房中加入10 µL的PPN BLD溶液。第二天使用10微升处理液重复处理一次，并在第三天使用20微升处理液再次重复处理。第三次处理后，将蜂群置于培养环境中继续发育。在实验设计中，每个处理组需使用不同的蜂群重复四次。第七天，检查经PPN处理的幼虫，记录各处理组的死亡率和封盖率。在第13天，记录每个处理组的羽化率。首先，去除封盖幼虫巢房上的蜂蜡。然后使用尖头镊子轻轻夹住蛹，轻柔地将其拉出。移除蛹时，应捏住头部与胸部之间，轻柔地将蛹取出。在正式开展实验前，需反复练习多次，以确保存活率达到至少90%。将蛹转移至铺有两层实验室用纸巾的24孔组织培养板中。务必记录转移过程中发生的任何死亡或损伤情况。将培养皿置于34摄氏度、相对湿度70%的条件下培养，直至羽化。在接下来的八天内，记录羽化率。按照之前的方法建立蜂群，使用一个健康的九框蜂群，将蜂王限制在包含至少一个空框的四框区域内。将该四框区域称为A部分，五框区域称为B部分。确保蜂王隔离板完全分隔蜂群，使蜂王无法在两个区域之间移动。这种分隔对于收集一日龄幼虫群体至关重要。第二天，像之前一样标记一组含有新产卵的100个育雏巢房，作为第一组，将其放回A部分饲养三天。两天后，将蜂王转移至B部分产卵。第二天，将B部分的100个新产的卵标记为第二组，并将该区域放回蜂群的B部分。再过两天后，将蜂王移回A部分。随后重复此过程以建立另一组，并继续每隔三天将蜂王在A部分和B部分之间轮换，直至每隔三天分配一组，共建立九组一日龄卵。在发育的前五天内，记录每组标记的幼虫巢室的孵化率。发育11天后，开始记录每组中封盖的蜂蛹巢房数量。实验第13天，用含有10或100 ppm PPN的50%糖浆对蜂群进行处理。将1升处理液装入饲喂盒，并连接至蜂群。第一组为未经处理的对照组，因为这些细胞现在应已完成加帽。从第17天开始记录各组的羽化率。为此，将幼虫按前述方法转移至24孔板中，然后孵育该板，随后记录羽化率。经过49天后，应已获得所有九组的羽化数据。各个蜂巢室按所述方法用PPN BLD处理。杀虫剂对蜜蜂幼虫阶段的负面影响易于观察，且具有剂量依赖性。这些效应包括体色黑化和翅膀畸形。为了模拟遭受环境中残留的PPN影响的蜜蜂群体，整个蜂群均被饲喂含有PPN的糖浆。第一组为对照组，这些蜜蜂在施用处理前已完成成虫发育。第二组和第三组在幼虫阶段开始受到处理影响，第四至第九组则在卵阶段开始受到处理影响。经PPN处理后，孵化率、封盖率、羽化率及畸形率均发生改变。除孵化率外，100 ppm的PPN处理效果优于10 ppm。此外，经过处理后，许多蛹因体壁变黑或无法羽化而死亡。在100 ppm PPN处理组中，封盖的巢房被破坏，受伤的蛹被蜂群清除。一旦掌握操作技巧，整个蜂群处理过程可在约一个月内完成，每日对蛹的操作可在约两小时内完成。在尝试本实验操作时，重要的是要定期检查蜂群的状况，并在开展实验前熟练掌握蜂蛹的操作技术。切勿忘记，由于对蜜蜂毒液过敏，操作蜜蜂可能存在风险。在进行本操作时，应始终采取防护措施，例如穿戴防护服装。

evaluating-effect-environmental-chemicals-on-honey-bee-development

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

从个体到群体度评价环境化学物质对蜜蜂发展的影响

本文介绍了我们制备单批次蜜蜂群体的详细方案——这是一种用于分析与角色相关的工蜂生理学的有用工具。我们还描述了用保幼激素和蜕皮激素处理工蜂的详细步骤，以评估这些激素在调控工蜂行为和（或）生理过程中的作用。...

单群系蜂群的制备及工蜂激素处理以分析与角色和/或内分泌系统相关的生理特征

熊蜂蜂巢内的微生物群落可富集并保存花粉，以供蜂幼虫食用。本文通过高通量测序技术，结合实验室和野外实验，描述了用于验证以下假设的实验方案：杀菌剂残留会改变花粉微生物组结构和蜂群种群特征，最终导致蜂群衰退。...

实证、宏基因组学与计算技术揭示杀菌剂损害蜜蜂健康的作用机制

亚致死剂量的杀虫剂可能以仅通过定期观察或目测方法难以察觉的方式影响蜂群。本文提供了通过称量蜂箱及蜂箱部件、拍摄巢脾照片以及安装传感器来测量成年蜜蜂总质量、蜂子和食物资源的方法，并讨论了数据分析方法。...

监测亚致死剂量农药暴露对蜜蜂群体水平的影响

开花植物上的杀菌剂喷洒可能会使独居蜂暴露于高浓度的花粉携带杀菌剂残留物中。通过基于实验室的实验涉及...

体外 饲养独居蜂：评估幼虫风险因素的工具

本方案旨在通过建立在受控的实验室条件下使蜜蜂（Apis...

评估杀虫剂对交配后蜜蜂蜂王的风险

本实验方案介绍了一种向独居蜂Osmia...

评估杀虫剂对独居蜂幼虫的影响

本文描述了一种用于纯化下一代测序DNA片段的自动化凝胶大小选择方法。Ranger技术可完全自动化整个琼脂糖凝胶上样、电泳分析及目标DNA片段回收过程，从而实现高通量、高质量的下一代测序文库制备。...

利用自动化凝胶片段筛选提高环境水样制备的下一代测序文库质量

本文介绍了一种用于设计和构建与小型气候可控风洞相连的土壤槽的方案，以研究大气强迫对蒸发作用的影响。该土壤槽和风洞均配备了传感器技术，可对环境条件进行连续的原位（in...

探究大气强迫对蒸发的影响：大气边界层与浅层地下环境的实验整合

采用氧化铜纳米颗粒（CuO-NPs）处理生产性渗滤液（PBW），并在培养的人源细胞中评估其细胞毒性。本实验方案的目的是将天然环境样品整合到细胞培养体系中，以评估经CuO-NP处理后毒性变化情况。...

氧化铜纳米颗粒去除铀中痕量元素 原位 回收渗出液及其对细胞活力的影响

介绍一种坚固且灵活的流通式暴露系统，该系统设计用于使沉积物保持悬浮状态。该系统可用于在实验室中研究悬浮沉积物对多种水生生物及其不同生命阶段的影响。...

一种用于评估悬浮沉积物对水生生物影响的流水暴露系统

了解评估农药残留对蜜蜂个体及蜂群发育影响的方法。该实验通过体内喂养基础幼虫饲料，观察杀虫剂对蜜蜂的剂量依赖性毒性效应，为生态毒理学研究提供重要数据。

评估环境化学品对蜜蜂从个体到群体水平发育的影响

探索更多视频