Name: קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל במבחנה על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור את קינטיקת סינתזת ה-DNA של הגדיל המפגר באמצעות חלבוני השכפול של bacteriophage T7. שיטה זו מאפשרת לזהות שלבים מרכזיים בסינתזת קטעי Okazaki ולהבין את תפקידי ה-DNA primase וה-DNA polymerase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי מעבדת C.C.R. על ההערות ול-S. Moskowitz על הכנת האיורים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות F32GM101761 (A.J.H.) ו-GM54397 (C.C.R).

הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים. הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ&quot;מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר 8, 9, 10. דנ&quot;א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5&#39;-GGGTC-3 &quot;, 5&#39;-GTGTC-3&quot;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) ניתן לרכוש ממגוון רחב של חברות סינתזה DNA (אורך של ssDNA יכול להיות תלוי האנזים של בחירה עבור primase T7, pentamer הוא אורך תבנית המינימום לסנתז פריימר באורך מלא 11, כמו C הנסתר חיוני, אולם אם היה פריימר הוא תוארך פולימראז, נוקלאוטידים נוסף חייב להיות נוכח בסוף &#39;3 של התבנית. תגובות יזומים על ידי תוספת של ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ MgCl 2 וטופחו על 25 מעלות צלזיוס. דגימה ידנית עובדת היטב עבור נקודות זמן של 5 שניות או יותר. אם בזמן נקודות קצרות מזו נדרשות, מומלץ להשתמש באמצעי זרימה מהיר-להרוות להשיג נתונים מדויקים. 1. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור ידי דגימה ידנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, aliquot 2 μL של חיץ לצבוע לפוראמיד (93% (V / V לפוראמיד), 50 מ&quot;מ EDTA, 0.01% cyanol קסילן ו 0.01% bromophenol כחול) לתוך 8 1.5 צינורות פוליפרופילן מ&quot;ל. באופן כללי, מספר צינורות שווה למספר נקודות זמן המנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת 20 μL המורכב חיץ 1x, 0.1 מ&quot;מ ATP ו CTP, 0.25 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP, 0.1 מיקרומטר SSDתבנית NA, ו -0.1 מיקרומטר gp4 (מבוטא ריכוז hexamer - 0.6 מיקרומטר מונומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 2 μL של התערובת באמצעות pipettor ומערבבים עם 2 μL חיץ לצבוע לפוראמיד צינור 1.5 מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1 עבור כל שליטה התגובה (זמן אפס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של 0.1 M MgCl 2 לתערובת התגובה (לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני למשוך 2 דגימות μL של תערובות התגובה באמצעות pipettor ב 10 מרווחי ים ומערבבים עם צבע לפוראמיד predispensed ב 1.5 צינורות מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען aliquots של דגימות על ג&#39;ל denaturing. המוצרים פריימר tetraribonucleotide קטן מסונתז על ידי primase T7 נפתרות היטב על acrylamide 0.4 מ&quot;מ עובי 25%: bisacrylamide (19: 1), 3 M אוריאה, TBE 1x (100 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל כולו על chromatograPHY נייר ומכסים בניילון נצמד. ג&#39;ל ניקוי באמצעות היבשים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סדרת דילול של שארית תערובת התגובה ספוט באותו הנפח טעון על הג&#39;ל על גבי נייר כרומטוגרפיה, כלומר, במקום 4 μL של הדילול אם 4 μL של מדגם הועמס. הערה: זה ישמש את עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז של מוצרים נוצרו במהלך התגובה. לדוגמה, פי חמישה דילולים באמצעות TE חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) עובד טוב, פורש מגוון של 1:25 עד 1: 15.625 (5 2 -5 6), אבל דילולים צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הפעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף ג&#39;ל יבש רגיל באמצעות מסך phosphorimager. לכמת את הרדיואקטיביות בסדרת הדילול לבנות עקום סטנדרט כמתואר 8, 12 הערה: הכללה של DNA פולימראז T7 לתערובת התגובה מאפשרת לאדם EXAשלי השימוש של פריימרים tetraribonucleotide ע&quot;י אנזים זה. באופן אופטימלי, ריכוז פולימראז יש להרוות כדי לפשט את הפרשנות של הנתונים. ריכוז פולימראז של 0.4 מיקרומטר ומעלה נותן תוצאות טובות. בנוסף, ההשפעה של חלבונים אחרים, כגון חלבונים מחייב חד גדילי דנ&quot;א, משני סינתזה פריימר או חניכה גדיל מפגרת ניתן לבדוק בדרך זו. </li></ol> 2. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור באמצעות מכשיר Rapid-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 0.2 מיקרומטר hexamer gp4, 0.2 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 0.2 מ&quot;מ ATP ו CTP (כולל 0.5 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע של מכשיר זרימה מהירה-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ראפמכשיר זרימה id-להרוות; לאחר הופעת התפריט הראשי, הקלד 7 במקלדת המכשיר כדי להזיז את נהג המזרק לעמדת המוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מזרק להרחיב בעמדה &quot;עומס&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקי חיץ טוען <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף חוצץ המכיל מזרק 10 מ&quot;ל לנמל מזרק הכונן. שינוי מיקום ידית מזרק כדי &quot;לטעון&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 10 מזרקים מ&quot;ל, למלא מאגר חיץ מכשיר ו- B עם 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 1 mM EDTA ולמלא מזרק C עם פתרון להרוות (250 מ&quot;מ EDTA, ו -0.2% SDS). הסר בועות אוויר על ידי דחיפת בוכנות פנימה והחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית שינוי עמדות &quot;אש&quot;. סוג 2 כדי לשנות את מיקום של בר נהג מזרק. לחץ &quot;להתאים DOWN&quot; על מנת להקטין את המזרק עד חיץ יוצא לולאת היציאה: (7-יורדים ברציפות; צעד גדול 8 למטה; 9-קטן צעד למטה). הקלד &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עו&quot;דאח היציאה בתור ואקום. שנת ידיות מדגם &quot;סומק&quot;. מזרק חיץ לסגור על ידי קביעת הידיות למצב האופקי. הפעל ואקום לטבול 2 לולאות הסומק H 2 O עבור 10 s, ואז לטבול MeOH במשך 10 שניות. ניקוי לולאות ידי מציצת אוויר עבור ~ 15 שניות, או עד יבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טוענים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום ידית מדגם שנה &quot;עומס&quot;. מניחים פתרון לתוך מזרק 1 מ&quot;ל. חבר מזרק לתוך לאחת מיציאות עומס המדגם. חזור על הפעולה עבור פתרון B, ומניחים בנמל עומס מדגם ההפך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של נקודות זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט הראשי, מסוג 1 לריצה להרוות-זרימה. זן זמן תגובה (ים) ולחץ &quot;ENTER&quot;. מספר לולאת התגובה להשתמש יוצג. Switch to לולאת תגובה הנדרשת. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדגם ידיות &quot;לטעון&quot;. תגובה טען מתערבבת לולאות מדגם עד ממש מחוץ לתא הערבוב המרכזי. הפעל את כל הכפתורים כדי &quot;FIRE &quot;. מוודא שכל הכפתורים נמצאים בעמדה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 1.5 מיליליטר מתחנת רכבת תחתי לתוך סוף לולאת יציאה. לחץ &quot;GO&quot; כדי להפעיל את התגובה. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. מזרקי חיץ רענן A ו- B עד שהם להכות את הנהג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבי 2.2.6.2-2.2.6.3 עבור כל נקודת זמן רצויה. יוצא מן הכלל: אל תטען תמיסה המכילה מגיב ההתחלה (כלומר, MgCl 2 במקרה זה) כאשר מרווה השליטה אפס זמן נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום איסוף דגימות, הזן &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. לחץ &quot;7&quot; כדי לחזור נהג מזרק חיץ לעמדת המוצא שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר לניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור מזרקי תערובת תגובה. הפעל ידית טעינה מדגם למצב &quot;עומס&quot;. תחת ואקום, לשטוף כל לולאה המדגם עם 10 מ&quot;ל 0.2 N NaOH, ואחריו 10 מ&quot;ל 0.3 NH 3 PO 4 ו -10 מ&quot;ל MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ידיות מזרק למצב &quot;עומס&quot;. לחץ כלפי מטה על כל 3 SYRבוכנות אינגה לאחזר מאגרי תגובה להרוות. לשטוף מזרקים עם 5 מ&quot;ל H 2 O לפחות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרקים שוב עם 5 מ&quot;ל H 2 O ולהפוך ידיות למצב &quot;אש&quot;. שינוי עמדות כפתור ולהדליק ואקום כדי להסיר H 2 O. Flush כמו בשלב 2.2.4. כבה המכשיר. הערה: מוצרים מנותחים כמתואר בשלבים 1.7-1.12. בנוסף, DNA פולימרז T7 וחלבונים שכפול אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה לנתח את השפעתם על סינתזה פריימר או הרחבה. </li></ol></li></ol> 3. תגובת סינתזת פריימר חד מחזור הערה: סינתזת פריימר חד מחזור / מבחני הרחבה מתבצעים באופן דומה לתגובות מרובה-מחזור, עם הבדלים גדולים כמה: מבחנים אלה בצעו את ההמרה של ה- ATP רדיואקטיבי לתוך מוצרים פריימר או רחבה, אולם ריכוז המצעים וחלבונים הם consideraבליי גבוה. בנוסף, על מנת להשיג ברזולוציה אלפית השנייה כדי לאפשר ניתוח של סינתזת התגובה פריימר, אחד חייב לנצל מכונת זרימה מהירה-להרוות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות תגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 3 מיקרומטר hexamer gp4, 6 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 1 מ&quot;מ CTP, ו -2 ננומטר [γ- 32 P] ATP. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע זרימה מהיר-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות כמתוארות בשלב 2.2. אם תרצה בכך, להוסיף פולימראז T7 DNA או T7 חד גדילי ה- DNA חלבון מחייב בריכוז של 15 מיקרומטר ו 20 מיקרומטר, בהתאמה. במקרה זה, את המוצרים הרחבים להצטבר משטר זמן המאפשר דגימה ידנית של התגובה. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומות התקדמות מוצר לנכונות שאינו ליניארי least-מודלי ריבועים באמצעות תוכנה זמינה מסחרי מסוגלים ריבועים לפחות מתאימים ו / או אינטגרציה נומרית. הפרטים של המבצע ישתנו עם התוכנה מועסקת, אך להלן צורות כלליות של משוואות המשמשות התאמת הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את קצב היווצרות התוצר של תגובות סינתזת פריימר מספר המחזור ידי ההתאמה להתקדם עקומות למשוואה ליניארית. אם יש עיקום ניכר, השתמש בשיטת שיעורו הראשונית 13, 14 על ידי התאמת הנתונים לפונקציה יחידה מעריכים: y = A (e - t k), כאשר y הוא ריכוז המוצר, A היא משרעת התגובה, k הוא הקבוע לקצב המהיר שנמדד בטלסקופים, t הוא הזמן, בשניות. השיפוע של המשיק בשלב = 0 הוא השיעור הראשוני. הערה: Fit טרום יציב תגובות סינתזת פריימר מדינת משוואה ליניארית או למשוואה טרום יציבה פרץ מדינת Y = A (e - k buהראשון t) + שיעור ss t, כאשר A הוא משרעת התגובה, פרץ k הוא קבוע קצב ציין עבור פרץ במצב טרום יציב, ss השיעור הוא ss שיעור היציב = חתול k [אנזים]), t הוא הזמן , בשניות. התאם תגובות סינתזת פריימר חד מחזור להתקדם עקומות על יחיד מעריכי פונקציה y = A (ה - k t). במקרה של gp4, להתאים את הנתונים על ידי אינטגרציה נומרית 15, למודל עם שלושה שלבי עיבוי NTP, כאשר כל ביניים נמצאים בשיווי משקל עם האנזים, באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. </li></ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ&quot;מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. לכן אנו עכשיו להקפיא פלאש aliquots קטן של gp4 מטוהרים 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 מ&quot;מ TCEP, ו -10% גליצרול באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 ° C. בעוד השימוש ...

השכפול של הדנ&quot;א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג&#39;ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ&quot;א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ&quot;א. דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל. המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ&quot;א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.

<table><tbody><tr><td>גבישים מוגדרים מראש של Tris pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית מלח אשלגן מונוהידרט</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr> <tr><td>(Ethylenedinitrilo) חומצה טטראצטית, מלח דיסודיום, דיהידרט</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha;-32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>רדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>רדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה</td></tr><tr><td>100 מ"מ dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>ארבעה dNTPs חלק מסט</td></tr><tr><td>100 מ"מ ATP ו-CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>חלק מ-NTP סט</td></tr><tr><td>ssDNA מבני</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות</td><td>N/A</td><td>רצפים מותאמים אישית&nbsp;</td></tr><tr><td>מתנול&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צילין קסיאנול&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>N,N&פריים; -Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>בוסטון ביופרודקטס</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר זרימה מהירה&nbsp;</td><td>חברת קינטק</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קינטק אקספלורר</td><td>קינטק קורפ</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>תוכנת סינרג'י</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

קינטיקה של סינתזת dna מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage t7

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לבדיקה קינטית של סינתזת DNA בפיגור במבחנה על ידי חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7. רפליזום T7 הוא אחת ממערכות השכפול הפשוטות ביותר הידועות, המורכבת מארבעה חלבונים בלבד, המהווה תכונה אטרקטיבית לניסויים ביוכימיים. דגש מיוחד מושם על סינתזה של פריימרים ריבונוקלאוטידים על ידי ה-T7 primase-helicase, המשמשים את DNA פולימראז ליזום סינתזת DNA. מכיוון שמנגנוני שכפול הדנ"א נשמרים לאורך האבולוציה, פרוטוקולים אלה צריכים להיות ישימים, או שימושיים כקרש קפיצה רעיוני, לחוקרים המשתמשים במערכות מודל אחרות. הפרוטוקולים המתוארים כאן רגישים ביותר וחוקר מנוסה יכול לבצע ניסויים אלה ולהשיג נתונים לניתוח תוך יממה בערך. הציוד המיוחד היחיד הנדרש הוא מכשיר זרימה מהיר, אך ציוד זה נפוץ יחסית וזמין ממקורות מסחריים שונים. עם זאת, החסרונות העיקריים של בדיקות אלה כוללים את השימוש ברדיואקטיביות ואת התפוקה הנמוכה יחסית.

התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם 32 P במיקום-α בתגובות סינתזה פריימר (איור 1 א). מבשר שכותרתו, CTP, מציגה את הניידות הגבוהה ביותר נודד לכיוון החלק התחתון של הג&#39;ל, ואחריו מינים נודדים אי...

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את הקינטיקה של סינתזת ה-DNA של הפריימר והחוט המפגר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השכפול של ה-DNA, כגון כיצד נוצרים פריימרים על ידי DNA primase, וכיצד הם מועברים ומנוצלים על ידי DNA polymerase. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את זיהוי השלבים המכריעים במהלך סינתזת מקטעי אוקזאקי (Okazaki fragments).מכיוון שבניסוי זה נעשה שימוש בחומרים רדיואקטיביים, יש להישמע לכל התקנות המוסדיות בנוגע לשימוש בטוח וסילוק של חומרים רדיואקטיביים. התחילו על ידי חלוקה של 2 µL של תמיסת דאי (dye buffer) של formamide לשמונה מבחנות פוליפרופילן של 1.5 mL, כמספר נקודות הזמן שיש לנתח. לאחר מכן, הכינו תערובת של 20 µL המורכבת מבאפר, ATP, CTP, CTP המסומן בקבוצת האלפא-פוספט על ידי P32, תבנית DNA גדיל יחיד, והחלבון gene four, או GP four primase helicase.דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השתמשו בפיפטור כדי להוציא 2 µL מהתערובת, וערבבו אותה עם 2 µL של תמיסת דיי-בופר של פורממיד באחד ממבחנות ה-1.5 mL שהוכנו קודם לכן. זוהי בקרת ה"אין תגובה" (no reaction control).הוסיפו 2 µL של מגנזיום כלוריד 0.1 M לתערובת התגובה והפעילו טיימר באופן מיידי. במרווחי זמן של 10 שניות, שאיבו ידנית דגימות של 2 µL מתערובת התגובה, וערבבו אותן עם צבע הפורממיד ב

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

גורלו של replisome הבאה התנגשות עם ראש על RNA פולימראז (RNAP) אינו ידוע. אנו מוצאים כי הדוכנים replisome על התנגשות עם RNAP חזיתית, אך קורות חיים התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. MFD מקדמת מחדש שכפול ידי הקלת עקירה של RNAP לאחר ההתנגשות.

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג'ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

לשחזור מדויק, זמן יעיל כמותיים PCR (qPCR) שיטה לספור T7 bacteriophage מתואר כאן. הפרוטוקול מתאר בבירור phage הכנה דנ א גנומי, PCR התגובה הכנה, תנאי הרכיבה qPCR, ניתוח נתונים qPCR.

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול לבחינה תפקודית של שעתוק ופעילות מעכבת של חומרים אנטיבקטריאליים המכוונים לשעתוק חיידקים.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

Drosophila oogenesis ממשיכה להיות שימושית במיוחד בחקר התפשטות מיטוכונדריאלית ותורשה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט המשמש לתיוג ה-DNA המיטוכונדריאלי המשכפל (mtDNA) בשחלות בוגרות של דרוזופילה עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המאפשר לחשוף מנגנונים הקשורים לתורשה מיטוכונדריאלית שהיו שנויים במחלוקת בעבר.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

אנו מתארים כאן גישה מהירה ופשוטה יחסית למיפוי תזמון שכפול יונקים ברחבי הגנום, מבידוד תאים ועד לניתוח בסיסי של תוצאות הריצוף. מפה גנומית של תוכנית שכפול מייצגת תסופק בהתאם לפרוטוקול.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

חקור את קינטיקת סינתזת ה-DNA של הגדיל המפגר באמצעות חלבוני השכפול של bacteriophage T7. שיטה זו מאפשרת לזהות שלבים מרכזיים בסינתזת קטעי Okazaki ולהבין את תפקידי ה-DNA primase וה-DNA polymerase.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל

גלה סרטונים נוספים