在活体斑马鱼胚胎中检测运动神经元膜电位

本实验的总体目标是利用斑马鱼胚胎结合基于荧光共振能量转移的基因编码电压指示剂（GEVI），在非侵入性的生理条件下研究可兴奋细胞的电学特性。该方法有助于回答有关可兴奋细胞（如神经元）生物学的关键问题，例如可用于分析兴奋性在神经系统疾病发病机制中的作用。

该方法利用表达基于FRET的遗传编码电压指示剂的透明斑马鱼胚胎。该方法能够以非侵入性的方式在活体中测量细胞的电学特性，因此可深入研究斑马鱼胚胎中脊髓神经元的兴奋性。

该方法也可应用于其他适用于成像研究的体外或体内系统。开始此实验前，需配制PCR反应体系以扩增Mermaid生物传感器的编码序列。在95°C下加热PCR反应体系15秒。

在50摄氏度预变性15秒，并在72摄氏度延伸4分钟，共35个循环。随后使用 commercial gel purification kit 对特异的平末端PCR产物进行凝胶纯化。然后将DNA片段克隆至pCMV-SC平末端载体中，并用SmaI限制性内切酶线性化Mermaid阳性质粒，以插入HuC启动子。

在总体积为20微升的体系中设置限制性酶切反应，并在25摄氏度下孵育反应体系1小时。随后，使用商业化的凝胶纯化试剂盒对酶切后的质粒进行凝胶纯化。然后以PFU DNA聚合酶和斑马鱼基因组DNA为模板，通过PCR扩增HuC启动子。

配制PCR反应体系。首先在95摄氏度下预变性2分钟，随后在95摄氏度下变性15秒，50摄氏度下退火15秒，72摄氏度下延伸4分钟，共进行35个循环。

然后对特异的平末端PCR产物进行凝胶纯化。在总体积为10微升的反应体系中，加入1微升T4 DNA连接酶和1微升特定的10倍缓冲液，将等摩尔量的纯化pCMV-SC Mermaid和pHuC DNA进行连接。随后，将反应体系在4摄氏度下孵育16小时。

取适量感受态细胞，加入5 µL连接反应产物进行转化。通过CEL1与EcoRV双酶切筛选插入方向正确的pHUC阳性克隆。将克隆转移至15 mL离心管中，在37 °C条件下过夜培养。

随后从细胞中提取质粒，并进行CEL1-EcoRV双酶切反应，在37摄氏度下孵育1小时。然后将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳。在此步骤中，将从野生型或sod1G93R成年斑马鱼获得的受精卵转移至一个10毫米的培养皿中。

用冷的鱼水冲洗胚胎，然后立即向卵黄中显微注射 200 皮克的 pHuC-Mermaid 质粒。接着将胚胎转移至培养皿中，在 28 摄氏度的鱼水中孵育，直至达到后续分析所需的发育阶段。

进行自发性尾部卷曲分析时，将胚胎转移至含有0.2% DMSO的鱼水中，置于90毫米圆形培养皿中。使用两个尖头镊子或针头手动去除胚胎的卵膜。随后在28°C下孵育胚胎5分钟。

使用安装在体视显微镜上的数码相机，在室温下进行一分钟的视频记录，观察尾部卷曲现象。随后以每秒30帧的时间分辨率采集时间序列图像。然后通过统计单位时间内弯曲次数，计算自发性尾部卷曲的频率。

为了评估药物利鲁唑的作用，将胚胎转移至一个新的含有5微摩尔利鲁唑的90毫米培养皿中，培养皿内装有斑马鱼养殖用水。随后在28摄氏度条件下孵育胚胎5分钟，然后录制一段时长为1分钟的视频并进行行为学分析。接下来，将20至24小时受精龄的胚胎置于含1%低熔点琼脂糖的斑马鱼养殖用水中，并在35毫米玻璃底成像培养皿中于37摄氏度下进行固定。

将胚胎侧向摆放，静置至琼脂糖在室温下凝固。随后将成像培养皿转移至共聚焦显微镜载物台上。通过488纳米氩激光激发单体Umikinoko-Green，识别表达该生物传感器的运动神经元。

然后将其发射波长设置在495至525纳米之间，并开始记录。进行FRET测量时，使用488纳米激光激发FRET对中的供体mUKG，同时利用两个光电倍增管检测供体发射的荧光以及单体Kusibira-Orange受体发射的荧光。

实验开始时，优化记录mUKG荧光的光电倍增管1的增益和偏移，并在整个实验过程中保持其恒定。设置偏移时，使用Q查找表将图像颜色转换为强度值。在激光关闭的情况下进行扫描时，调节偏移滑块，使背景像素的强度略高于零。

使用相同的查找表打开激光器。扫描时，调节增益滑块以最大化信噪比，同时注意避免像素饱和。在软件采集窗口中，从下拉菜单中选择xyt采集模式和512×64像素的图像视野大小。

然后记录胚胎脊髓神经元电压的变化，以每30毫秒获取一个XY平面，持续一分钟。为评估施加含5微摩尔利鲁唑的鱼水后对同一神经元膜去极化的影响，在加入药物5分钟后采集新的数据集。本视频中记录的是在20至24小时受精后阶段、常规鱼水中自发的卷曲运动，即仅由全身收缩组成、使尾尖触及头部的运动反应。

本视频展示了胚胎在5 µM利鲁唑孵育后发生的自发性卷曲。为了检验脊髓运动神经元电活动的改变是否为利鲁唑引起自发卷曲频率变化的基础，采用完全非侵入的方式，通过测量Mermaid生物传感器中供体-受体FRET对的荧光强度比值，研究了胚胎脊髓运动神经元的膜电位。鉴定出表达该生物传感器的初级脊髓运动神经元，并记录了其基础的自发性去极化活动。

随着尾部卷曲运动频率的降低，利鲁唑的给药也减少了自发性去极化事件的发生频率。一旦掌握该技术，研究人员便可借此研究完整胚胎神经网络的电学特性，从而充分保留发育中的功能系统内细胞间相互作用的复杂性。观看本视频后，您应能够充分理解脊髓神经元的电活动如何与自发性尾部卷曲的频率相关联。