Name: 通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红细胞生成素及其后代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解利用小鼠他莫昔芬诱导命运图谱系统和流式细胞术表征卵黄囊造血祖细胞及其后代的方法。该技术可追踪驻留巨噬细胞在发育和成年期的分化过程，为免疫学研究提供重要框架。

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作者感谢 Frederic Geissmann 教授和 Christian Schulz 教授富有见地的讨论；感谢 Hannah Garner 博士对稿件的审阅；感谢 Xavier Montagutelli 博士、Jean Jaubert 博士以及巴斯德研究所动物设施工作人员在小鼠饲养方面提供的支持；感谢 Pascal Dardenne 以及 Amgen 学者 Vytaute Boreikaite 提供的技术协助。E.G.P. 实验室的研究工作由巴斯德研究所、法国国家科学研究中心（CNRS）、Cercle FSER（FRM）以及巴斯德研究所和 REVIVE 联盟提供的启动经费资助。L.I. 获得了 REVIVE 联盟提供的博士研究生奖学金支持。

动物实验操作均依照巴斯德研究所机构动物护理与使用委员会（CETEA）批准的规程进行。
1. 子宫内 脉冲标记在 Csf1r MeriCreMer 蔷薇属 LSL-YFP 胚胎
<ol>
	<li>配制4-羟基他莫昔芬（OH-TAM，50 mg/mL）的储备液。
	<ol>
		<li>在通风橱内，打开25 mg的OH-TAM小瓶，加入250 µL乙醇（100%）。</li>
		<li>使用截短吸头将OH-TAM溶液转移至2 mL微量离心管中，最大速度涡旋振荡10分钟。</li>
		<li>在超声波清洗仪中进行超声处理30分钟。</li>
		<li>在通风橱内加入250 µL PEG-35蓖麻油，得到50 mg/mL的储备液。 
		注：PEG-35蓖麻油是一种具有两亲性质的溶剂，可结合疏水性分子并使其在水相溶剂中溶解。</li>
		<li>最大速度涡旋约5分钟，并在超声波清洗仪中继续超声30分钟。</li>
		<li>每管分装90 µL（含4.5 mg），每管用于一次注射。</li>
		<li>如前所述13，可在4 °C保存1周，或在-20 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制黄体酮（10 mg/mL）的储备液
	<ol>
		<li>在通风橱内，向25 mg黄体酮中加入250 µL 100%乙醇，配制成10 mg/100 µL的混悬液，轻轻涡旋。</li>
		<li>在通风橱内加入2250 µL经高压灭菌的葵花籽油，配制成10 mg/mL的黄体酮溶液。</li>
		<li>最大速度涡旋约5分钟，分装后于4 °C保存。注意该溶液在储存时呈澄清状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>他莫昔芬给药 
	注：以观察到阴道栓形成日作为胚胎发育第0.5天（E0.5）。通过在E8.5时对怀孕的Csf1rMeriCreMer雌鼠进行单次注射诱导重组12。在他莫昔芬给药后，补充每克体重37.5 µg的黄体酮，以降低流产率。若在早晨发现阴道栓，则于下午1点进行注射。
	<ol>
		<li>注射当天早晨，将一份OH-TAM溶液分装物超声处理10分钟（或直至完全重悬）。</li>
		<li>在通风橱内加入360 µL 0.9% NaCl，配制成10 mg/mL的OH-TAM溶液，并充分涡旋。持续超声至溶液澄清且完全重悬（至少30分钟）。</li>
		<li>将黄体酮预温至室温。</li>
		<li>在微量离心管中混合450 µL OH-TAM和225 µL黄体酮，涡旋混匀。</li>
		<li>至少超声10分钟，然后用25G针头将溶液装入1 mL注射器中。</li>
		<li>在动物实验设施中称量怀孕雌鼠（Csf1rMeriCreMer雌鼠为近交系FVB遗传背景，典型体重在25至33 g之间）。</li>
		<li>进行腹腔注射，缓慢将计算体积的溶液注入小鼠体内。拔出针头后，轻压穿刺部位并按摩腹部，以促进OH-TAM的分布。 
		注：OH-TAM的注射剂量为75 mg/kg，黄体酮剂量为37.5 mg/kg。表1列出了对怀孕雌鼠注射所需的具体体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>小鼠体重（g）</td>
			<td>从混合液中注射的总体积（µL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26</td>
			<td>292</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>303</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28</td>
			<td>315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29</td>
			<td>326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31</td>
			<td>348</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32</td>
			<td>360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33</td>
			<td>371</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34</td>
			<td>382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>394</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：4-羟基他莫昔芬（OH-TAM）的注射体积。 在E8.5时期单次注射所需的体积，剂量为每克（体重）75 µg OH-TAM，并补充每克37.5 µg黄体酮。
2. 卵黄囊（YS）和胎肝（FL）的解剖
注意：操作胚胎时，除非需要进行长期培养，否则无需严格的无菌技术。但工作区域必须保持清洁，并在吸水纸下铺上铝箔覆盖。
<ol>
	<li>准备预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）和消化液（含 1 mg/mL 胶原酶 D、100 U/mL 脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）和 3% 胎牛血清的 PBS）。</li>
	<li>在所需妊娠天数（例如 胚胎期 E10.5）通过颈椎脱位法处死怀孕雌鼠。</li>
	<li>用镊子夹住生殖器上方的皮肤，用剪刀在中线处做一小切口。将皮肤向头部方向拉起，完全暴露无毛的腹壁。剪开腹肌以暴露内脏，并将肠道推开以显露两个子宫角。</li>
	<li>用中号钝头镊子夹住附着于卵巢的脂肪垫，轻柔牵拉子宫。在子宫颈水平剪断子宫角，并将其从腹膜腔中取出。去除脂肪垫以完全游离子宫角，然后在两侧分别剪断子宫角与卵巢的连接。</li>
	<li>将子宫角放入盛有预冷 PBS 的 10 mm 培养皿中。迅速夹住子宫肌层的一端（宫颈端），将精细剪刀插入肌层与蜕膜组织之间，释放出带有周围蜕膜组织的胚胎。 
	注意：肌层在取出后容易迅速收缩，因此此步骤应尽可能快速完成。</li>
	<li>使用一对精细镊子切除 Reichert 膜和胎盘。</li>
	<li>小心去除卵黄囊，并将其放入含有 0.5 mL 消化液的 24 孔组织培养板中。 
	注意：此步骤可收集胚胎血液。
	<ol>
		<li>在切断脐带和卵黄囊血管后，立即将胚胎转移至含有 10 mM 预冷乙二胺四乙酸（EDTA）的 12 孔组织培养板中。使用锋利的精细剪刀剪下胚胎头部，尽量减少组织撕裂。冰上孵育 10–15 分钟，收集含有血液的 EDTA 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除围绕胚胎的羊膜。</li>
	<li>对于 &#60;E11.5 阶段的胚胎，通过计数体节对数以更准确地确定胚胎发育阶段并提高时间分辨率（每对体节约每 1 小时 30 分钟形成一对）。</li>
	<li>使用镊子或精细剪刀剪下胚胎头部。将头部转移至含有 0.5 mL 消化液的 24 孔板中。 
	注意：在较晚阶段，神经外胚层和脑组织可进一步解剖用于流式细胞术分析；请仔细去除周围的血管丛。</li>
	<li>在后肢上方剪断胚胎，并移除前肢。</li>
	<li>为分离肝脏，使用一对精细镊子打开胸腔。在心脏前方夹住组织并轻柔牵拉，同时用第二把镊子将器官从体内分离。
	<ol>
		<li>仔细将胎肝与心脏和肠道分离。将胎肝转移至含有 0.5 mL 消化液的 24 孔板中。在解剖显微镜下仔细监控转移过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集尾部区域（或其他胚胎部分）用于聚合酶链式反应（PCR）基因分型。 
	注意：可从 E10.5 胚胎中获取其他组织和器官进行类似流式细胞术分析。在 E10.5 可采集血液、头部皮肤、主动脉-性腺-中肾区（AGM）、心脏和神经外胚层。在较晚阶段还可采集肺、肾、脾和胰腺。不同发育阶段 AGM 区域的详细解剖方法已有文献报道 14。</li>
</ol>
3. 胚胎组织的流式细胞术处理
<ol>
	<li>将器官（置于消化液中）在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>将组织和酶解液转移至置于6孔细胞培养板中的100 μm细胞筛上，该培养板每孔已加入6 ml FACS缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的1×PBS溶液）。使用2 mL注射器的黑色橡胶活塞轻轻研磨，进行机械解离，以获得单细胞悬液。 
	注意：此后所有步骤均应在 4 °C 下进行。</li>
	<li>用巴斯德吸管收集细胞悬液，并转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 320 × g 离心 7 分钟。用抽吸法弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于60 µL Fc阻断缓冲液中（CD16/CD32阻断抗体用FACS缓冲液按1:50稀释）。
	<ol>
		<li>将50 µL单细胞悬液转移至圆底96孔板的每个孔中。冰上孵育至少15分钟。 
		注意：当处理少量样本时，染色也可在5 mL聚苯乙烯FACS管中进行。</li>
		<li>将剩余的10 µL转移至一个5 mL聚苯乙烯FACS管中，以获得来自每种组织的样本混合液。该混合液将作为对照（即 未染色样本及每种荧光染料对应的荧光减一（FMO）对照。将每种荧光减一（FMO）对照（每种荧光染料对应一个）的混合液各取 50 µL，转移至 96 孔板中。 
		注意：每个FMO对照包含抗体组合中所有偶联荧光染料的抗体，唯独缺少待检测的那一种。FMO对照用于确定设门边界，并控制多色组合中的光谱重叠。为了准确反映不同组织间背景信号和自发荧光的差异，必须使用每种组织样本混合物来制备这些对照。针对YFP表达的适当对照应为经PCR基因分型确认的Cre阴性胚胎样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 表面抗原染色
<ol>
	<li>在FACS缓冲液（表2）中配制抗体混合液。每个样本准备50 µL抗体混合液。
	<ol>
		<li>使用以下荧光素偶联抗体：抗-CD45.2（克隆104）；抗-CD11b（克隆M1/70）；抗-F4/80（克隆BM8）；抗-AA4.1（克隆AA4.1）；抗-Kit（克隆2B8）；以及抗-Ter119（克隆Ter119）。</li>
		<li>在FACS缓冲液中配制六种用于FMO对照的抗体混合液。每种对照样本准备50 µL抗体混合液。 
		注意：抗体混合液中的抗体稀释度比材料表中所示的最终浓度高两倍。对于包含六种荧光素偶联抗体的检测组合，需制备6个FMO对照。表2列出了一个反应管中抗体混合液及FMO对照的组成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="7">抗体体积（µL）（终体积 50 µL）&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>克隆号</td>
			<td>抗体混合液</td>
			<td>FMO CD45.2</td>
			<td>FMO CD11b</td>
			<td>FMO F4/80</td>
			<td>FMO AA4.1</td>
			<td>FMO      Kit</td>
			<td>FMO Ter119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45.2</td>
			<td>104</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b</td>
			<td>&#160;M1/70</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80</td>
			<td>BM8</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AA4.1</td>
			<td>AA4.1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Kit</td>
			<td>2B8</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ter119</td>
			<td>Ter119</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FACS 缓冲液</td>
			<td>45.5</td>
			<td>46.5</td>
			<td>46</td>
			<td>46.5</td>
			<td>46.5</td>
			<td>46</td>
			<td>46</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：染色及荧光减一（FMO）对照所用抗体的体积。达到终体积50 µL所需的抗体体积（µL）。
<ol start="2">
	<li>向96孔板中的样品加入50 µL抗体混合液（染色时最终体积为100 µL）。轻轻吹打混匀2次，置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以320 × g离心96孔板7分钟，弃去上清液。用200 µL FACS缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>用150 µL FACS缓冲液重复洗涤步骤（步骤4.3）两次。</li>
	<li>通过70 μm滤网将样品及对照（FMOs和未染色混合样品）过滤至5 ml聚苯乙烯管中。置于冰上保存，直至上机检测。</li>
</ol>
5. 通过流式细胞术鉴定EMP和卵黄囊来源的巨噬细胞
注意：本实验方案采用配备405 nm紫激光、488 nm蓝激光、562 nm黄激光和638 nm红激光的四激光流式细胞仪进行优化。
<ol>
	<li>根据制造商说明书为每种偶联抗体准备补偿微珠。使用未染色样本和补偿微珠优化激光强度。</li>
	<li>为确定设门边界，针对每种抗体使用FMO（减去一色荧光）对照。</li>
	<li>为排除死细胞，在上机前1分钟向试管（含200 µL染色细胞悬液）中加入1 µL DAPI（1 mg/mL）。利用强烈的DAPI信号和前向散射参数（FSC）排除死细胞和碎片。 
	注意：使用流式细胞仪配套软件在采集过程中设门。补偿矩阵的设置及数据分析可在样本采集后使用其他商业软件完成。</li>
	<li>利用前向散射和侧向散射（FSC vs SSC）从全部事件中区分活细胞并排除双联体。</li>
	<li>创建对数坐标荧光散点图，并依次设门：首先排除红细胞（Ter119+），然后鉴定祖细胞（Kit+）和造血细胞（CD45+ Kitneg）（见图1）。</li>
	<li>创建荧光直方图，以量化YFP在卵黄囊（图2）、胎肝（图3）和脑组织（图4）中不同鉴定细胞群体中的标记效率。</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+pathways+to+mature+macrophages+in+the+early+mouse+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac.</a> Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
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<li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li>
<li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在短时间内，不同波次的造血前体细胞存在部分重叠，这使得分析发育性造血各波次对免疫细胞贡献的技术难度非常大。
他莫昔芬诱导型Cre系统提供了以时间可控的方式标记特定细胞的机会，并可在胚胎或成体中进行谱系分析，而无需 离体 或 体外 培养或移植。在他莫昔芬诱导型Cre品系中，将细菌Cre重组酶与人雌激素受体配体结合域的突变体融合（CRE-ER），或改进的单点突变Cre与两个小鼠雌激素受体融合（Mer-iCre-Mer）。Cre与雌激素受体的融合导致Cre被Hsp90隔离于细胞质中，从而阻止其在细胞核内介导重组。他莫昔芬（TAM）经肝脏代谢为其活性代谢产物4-羟基他莫昔芬（OH-TAM），后者与雌激素受体具有高亲和力。OH-TAM与融合型Cre结合后，破坏其与Hsp90的相互作用，使Cre得以转位至细胞核并启动Cre介导的重组。注射TAM或OH-TAM 在子宫内 向怀孕雌性个体给药已被证明可激活发育中胚胎的重组。妊娠期间给予他莫昔芬可能导致流产，从而减少产仔数量；若在妊娠中期后给药，则可能阻止自然分娩，此时需通过剖宫产手术娩出幼仔。为...

在发育过程中存在若干波次相继出现但部分重叠的造血祖细胞，其髓系子代细胞可延续至成年。首先，单能性 &#34;原始的&#34; 前体细胞在小鼠卵黄囊中出现 1,2 在E7.5至E8.25之间产生，且不经过任何单核细胞中间阶段而直接生成胚胎巨噬细胞。由原始前体细胞衍生的巨噬细胞是否能在成年大脑中作为小胶质细胞持续存在，目前仍是活跃的研究课题。其次，红髓前体细胞（Erythro-Myeloid Precursors, EMPs）于E8.5时期在卵黄囊中出现，进入血液循环并定植于胚胎。EMPs通过依赖Runx1的内皮-造血转化过程，从卵黄囊的造血内皮中产生。 3,4虽然EMP能在卵黄囊内分化为巨噬细胞，但它们也会从胚胎第9天（E9）起定植于胎肝5 并分化为红细胞、巨核细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和肥大细胞 6源自EMP的巨噬细胞在发育期及成年组织中均表现出增殖能力。由于目前对这些巨噬细胞的分化途径知之甚少，EMP来源的巨噬细胞是否在分化过程中绕过单核细胞阶段仍存在争议。 7,8最后，造血干细胞（HSCs）于胚胎期10.5天（E10.5）在胚胎本体的主动脉-性腺-中肾区形成，并迁移至胎肝。具有长期重constitution能力的HSCs仅在E11之后（即42对体节阶段）方可检测到。9在此处，它们从E12.5开始扩增并分化，直至确定性造血开始逐渐转移至骨髓，此后骨髓将成为出生后生命期间主要的血细胞生成场所。 10.
由于出现时间与空间上的重叠，以及免疫表型标志物的共用，迄今为止我们仍难以区分这些胚胎造血祖细胞不同波次的具体贡献。尽管EMP和HSC均以Runx1依赖的方式产生，并共同表达转录因子Myb和生长因子受体Csf1r（集落刺激因子1受体，亦称巨噬细胞集落刺激因子受体）等分子，但EMP可通过其缺乏淋巴系分化潜能（无论体外还是体内）、缺乏长期重建造血能力以及不表达谱系标志物Sca-1等特征与HSC相区分11。由于遗传谱系示踪模型能够以细胞特异性和时间特异性的方式靶向胚胎祖细胞，因此成为表征巨噬细胞发育起源的必要工具。本文介绍了我们实验室所采用的谱系示踪方案，用于区分成年个体大多数组织中存在的两类巨噬细胞：由HSC衍生的浸润性巨噬细胞和不依赖HSC的定居型巨噬细胞。
组织驻留巨噬细胞可追溯至表达细胞因子受体 Csf1r12 的 Myb 非依赖性前体细胞，利用三种互补的命运图谱技术发现，这些细胞在胚胎发育的 E8.5–E10.5 时期即已存在6。为了在不标记胎儿造血干细胞（HSCs）的情况下研究卵黄囊造血作用，我们采用了一种转基因小鼠品系Csf1rMeriCreMer，该品系在 Csf1r 启动子的调控下表达一种他莫昔芬可诱导的融合蛋白，即“改良型”Cre 重组酶与两个小鼠雌激素受体（Mer-iCre-Mer）的融合体。因此，Cre 重组酶仅在表达 Csf1r 的细胞中于有限的时间窗口内被激活。当该品系与携带位于 lox-STOP-lox 盒下游荧光蛋白的报告小鼠品系（Rosa26LSL-eYFP）联合使用时，可实现对诱导时刻存在的细胞及其所有后代的永久性遗传标记。在 E8.5 时给予他莫昔芬的活性形式 4-羟基他莫昔芬（OH-TAM），可标记早期髓系前体细胞（EMPs）和巨噬细胞，但不会标记卵黄囊来源的单能性&#34;原始&#34;前体细胞或胎儿造血干细胞。借此，我们已表征了 EMPs 及其后代在胚胎发育过程中的免疫表型，并评估了卵黄囊来源巨噬细胞对成体巨噬细胞库的贡献。尚需进一步研究以明确该策略是否也能标记原始前体细胞来源的巨噬细胞，以及这些细胞是否能够贡献于成体巨噬细胞库。

<table><tbody><tr><td>#5 直头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19/B Pascheff-Wolff 弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>8.5 cm 直剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Kit-PE（克隆 2B8）</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>FACs 缓冲液中 1/200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.2 APC-Cy7（克隆 104）</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>FACs 缓冲液中 1/100 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 AA4.1-APC（CD93，克隆 AA4.1）</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>FACs 缓冲液中 1/100 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ter119 PerCP-Cy5.5（克隆 Ter119）</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>FACs 缓冲液中 1/200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80-BV421（克隆 BM8）</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>FACs 缓冲液中 1/100 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b PE-Cy7（克隆 M1/70）</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>FACs 缓冲液中 1/200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 阻断剂，克隆 2.4G2）</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Fischer Scientific</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 U 型底组织培养板</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2 mL 塑料注射器 Plastipak&amp;nbsp;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网 100 &amp;micro;m 细胞滤器</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网 70 &amp;micro;m 细胞滤器</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon 管</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Stericup GP 过滤装置，0.2 &amp;mu;m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-羟基他莫昔芬 25mg</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG</td><td>配制和使用他莫昔芬及其衍生物时需格外小心。务必使用适当的个人防护装备</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>务必使用适当的个人防护装备</td></tr><tr><td>PEG-35 蓖麻油（Kolliphor/Cremophor EL）</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>葵花籽油</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td><td>务必使用适当的个人防护装备，并在通风橱中操作</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI，1 mL（1 mg/mL 水溶液）</td><td>Fischer Scientific</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 日常质控荧光微球</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>VersaComp 抗体捕获微球试剂盒（2×5 mL）</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

巨噬细胞是免疫系统固有免疫分支中的专职吞噬细胞。在稳态条件下，静息型巨噬细胞存在于成体组织中，作为抵御感染和组织损伤的第一道防线。尽管其他免疫细胞持续由骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPC）再生，但一类被称为组织驻留巨噬细胞的巨噬细胞谱系已被证实可在不依赖骨髓HSPC输入的情况下实现自我维持。这类谱系的典型代表包括脑内的小胶质细胞、肝脏中的库普弗细胞以及表皮中的朗格汉斯细胞等。肠道和结肠固有层是唯一缺乏HSPC非依赖性驻留巨噬细胞的成体组织。近期研究表明，驻留巨噬细胞起源于胚外卵黄囊造血过程，其前体细胞不同于胎儿造血干细胞（HSC）。在卵黄囊确定型造血过程中，红髓祖细胞（EMP）可分化为红系和髓系细胞，特别是组织驻留巨噬细胞。EMP仅在胚胎发育E8.5至E10.5天之间于卵黄囊中产生，并在循环系统建立后迅速迁移至胎儿肝脏，在此扩增并分化直至至少E16.5天。其子代包括红细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞，但唯有EMP来源的巨噬细胞可持续存在于成体组织中。由于EMP的出现具有短暂性，且其产生时间与HSC生成期部分重叠，使得对这些前体细胞的分析变得困难。我们建立了一种基于巨噬细胞集落刺激因子受体Csf1r启动子表达的他莫昔芬诱导型命运图谱示踪技术，用于鉴定EMP及其衍生细胞 体内 通过流式细胞术。

通过在E8.5时向与携带Rosa26-LSL-eYFP报告基因的雄鼠交配的Csf1r-Mer-iCre-Mer雌鼠体内给予OH-TAM，实现遗传谱系示踪。在OH-TAM存在的情况下，终止盒被切除，导致表达Csf1r的细胞永久性表达YFP。我们在E10.5时从小鼠胚胎中采集了两种造血组织（卵黄囊和胎肝）以及一种非造血组织（神经外胚层）。通过酶解和机械解离获得单细胞悬液，并使用荧光标记抗体染色后通过流式细胞术进行分析。在排除死细胞和双联体后，对单细胞悬液进行分析（图1）。所有设门均使用荧光减一对照（FMO）确定。建议同时进行红细胞排除（Ter119+ 细胞），以提高分析的清晰度（图1B）。利用细胞表面标志物Kit（前体细胞标志物）和CD45（造血细胞标志物），我们能够区分出三群目标细胞：Kit+ CD45neg、Kit+ CD45low 和 Kitneg CD4...

尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。

巨噬细胞是免疫系统固有免疫分支中的专职吞噬细胞。在稳态条件下，静息态巨噬细胞存在于成年个体的组织中，其中……

本实验的总体目标是利用小鼠他莫昔芬诱导的命运图谱系统和流式细胞术，在体内表征卵黄囊造血祖细胞及其子代细胞。该方法有助于回答免疫学领域中关于区别于造血干细胞的造血祖细胞发育与分化过程的关键问题。该技术的主要优势在于，可在限定的时间窗口内标记造血祖细胞，并持续监测其子代细胞（如组织驻留巨噬细胞）在发育期及成年期的动态变化。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，原因在于胚胎组织所含细胞量较大，且需要同时处理大量样本。开始实验时，首先将解剖获得的小鼠子宫角转移至一个含有约 30 毫升冰上预冷 PBS 的 10 毫米培养皿中。随后，立即用镊子夹住子宫角宫颈端的肌层，将精细剪刀插入肌层与蜕膜组织之间，以分离胚胎。然后用精细镊子去除Reichert膜和胎盘。轻轻剥离卵黄囊，并将其转移至含有0.5毫升消化液的24孔组织培养板中。切断脐带和卵黄囊血管后，立即将胚胎转移至含有2毫升10毫摩尔预冷EDTA溶液的12孔组织培养板中。用锋利的精细剪刀将胚胎头部去除后，将躯体和头部置于冰上孵育10至15分钟，随后取出胚胎并收集含有血液的EDTA。接着去除包围胚胎的羊膜。之后去除胚胎的后肢和附属肢。使用一对精细镊子打开胸腔，然后用镊子夹住心脏前部，同时用另一对镊子轻轻将内脏组织从体内松解，缓慢牵拉。在解剖显微镜下，将胎肝与心脏及肠道分离。并将器官转移至含有0.5毫升消化液的24孔板中。与心血管系统的解剖学连接对于胎肝的识别至关重要。胎肝仍处于此发育阶段，胚胎越年轻，解剖分离越困难。为制备原代细胞悬液，将收集的器官在37摄氏度下于消化液中孵育30分钟。将组织连同酶解液转移至置于六孔组织培养板一孔上的10微米细胞筛中，该孔内已加入1毫升FACS缓冲液。使用2毫升注射器的黑色橡胶活塞轻轻研磨组织，以解离获得单细胞悬液。然后，用巴斯德移液管吸取细胞悬液，转移至15毫升离心管中。在4摄氏度下以320 ×g离心7分钟。离心后，吸除并弃去上清液。接下来，配制新鲜的Fc封闭缓冲液，并将沉淀重悬于60 µL中。然后，取50 µL单细胞悬液转移至96孔圆底板的一个孔中。将板置于冰上孵育至少15分钟。接下来，将剩余的10微升悬浮液转移至一个5毫升聚苯乙烯FACS管中，以获得来自不同组织的样本混合液。从混合液中取出50微升，分别加入96孔板中，用于每种荧光染料的FMO对照。为进行细胞表面抗原染色，使用一组六种荧光染料标记抗体配制抗体溶液和FACS缓冲液。然后配制六种抗体溶液以及用于FMO对照染色的FACS缓冲液。随后，向96孔板中的各样品加入50 µL抗体溶液。通过轻柔地反复吹打混匀样品，然后将板置于冰上孵育30分钟。在4°C条件下，以320 × g离心96孔板7分钟，弃上清液。用200 µL FACS缓冲液重悬细胞，再次离心。通过倒置板去除上清液时应格外小心。必须通过一次快速的手腕动作将96孔多孔板倒置，以避免细胞松动。最后，使用70微米滤网将组织和对照样品过滤至6毫米聚苯乙烯管中。现在可进行流式细胞术分析。对一群活的非红系单细胞进行分析，检测其祖细胞标志物KIT和造血细胞标志物CD45的表达。在目标细胞群中，可区分出三种不同的细胞亚群：KIT阳性CD45阴性、KIT阳性CD45低表达以及KIT阴性CD45阳性。在卵黄囊 Kit 阳性前体细胞中，CD45 阴性和 CD45 低表达细胞群体均含有表达黄色荧光蛋白（YFP）的 AA4.1 阳性细胞，表明不依赖于 CD45 的表达，未成熟的 Kit 阳性前体细胞首先表达 AA4.1。在肝脏和脑组织中发现的 AA4.1 阳性、YFP 阳性细胞仅存在于 Kit 阳性、CD45 低表达的前体细胞群体中，很可能代表来源于卵黄囊前体细胞的循环前体细胞。巨噬细胞存在于 Kit 阴性、CD45 阳性细胞群体中，被鉴定为 F480 明亮、CD11B 阳性细胞。通过单次给予4-羟基他莫昔芬，可有效标记卵黄囊、肝脏和大脑中的巨噬细胞，这可能表明其来源于胚胎前体细胞（ENP）。一旦掌握，细胞分离与染色的操作过程若正确进行，可在三至四小时内完成。在尝试该操作时，需始终牢记样品采集后应立即置于冰上保存。新鲜的FACS缓冲液应每天配制并过滤。按照本方案，可使用其他谱系示踪或流量株系，如Rosa MTMG或Rosa confetti品系，以进一步探究标记后细胞的未分化状态及前态潜能。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红细胞生成素及其后代

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。...

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。...

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。...

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本文介绍了一种培养咽弓的实验方案，用于研究心脏和肌肉前体细胞及其微环境的生物学特性。...

离体 培养咽弓以研究心脏与肌肉前体细胞及其微环境

我们描述了一种利用流式细胞术对小鼠精子细胞进行分选的策略。精子细胞被分为四个高纯度的群体，包括圆形精子细胞（精子形成阶段1-9）、早期伸长精子细胞（精子形成阶段10-12）、晚期伸长精子细胞（精子形成阶段13-14）以及伸长型精子细胞（精子形成阶段15-16）。分选依据包括DNA染色、细胞大小和颗粒度。...

通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

了解利用小鼠他莫昔芬诱导命运图谱系统和流式细胞术表征卵黄囊造血祖细胞及其后代的方法。该技术可追踪驻留巨噬细胞在发育和成年期的分化过程，为免疫学研究提供重要框架。

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

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