Name: 植物冰结合蛋白通过冰再结晶抑制和隔离的评估使用冰亲和力纯化鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学习使用冰亲和力纯化技术从耐冻植物中分离冰结合蛋白，并通过冰再结晶抑制实验评估其活性。该方法无需复杂纯化步骤即可从天然提取物中分离目标蛋白，为研究植物耐寒机制提供了简便可靠的技术手段。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）向 VKW 提供的资助支持。

1. 喷射装置设置
<ol>
	<li>将乙二醇（水体积比50%）注入可编程控温循环水浴中。 
	注意：可使用绿色汽车用乙二醇。</li>
	<li>组装外部腔室时，使用绝缘塑料管将水浴连接至双层玻璃碗。用聚苯乙烯泡沫对玻璃碗进行隔热，并用塑料培养皿盖覆盖。在聚苯乙烯腔室底部切一个3-4英寸的孔，以便光源能透过玻璃腔室被观察到。</li>
	<li>将外部腔室安装在配备有相机接口、4倍偏振物镜和10倍目镜的解剖显微镜上。在外部腔室底部额外放置一片偏振膜。</li>
	<li>将一根长1-1.5米、直径约5厘米的管子夹在铁架台上，并将其置于一个大型聚苯乙烯容器内，同时在管子下方、铁架台底部放置一个冷却块。</li>
</ol>
2. IRI 分析用天然蛋白质提取物的制备
<ol>
	<li>为了诱导耐冻性禾草或其他耐冻植物中冰结合蛋白（IBPs）的表达，将植物在4 °C、低光照条件（6小时光照/18小时黑暗）下进行冷驯化，持续最长1周。此步骤不适用于已从野外采集并经历过低温环境和驯化期的样品。</li>
	<li>通过在茎基部剪取约0.1 g的叶片组织，放入1.5 mL离心管中。立即在液氮中快速冷冻样品，并于-80 °C保存至使用。</li>
	<li>为裂解细胞，在液氮环境中使用研钵和研杵将组织样品研磨成细粉。确保在匀浆过程中液氮不完全蒸发。</li>
	<li>立即将研磨后的样品置于冰上，待液氮完全挥发后，加入1 mL天然蛋白提取缓冲液（含10 mM Tris-HCl、25 mM NaCl，pH 7.5），并在使用前立即加入两片无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂。用移液器吹打混匀；禁止涡旋振荡。 
	注意：如果裂解液中含有次生代谢物，可能需要添加其他成分（见讨论部分）。</li>
	<li>在4 °C下轻轻振荡样品过夜（18–24小时）。后续所有步骤均在4 °C下进行。</li>
	<li>以约16,000 × g离心5分钟，去除细胞碎片。保留可溶性组分，若仍有细胞碎片残留，可再离心5分钟。澄清后的样品可于-20 °C保存至使用。</li>
</ol>
3. 斑点实验预实验准备
<ol>
	<li>将100 mL正己烷倒入已安装偏振膜的外部腔室中，并加入5–6粒干燥珠，以防止载玻片上积聚湿气。在覆盖浴槽的平板上涂抹少量真空润滑脂，旋转以确保密封紧密，防止正己烷蒸发。</li>
	<li>使用可编程水浴在实验开始前约2–3小时将正己烷浴冷却至-4 °C至-6 °C之间。实验开始前务必用温度计检查正己烷的温度。</li>
	<li>在实验开始前40分钟，将冷却块置于聚苯乙烯盒中，正下方放置塑料管，并用干冰完全覆盖。</li>
	<li>在开始检测前，确保塑料管处于水平状态。为确定样品在冷却块上的滴落位置，可先用水进行测试，并用记号笔标记样品滴落的位置（如下所述）。</li>
	<li>从冷块顶部移除干冰，并将玻璃显微镜盖玻片放置在先前用水确定的滴落标记处。</li>
	<li>在开始检测前立即打开光源，并刮除玻璃腔室底部形成的任何冰层。除非正在观察冰晶，否则应避免开启光源，以防止加热正己烷。</li>
</ol>
4. 进行喷射检测实验
<ol>
	<li>将固定在自动移液器（1-20 µL）上的一次性吸头浸入浸油中，用纸巾擦去多余的油。此步骤可使样品下落，而非黏附在移液器外表面。 
	注意：从移液器上清除多余的油至关重要，以确保油滴不会在冰晶上形成，从而影响观察。</li>
	<li>吸取10 µL样品，将移液器直接置于塑料导管上方，然后释放样品。当样品接触到玻璃盖玻片时，应能听到明显的“啪”声，从而形成一层冰晶单层。</li>
	<li>迅速而小心地用镊子将载玻片从冷块上取下，并将其放置在偏振膜上方的己烷浴中。</li>
	<li>在显微镜下观察，将载玻片置于视野中，并调节物镜，使交叉偏振能够清晰显示高对比度的冰晶。将放大倍数调节至40倍。</li>
	<li>将相机连接到显微镜，并将相机设置调整为&#34;macro&#34;模式，以便清晰观察冰晶并拍摄图像。 
	注意：等待长达1小时，使冰晶继续生长，可获得更清晰的图像。</li>
	<li>对所有样品重复步骤4.1–4.5。通常可在己烷室中放置最多6个载玻片，每个载玻片上含有不同的样品。</li>
	<li>关闭光源，并在己烷浴上方盖上塑料板，确保密封严密。让冰晶在过夜条件下退火（12–24小时，在特定实验中保持一致的退火时间）。孵育结束后，按照上述方法拍摄冰膜图像。 
	注意：某些样品可能比其他样品更快发生再结晶。如果在12小时后仍未观察到明显的再结晶现象，可继续退火至24小时，以确保不会发生再结晶。</li>
</ol>
5. 斑点分析实验数据分析
<ol>
	<li>将照片上传至计算机，并直接比较退火前后冰晶的大小。具有冰重结晶抑制活性的样品不会生长，而无冰重结晶抑制活性的样品则会发生重结晶，形成明显更大的冰晶。光的干涉会使较大的冰晶呈现略微不同的色调，因此易于观察。</li>
</ol>
6. 冰亲和纯化设备设置
<ol>
	<li>向可编程温控循环水浴中加入乙二醇。可使用绿色汽车用乙二醇。</li>
	<li>使用绝缘塑料管将水浴连接至中空的黄铜探针15。</li>
	<li>制作一个聚苯乙烯容器，使其可紧密容纳一个150 mL烧杯。为该容器制作一个带中心孔的盖子，用于插入黄铜冷指。</li>
</ol>
7. 冰亲和纯化样品的制备
<ol>
	<li>按照 2.1 节所述对植物组织进行低温驯化。</li>
	<li>将约 100–150 g 研磨后的生物量（步骤 2.3）收集至 20 mL 离心管中，并立即进行速冻。样品可在使用前保存于 -80 °C。</li>
	<li>按照 2.3–2.5 节所述制备样品。重悬叶片组织时使用 1:1 的比例（组织质量（mg）: 天然蛋白提取缓冲液体积（mL））。添加额外的蛋白酶抑制剂片剂，以防止内源性蛋白酶降解冰结合蛋白（IBPs）。 
	注意：如果组织样品浓度过高，可将比例调整为 1:2 或 1:3（组织质量（mg）: 天然蛋白提取缓冲液体积（mL））。</li>
	<li>为去除细胞碎片，将裂解液通过两层纱布过滤三次。在 4 °C 条件下，以 30,000 × g 离心 40 分钟，沉淀碎片。</li>
	<li>使用天然蛋白提取缓冲液将样品体积调至 120 mL。裂解液应立即用于冰亲和纯化，以避免冰结合活性的任何损失。</li>
</ol>
8. 进行冰亲和纯化
<ol>
	<li>纯化前，将可编程水浴槽的温度以每小时降低0.04 °C的速率从-0.5 °C冷却至-3 °C。 
	注意：冷却速率可根据样品的初始体积进行调整。</li>
	<li>将冰指冷却至 -0.5 °C，随后浸入含有冷蒸馏水的 50 mL 离心管中。加入少量冰屑以促进冰核形成，使冰指表面形成一层薄冰。该过程通常需要 20 至 30 分钟。 
	注意：在将覆冰手指放入样品前，应用戴着手套的手将冰层上的任何凸起抹平。若在 -0.5 °C 时未形成冰层，可将温度降至 -0.75 °C。</li>
	<li>将样品放入含有小型磁力搅拌子的150 mL玻璃烧杯中，然后将烧杯置于磁力搅拌器上方的聚苯乙烯容器内。确保冰指中心对准并至少深入液面一半。密封容器。</li>
	<li>让程序运行约两天，每24小时检查一次。当样品有50%冻结时，停止程序。冰结合蛋白（IBPs）融入冰半球将导致 &#34;冰蚀刻&#34;. 
	注意：纯化实验可使用较大体积的样品进行，程序运行时间需相应调整。</li>
	<li>为去除冰半球，将探针加热至 4 °C，用蒸馏水冲洗半球以去除未结合的蛋白质，然后在 4 °C 下解冻。 
	注意：大多数IBPs在水中不稳定，需使用适当的缓冲液（即 在解冻过程中需定期加入 50 mM Tris-HCl（pH 8）或 50 mM 碳酸氢铵（pH 8）（约每 2 小时加入 1 mL）。冰半球可包裹铝箔后于 -20 °C 保存，待后续解冻使用。</li>
	<li>如果冰半球中仍含有色素，或为了提高样品纯度，重复步骤 8.1–8.5 两到三次。 
	注意：尽管经过多轮纯化后IBP的浓度可能降低，但如果纯化后的样品将用于质谱分析，则纯度比得率更为重要。若有充足的材料，建议进行三轮冰亲和纯化。</li>
</ol>
9. 抗冻蛋白的鉴定
<ol>
	<li>由于在冰半球融化后，IBPs存在于较大体积中，因此需对样品进行浓缩。使用截留分子量为3,000 Da的离心浓缩管，将含有约100 g组织的样品浓缩至约1–3 mL，以避免小分子蛋白质的丢失。</li>
	<li>在将样品送交质谱分析前，使用BCA或Bradford等蛋白质定量检测方法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE等凝胶电泳方法评估样品纯度。在送样进行质谱分析前，检测纯化后的蛋白质是否具有冰重结晶抑制（IRI）活性，以确保在纯化和浓缩过程中保留了具有活性的蛋白质。</li>
	<li>直接使用浓缩后的样品进行质谱分析10。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了成功分析和纯化冰结合蛋白（IBPs），了解其中某些蛋白质对温度敏感的特性至关重要。一些植物IBPs在高于0 °C的温度下会变得不稳定，导致其发生去折叠、沉淀并丧失活性。为获得具有活性的IBPs，通常必须在低温环境（约4 °C）中处理植物材料，并在实验过程中将样品保持在冰上。使用全细胞粗提裂解液时还需考虑的另一个因素是内源性蛋白酶对蛋白质的降解作用。在植物中，IBPs的表达水平通常较低，因此任何蛋白质产量的损失都可能导致后续实验或分析所需材料不足。在蛋白质提取过程中迅速操作，并添加可靠的蛋白酶抑制剂混合物，可减少此类蛋白质损失。此外，优化实验室培养植物的低温驯化时间，对于实现IBPs的最大程度积累也十分重要。
使用冰结合蛋白（IBPs）时另一个常见问题是，许多检测方法对温度和湿度敏感。在进行冰重结晶抑制（IRI）分析时，显微镜盖玻片上积聚的水分可能形成一层冰，从而难以观察冰晶。使用除湿机和额外的干燥剂珠可解决这一困难；然而，建议当实验室相对湿度超过70%时，不要进行该检测。
如本文所述，溅射实验（splat assay）是一...

冰结合蛋白（IBPs）是一类在多种生物体中发现的具有保护功能的蛋白质家族，包括植物1、昆虫2、鱼类3和微生物4。这类蛋白的关键特征是其能够特异性且高效地吸附于冰晶表面，从而调控冰晶的生长。IBPs具有多种已被记录的性质，其中研究最为深入的两种是热滞活性（TH）和冰重结晶抑制活性（IRI）。热滞活性在耐冻性较差的动物所产生的IBPs中更容易被观察到，该活性可降低生物体循环液或组织间液的冰点，从而防止结冰。相比之下，在耐冻生物体中，尽管不可避免地会在零下温度发生冻结，其IBPs通常表现出较低的热滞活性。尽管如此，这些蛋白往往表现出较强的冰重结晶抑制活性，以限制冰晶的生长。对于耐冻生物体而言，这种IRI活性被认为有助于保护细胞免受细胞外空间冰晶不受控制生长所造成的损伤。
“&#34;床垫扣&#34;”模型可用于描述冰结合蛋白（IBPs）抑制冰晶生长的机制5。根据该模型，IBPs 以一定间隔特异性地吸附在冰晶表面，使得水分子只能在结合的 IBPs 之间的空隙处并入正在生长的冰晶晶格中。这会形成一种曲率，使额外水分子的并入变得不利，这一现象可用吉布斯-汤姆森效应（Gibbs-Thomson effect）加以描述6。锚定笼形水合物假说（anchored clathrate waters hypothesis）则为 IBPs 特异性结合冰晶表面提供了机制解释：带电残基在蛋白质冰结合位点上的特定排列，可导致水分子发生重排，使其结构与冰晶晶格的一个或多个晶面相匹配7。
通过测量在冰结合蛋白（IBP）存在下单个冰晶的熔点与凝固点之间的温差，可以量化热滞（TH）活性。尽管热滞活性是评估IBP活性的广泛接受方法，但植物来源的IBP所产生的热滞值通常极低（一般仅为零点几摄氏度），往往需要较高的蛋白浓度、专用设备以及操作者具备丰富经验。虽然非IBP类物质也可能抑制冰晶生长，但抑制冰重结晶（IRI）是所有IBPs共有的特性，因此检测IRI活性是筛查IBP存在的有效初步手段，尤其适用于那些热滞活性较低的IBP。用于检测该活性的方法被称为“压片法”（splat assay），即将蛋白样品快速冷冻形成单层微小冰晶，随后在一段时间内观察冰晶生长是否受到限制。与其他用于组织样品中IBP筛查的方法相比，该技术适用于10–100 ng范围内的低蛋白浓度，所用设备易于制备，且所得数据可快速、简便地解读。然而，必须强调的是，该实验仅作为IBP的初步筛查手段，后续仍需通过测定热滞活性和冰晶形态变化来进一步确认。
天然蛋白质的分离具有挑战性，通常需要了解目标蛋白质的结构和生化特性。由于冰结合蛋白（IBPs）对冰具有亲和性，因此可利用冰作为底物来纯化这些蛋白质。在冰晶生长过程中，大多数分子会被推挤至冰-水界面的前方，因此当在含有IBP样品的条件下缓慢形成半球形冰体时，即可获得高度纯化的样品，其中几乎不含大量污染性蛋白质和其他溶质。该方法已被用于从昆虫8,9,10、细菌11、鱼类12以及植物13,14中鉴定IBPs。此外，通过该方法获得的富含IBP的组分还可用于后续的生化分析。本文概述了通过诱导和提取植物中的IBPs，利用冰重结晶抑制（IRI）活性分析确认蛋白质的存在，并采用冰亲和纯化技术分离蛋白质，从而实现植物中IBPs的鉴定。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>可调式实验台升降架</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄铜探针</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机/相机接口</td><td>Canon</td><td></td><td>佳能 Power Shot SX110 数码相机；定制显微镜接口</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>浓缩管（0.5 mL）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>浓缩管（15 mL）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>冷却块</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>使用金属加热块</td></tr><tr><td>除湿机</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50品脱Energy Star认证除湿机；从本地供应商购买</td></tr><tr><td>干燥剂珠</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6–8目；100%指示型</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双层玻璃烧杯</td><td>通用</td><td></td><td>从本地实验室玻璃器皿供应商处购买</td></tr><tr><td>干冰</td><td>通用</td><td></td><td>使用本地供应商；危险&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>通用</td><td></td><td>绿色汽车用乙二醇可从任何本地五金店购买（&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; Home Depot）</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>无水，95%；危险</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20 离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型塑料培养皿</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>通用</td><td></td><td>使用本地供应商；危险&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>塑料管</td><td>通用</td><td></td><td>从本地五金店购买PVC管</td></tr><tr><td>偏振膜</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯泡沫</td><td>通用</td><td></td><td>可由聚苯乙烯运输箱制成</td></tr><tr><td>瓷制研钵和研杵</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 &amp;micro;m 粒径</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>小型搅拌子</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>可编程温控水浴锅</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>乙烯基软管</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过冰重结晶抑制评估和冰亲和纯化分离鉴定植物冰结合蛋白

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

抗冻蛋白（ice-binding proteins, IBPs）属于一类在低于零度环境胁迫下由某些生物体合成的应激诱导蛋白。在植物中，当细胞外冰晶生长时会引起冻害，导致质膜破裂并可能引发细胞死亡。IBPs吸附于冰晶表面，通过一种称为冰重结晶抑制（ice-recrystallization inhibition, IRI）的过程限制冰晶进一步生长，从而减轻细胞损伤。此外，IBPs还表现出将溶液的冰点降低至平衡熔点以下的能力，这一特性被称为热滞活性（thermal hysteresis, TH）。由于IBPs在工业、医学和农业领域具有潜在应用价值，其保护特性引发了人们对新型IBPs鉴定的兴趣。本文描述了植物IBPs的鉴定方法，包括：1）在植物组织中诱导并提取IBPs；2）对提取物进行IRI活性筛选；3）IBPs的分离与纯化。在通过低温处理诱导IBPs表达后，采用“溅射法”（splat assay）检测提取物的IRI活性，该方法可在普通光学显微镜下观察冰晶生长情况。该检测方法所需蛋白浓度低，结果快速易读，可作为冰结合活性的初步筛选手段。随后可利用IBPs特异性吸附于冰的性质，通过“冰亲和纯化”技术将其从杂质蛋白中分离。使用植物提取物获得的细胞裂解液，可在铜质探针上缓慢生长出半球形冰体，使IBPs被整合入多晶冰的晶体结构中。该过程无需 先验的 在缺乏冰结合蛋白（IBP）的生化或结构信息的情况下，该方法仍可实现活性蛋白的回收。经冰纯化的蛋白组分可用于后续应用，包括通过质谱法鉴定肽段序列以及对天然蛋白进行生化分析。

为便于设置，图1 和 图2 分别提供了用于冰重结晶抑制（IRI）分析和冰亲和纯化的设备示意图。使用从含有和不含冰结合蛋白（IBPs）的芥菜中提取的样品进行IRI分析的结果如图3所示。结果表明，从不耐受冻害的芥菜中提取的样品由于缺乏IBPs，无法限制冰晶生长。相比之下，转入多年生黑麦草IBPs的转基因植株产生的提取物显著抑制了冰晶的生长，呈现出较小的冰晶形态。图4展示了利用经过两轮纯化后表达IBPs的多年生黑麦草提取物所培养出的冰半球。第一轮纯化后，冰半球表面出现明显的冰蚀刻现象，表明IBPs已吸附至冰表面并改变了冰晶的生长方式(图4A)。第二轮纯化后的冰半球（图4B</...

本文概述了通过评估抑制冰重结晶活性，并利用冰亲和纯化技术分离天然冰结合蛋白，从而从耐冻植物中鉴定冰结合蛋白的方法。

冰结合蛋白（Ice-binding proteins, IBPs）属于一类由某些生物在暴露于零下温度时合成的应激诱导蛋白。在……

本实验方案的总体目标是通过检测冰结合活性并利用冰亲和纯化技术分离天然多肽，从而从植物中鉴定出新的冰结合蛋白（IBPs）。该方法有助于解答植物耐冻性研究领域中的关键问题，特别是关于冰结合蛋白的研究。该技术的主要优势在于，无需使用复杂的纯化方法，即可从天然提取物中分离获得冰结合蛋白。该方法的可视化演示至关重要，因为实验装置的搭建可能难以理解。首先按照文字版实验方案中的描述设置撞击装置。为了诱导耐冻性草类或其他耐冻植物物种中冰结合蛋白（IBPs）的表达，需在低光照条件下于4 °C对植物进行最多一周的低温驯化。通过在茎基部剪取约0.1克叶片组织，并置于1.5毫升离心管中。立即用液氮速冻样品，并在-80°C下保存直至使用。为裂解细胞，在液氮中使用研钵和研杵将组织样品研磨成细粉。确保在匀浆过程中液氮不发生蒸发。立即将研磨后的样品置于冰上，并使液氮完全挥发。然后加入1 mL天然蛋白提取缓冲液，用移液器吹打混匀。在4°C下轻轻振荡样品过夜，并在相同温度下进行后续步骤。第二天，以约1,600 × g离心5分钟，去除细胞碎片。保留上清液；若仍有细胞碎片残留，可再离心5分钟。澄清的样品可保存在-20摄氏度，直至使用。将100毫升正己烷倒入装有偏振膜的外部腔室中，并加入5至6颗干燥珠，以防止载玻片上积聚湿气。然后在覆盖浴槽的平板上涂抹少量真空润滑脂，旋转以确保密封紧密，防止正己烷蒸发。实验开始前40分钟，将冷却块放入聚苯乙烯盒中，置于塑料管正下方，并用干冰完全覆盖。开始检测前，确保塑料管处于水平状态，然后移除冷块顶部的干冰。首先，使用水测试该步骤，以确定样品在冷却块上的滴落位置。将自动移液器上安装的一次性吸头浸入浸油中，使样品能够顺利下落，而不会黏附在移液器外部。用纸巾擦去多余的油。然后吸取10 µL水。将移液枪直接置于塑料管上方，再释放水样。当水滴接触到冷却块时，应能听到明显的溅落声，从而形成一层单分子冰晶。接下来，将一块玻璃显微镜盖玻片放置在先前用水确定的液滴位置上。在开始实验前立即打开光源，并刮去玻璃培养室底部形成的任何冰晶。然后按照与水样相同的方法对样品进行溅射实验，将10 µL样品释放到玻璃盖玻片上，以形成一层冰晶单层。使用镊子迅速而小心地将载玻片从冷台上取下，并放入位于偏振膜上方的正己烷浴中。在显微镜下观察，将载玻片移入视野范围内，并调节物镜，使交叉偏振能够清晰显示高对比度的冰晶。将相机连接至显微镜，并将设置调整为微距模式，以便清晰观察冰晶并拍摄图像。对所有样品重复上述步骤。通常将最多六张载玻片（每张载玻片上为不同样品）放入己烷室中。完成后，关闭光源。然后将塑料板盖在己烷浴上，确保密封严密，并让冰晶在过夜过程中退火。孵育结束后，按之前方法拍摄冰膜图像。在按照之前方法对植物组织进行低温驯化后，将研磨后的生物质约100至150克收集到20毫升离心管中。立即速冻样品，并在使用前于负80摄氏度保存。按照之前方法制备样品，以1:1的比例重悬叶片组织。额外添加蛋白酶抑制剂片剂，以防止内源性蛋白酶降解IBPs。为去除细胞碎片，将裂解液用两层纱布过滤三次。在4摄氏度下以30,000 × g离心40分钟，使碎片沉淀。然后使用天然蛋白提取缓冲液将样品体积调至120毫升，并立即用于冰亲和纯化，以避免冰结合活性的任何损失。将冰指冷却至负0.5摄氏度后，将其浸入含有冷蒸馏水的50毫升离心管中。加入少量冰屑以促进冰核形成，并使冰指表面形成一层薄冰。该过程通常需要20至30分钟。将样品放入一个150毫升的玻璃烧杯中，烧杯内含一根小型磁力搅拌子，并将烧杯置于磁力搅拌器上方的聚苯乙烯容器内。确保冰指中心对准并至少有一半浸入液体样品中，然后密封容器。让程序运行约两天，每24小时检查一次。当样品有50%冻结时，停止程序。冰结合蛋白（IBPs）进入冰半球后将导致冰蚀现象。为了去除冰半球，将探针加热至4°C，然后用蒸馏水冲洗半球以去除未结合的蛋白质，并在4°C下融化。如果冰半球中仍含有色素，或为了提高样品纯度，可重复纯化步骤两到三次。图中所示为从不含冰结合蛋白（IBPs）的缓冲液对照组以及不含IBPs的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）提取物中收集的样品。经过18小时后，缓冲液对照组和拟南芥提取物均无法抑制冰晶生长。相比之下，表达来自冷适应黑麦草（Lolium perenne）冰结合蛋白的转基因拟南芥提取物中的微小冰晶则显著抑制了冰晶的生长。经过第一轮纯化后，半球形冰表面出现显著的冰蚀刻现象，表明冰结合蛋白（IBPs）已吸附至冰表面并改变了冰晶的生长方式。为了去除残留的溶质、色素及污染蛋白，进行了第二轮冰亲和纯化，从而获得更透明的冰半球。完成该步骤后，可利用纳升渗透压仪评估冰晶形态调控能力及热滞活性，以进一步表征冰结合蛋白的特性。此外，可将分离的组分送交质谱分析，以鉴定肽段序列。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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