通过冰重结晶抑制评估和冰亲和纯化分离鉴定植物冰结合蛋白

本实验方案的总体目标是通过检测冰结合活性并利用冰亲和纯化技术分离天然多肽，从而从植物中鉴定出新的冰结合蛋白（IBPs）。该方法有助于解答植物抗冻领域中的关键科学问题，特别是关于冰结合蛋白的研究。该技术的主要优势在于，无需使用复杂的纯化手段，即可直接从天然提取物中分离获得冰结合蛋白。

该方法的可视化演示至关重要，因为实验装置的搭建可能难以想象。首先按照文字方案中所述进行溅射装置的设置。为了诱导耐冻性草类或其他耐冻性植物物种中冰结合蛋白（IBPs）的表达，需在低光照条件下于4°C对植物进行最多一周的低温驯化。

在茎基部切取约 0.1 克叶片组织，放入 1.5 毫升离心管中。立即用液氮速冻样品，并于 -80 °C 保存备用。为裂解细胞，将组织样品置于液氮中，用研钵和研杵研磨成细粉。

确保在匀浆过程中液氮不发生蒸发。立即将研磨后的样品置于冰上，并让液氮完全挥发。然后加入一毫升天然蛋白提取缓冲液，用移液器吹打混匀。

在4°C下轻轻振荡样品过夜，并在相同温度下进行后续所有步骤。次日，以约1,600 ×g离心5分钟，去除细胞碎片。保留上清液；若仍有细胞碎片残留，可再离心5分钟。

澄清的样品可于-20摄氏度保存至使用。将100毫升正己烷倒入装有偏振膜的外部腔室中，并加入5至6颗干燥珠，以防止载玻片上积聚水分。然后在覆盖浴槽的平板上涂抹少量真空脂，旋转以确保密封严密，防止正己烷蒸发。

实验开始前40分钟，将冷却块放入聚苯乙烯盒中，置于塑料管正下方，并用干冰完全覆盖。开始检测前，确保塑料管处于水平状态。然后将冷块顶部的干冰移除。

首先，使用水测试该步骤，以确定样品在冷却块上的滴落位置。将固定在自动移液器上的一次性吸头浸入浸油中，这将使样品能够顺利下落，而不会黏附在移液器外部。使用纸巾擦去多余的油。

然后吸取10 µL水。将移液器直接置于塑料管上方，再释放水滴。当水滴接触到冷却块时，应能听到明显的溅落声，从而形成一层单层的冰晶。

接下来，将一块玻璃显微镜盖玻片放置在先前用水确定的液滴位置上。在开始实验前，立即打开光源，并刮去玻璃培养室底部形成的任何冰晶。然后按照与水相同的方法对样品进行溅射实验，将10微升样品释放到玻璃盖玻片上，以形成一层单层冰晶。

使用镊子迅速而小心地将载玻片从冷台上取下，并放入位于偏振膜上方的正己烷浴中。在显微镜下观察，将载玻片移入视野范围内，并调节物镜，使交叉偏振能够清晰显示高对比度的冰晶。将相机连接至显微镜，并将设置调整为微距模式，以便清晰观察冰晶并捕获图像。

对所有样品重复上述步骤。通常将最多六张带有不同样品的载玻片放入己烷室中。完成后，关闭光源。

然后将一块塑料板盖在己烷浴上，确保密封严密，并让冰晶在过夜过程中退火。孵育结束后，像之前一样拍摄冰膜的图像。在按照前述方法对植物组织进行低温驯化后，将约100至150克研磨后的生物量收集到20毫升离心管中。

立即速冻样品，并在使用前于负80摄氏度保存。按照之前方法制备样品，以1:1的比例重新悬浮叶片组织。额外添加蛋白酶抑制剂片剂，以防止内源性蛋白酶降解IBPs。

为去除细胞碎片，将裂解液用两层纱布过滤三次。在4摄氏度下，以30,000 × g离心40分钟，沉淀细胞碎片。然后使用天然蛋白提取缓冲液将样品体积调至120毫升，并立即用于冰亲和纯化，以避免冰结合活性的任何损失。

将冰指冷却至负0.5摄氏度后，随即浸入含有冷蒸馏水的50毫升离心管中。加入少量冰屑以促进冰核形成，并使冰指表面形成一层薄冰。该过程通常需要20至30分钟。

将样品放入一个含有小型磁力搅拌子的150毫升玻璃烧杯中，烧杯置于磁力搅拌器上方的聚苯乙烯容器内。确保冰指居中，并至少有一半浸入液体样品中。然后密封容器。

让程序运行约两天，每24小时检查一次。当样品有50%冻结时，停止程序。冰结合蛋白（IBPs）进入冰半球后将导致冰蚀现象。

为去除冰半球，将探针加热至4°C，然后用蒸馏水冲洗半球以去除未结合的蛋白质，并在4°C下融化。如果冰半球中仍含有色素，或为了提高样品纯度，可重复纯化步骤两到三次。

图中所示为从不含冰结合蛋白（IBPs）的缓冲液对照组以及不含IBPs的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）提取物中收集的样品。经过18小时后，缓冲液对照组和拟南芥提取物均无法抑制冰晶生长。相比之下，转染了来自冷适应黑麦草（Lolium perenne）冰结合蛋白的转基因拟南芥提取物能够显著限制冰晶的生长，其冰晶尺寸明显较小。

经过第一轮纯化后，半球表面出现的显著冰蚀现象表明，冰结合蛋白已吸附至冰上并改变了冰晶的生长方式。为了去除残留的溶质、色素及污染蛋白，进行了第二轮冰亲和纯化，从而获得更透明的冰半球。完成该步骤后，可利用纳升渗透压仪评估冰晶形态调控效应和热滞活性，以进一步表征冰结合蛋白的特性。

此外，可将分离的组分送至质谱仪进行分析，以鉴定肽段序列。