Name: 使用主神经球文化研究纤毛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习利用主神经球培养技术研究神经干细胞和祖细胞中的初级纤毛发生与信号蛋白运输。该方法为理解纤毛在神经发育中的功能提供了重要的实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.M. 实验室的工作由 CPRIT（R1220）和 NIH（1R01GM113023-01）的人才引进资助项目提供经费支持。

1. 从小鼠成年脑中分离神经球
<ol>
	<li>使用过量异氟烷处死一只成年小鼠（约2个月大）。确认小鼠呼吸已停止后，立即进行解剖。</li>
	<li>使用剪刀沿中线切开颅骨，取出脑组织。</li>
	<li>将脑组织置于盛有冰冷PBS的10 cm培养皿中，并置于冰上。按照全组织解剖法从侧脑室获取SVZ组织48。</li>
	<li>将侧脑室放入1.5 mL离心管中，加入500 µL含0.05%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，于37 °C水浴中孵育15分钟。</li>
	<li>孵育15分钟后，加入500 µL终止培养基，用1 mL枪头轻柔吹打20–30次。吹打过程中避免产生气泡。 
	注意：此步骤对细胞存活至关重要。</li>
	<li>以500 × g离心8分钟，弃上清液，加入1 mL PBS，用1 mL枪头轻柔吹打5次重悬细胞。</li>
	<li>再次以500 × g离心8分钟，用1 mL枪头吸除上清液，加入1 mL基础培养基。</li>
	<li>（可选）若观察到细胞碎片，可通过70 µm细胞筛过滤细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞；通常每SVZ可获得约30,000–60,000个细胞。</li>
	<li>将一个SVZ来源的细胞接种至10 cm培养皿中，加入10 mL NSC培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>（可选）为避免神经球融合49，可将1,000个细胞接种于超低吸附6孔板的一个孔中，每孔预先加入1.5 mL NSC培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：培养5–7天后可观察到神经球（图2A）。培养时间可能因小鼠年龄或遗传背景不同而有所差异。</li>
	<li>每隔3–4天添加2 mL NSC培养基以维持培养（无需移除原有培养基）。</li>
</ol>
2. 神经球分化能力分析与纤毛发生检测
<ol>
	<li>为分析分化能力，需在贴壁条件下使用分化培养基对神经球进行分析。</li>
	<li>使用前通过高压灭菌或紫外照射对12 mm圆形盖玻片进行灭菌。进行贴壁细胞培养时，在无菌条件下将灭菌后的12 mm圆形盖玻片放入24孔板的孔中。</li>
	<li>用500 µL的0.002%多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液将盖玻片孵育10秒，吸除溶液后室温干燥10-15分钟。</li>
	<li>加入500 µL层粘连蛋白溶液（5 µg/µL），将盖玻片在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>吸除层粘连蛋白溶液，加入500 µL分化培养基或NSC培养基（未分化对照）。</li>
	<li>进行分化实验时，在显微镜下用200 µL枪头挑取直径100–200 µm的神经球，每孔加入5–10个神经球至24孔板中，并在分化培养基中培养7–10天。</li>
	<li>为分析未分化的神经球，将5–10个神经球加入24孔板的每孔中，在NSC培养基中培养1–2天。贴壁的神经球将铺展并以单层形式生长（图2B）。</li>
	<li>小心吸除培养基后，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温固定细胞15分钟，随后在室温下用PBS洗涤两次，每次5分钟。培养板可在4 °C保存1–2个月。 
	注意：为观察NSC培养基中的神经干细胞/前体细胞及分化培养基中的分化细胞，需进行免疫荧光染色，靶标包括Nestin（神经干细胞/前体细胞标志物）、β–tubulin III（TUJ1单克隆抗体，神经元标志物）、GFAP（胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞标志物）和O4（少突胶质细胞标志物）（图2B-E）。为分析纤毛结构，需对Arl13b（初级纤毛标志物）和Gpr161（纤毛G蛋白偶联受体）进行免疫荧光染色（图3）。</li>
	<li>将盖玻片用封片液封固于载玻片上，并倾斜载玻片以去除多余液体。</li>
</ol>
3. 神经球中纤毛发生的分析
<ol>
	<li>为了通过免疫染色分析完整神经球中的细胞，将含有多个神经球的1 mL培养基转移至1.5 mL离心管中，在500 × g下离心8分钟。弃去上清液后，用4%多聚甲醛（PFA）固定神经球15分钟，并用PBS洗涤。&#160;在500 × g下再次离心8分钟，弃去上清液，然后在4°C下用30%蔗糖孵育神经球过夜（O/N）。&#160;</li>
	<li>使用1 mL枪头弃去上清液，并用剪去尖端的1 mL枪头加入500 µL OCT包埋剂。剪去枪头边缘以扩大开口，因为OCT较为黏稠。</li>
	<li>将含有神经球的OCT包埋剂转移至一次性塑料冷冻模具（10 mm × 10 mm × 5 mm）中。</li>
	<li>将模具置于干冰上冷冻至少15分钟。</li>
	<li>（可选）暂停实验，将模具储存在-80 °C冰箱中，最长可保存1年。</li>
	<li>使用冷冻切片机切割切片，切片厚度应为15–30 µm。</li>
	<li>为了观察神经球中的初级纤毛，对Arl13b进行免疫染色（图4）。</li>
</ol>
4. 神经球和贴壁神经干细胞的培养与传代
<ol>
	<li>当神经球大小在 100–200 µm 之间时进行传代；当神经球过大（300 µm 或以上）时，不适合用于实验。</li>
	<li>使用 1 mL 吸头将神经球转移至 50 mL 离心管中，在 500 × g 条件下离心 8 分钟。</li>
	<li>用抽吸装置弃去上清液，加入 500 µL 含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 的 PBS 溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟。胰蛋白酶用量根据神经球数量而定。</li>
	<li>加入 500 µL 含血清培养基，用 1 mL 吸头轻柔吹打 20 次。</li>
	<li>在 500 × g 条件下离心 8 分钟，使用 1 mL 吸头弃去上清液，加入 1 mL 基础培养基。</li>
	<li>（可选）若观察到细胞碎片或未完全解离的神经球，可通过 70 µm 细胞筛过滤细胞悬液。</li>
	<li>将细胞以 10,000 个细胞/cm2 的密度接种于 10 cm 培养皿中，在神经干细胞培养基中进行传代培养；细胞约一周后可进行下一次传代。</li>
	<li>（可选）如需冻存细胞，加入冻存液制成每毫升含 500,000 至 1,000,000 个细胞的悬液&#160;，使用程序冻存盒进行冷冻保存；未解离的神经球也可直接冻存。</li>
	<li>对于贴壁培养，将细胞稀释至 50,000 个细胞/cm2&#160;，接种于经多聚赖氨酸（PLL）和层粘连蛋白（Laminin）包被的盖玻片上，使用神经干细胞培养基培养 1–2 天。</li>
</ol>
5. 饥饿处理与纤毛分析
<ol>
	<li>制备饥饿培养基（表1）。</li>
	<li>贴壁细胞解离后初次接种1-2天后，将其中一个孔更换为NSC培养基（对照组），另一孔更换为饥饿培养基（实验组）。</li>
	<li>将贴壁细胞继续培养24小时。</li>
	<li>在室温下用4%多聚甲醛（PFA）在PBS中固定细胞15分钟，随后在室温下用PBS&#160;洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>（可选）暂停实验，将含有盖玻片的24孔板置于4 °C的PBS中保存1-2个月。</li>
	<li>进行免疫荧光染色实验7,50。</li>
	<li>使用封片液封固盖玻片。在室温避光条件下过夜干燥载玻片&#160;。</li>
	<li>在复合显微镜下以所需放大倍数采集图像。使用显微镜、相机和物镜（40X/1.3油镜和63X/1.4油镜），并通过配套软件进行控制。以0.5-0.8 µm的间隔采集足够的z轴连续切片图像（图5）。</li>
	<li>对贴壁细胞中纤毛定位进行定量分析时，通过观察DAPI通道，连续采集3-8个视野的图像堆栈（细胞应达到汇合状态）。使用ImageJ/Fiji软件对初级纤毛数量进行量化。通常可在ImageJ插件&#34;Cell counter&#34;工具（位于Plugins&#62;Analyze对话框中）统计表达GPCR阳性纤毛的细胞数量；也可从ImageJ/Fiji导出图像堆栈的最大投影图像。为便于计数和导出，同一实验的所有图像应采用相同的图像亮度和对比度参数。</li>
</ol>
6. 神经球的转染
<ol>
	<li>将解离的细胞接种到盖玻片上，贴壁培养24小时。通常在24孔板的一个孔中加入500 µL NSC培养基，细胞密度为75,000至150,000个细胞。</li>
	<li>在0.5 mL微量离心管中，加入25 µL低血清培养基和1.5 µL转染试剂，涡旋混匀5秒。</li>
	<li>在另一个0.5 mL微量离心管中加入25 µL低血清培养基和2.5 µg无内毒素质粒DNA，涡旋混匀5秒。</li>
	<li>向含DNA的第二个微量离心管中加入1 µL转染试剂，涡旋混匀5秒。</li>
	<li>将含DNA的管中混合液加入第一个微量离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。</li>
	<li>室温孵育10–15分钟。孵育结束后，将转染混合液逐滴缓慢加入含有NSC培养基（500 µL/孔）的孔中。</li>
	<li>转染后24小时更换培养基，替换为对照培养基（NSC培养基）或饥饿培养基（500 µL/孔）。</li>
	<li>转染24小时后，更换为4% PFA&#160;固定细胞，随后进行免疫染色；通常该方案的转染效率可达10%。</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种从成年小鼠侧脑室下区（SVZ）建立并维持神经球培养的方法。关于这些培养物，有以下几点需要注意。首先，神经球的大小通常在50 - 200 µm之间。根据我们的经验，当神经球直径超过300 µm时，已错过传代的最佳时机，这些较大的神经球中心会含有死亡细胞。其次，由于神经球常用于研究神经干细胞/前体细胞，因此使用EGF和基础成纤维细胞生长因子（bFGF）以维持这些细胞的干性至关重要。因此，在神经球的维持过程中必须避免使用诱导分化的因子，如胎牛血清（FBS）。已有研究表明，10% FBS可诱导神经球分化为星形胶质细胞47。第三，神经球向神经元分化的程度可能取决于小鼠的年龄；若希望获得更强的神经元分化能力，可使用更年轻的幼鼠（出生后第0天）。第四，若建立新的培养体系，始终建议检测神经球的分化潜能。第五，本方法还允许将已建立的神经球培养物冻存，并在将来实验中复苏使用。复苏后，细胞通常以贴壁的梭形细胞形式生长，无需使用多聚-L-赖氨酸或多层粘连蛋白。这可能是由于冻融过程对细胞造成了损伤。重要的是，在传代前应持续培养细胞至融合度达到60 - 80%。传代后，细胞通常重新形成神经球，并可连续传...

初级纤毛是一种基于微管的动态亚细胞区室，在协调细胞信号通路（包括胚胎神经元发育过程中的Sonic Hedgehog（Shh）通路1,2）以及成年神经元功能中的区室化亚细胞信号传导3,4中发挥感觉天线的作用。这些通路的信号组分，如Shh受体Patched5、通路激活因子Smoothened（Smo）6，以及负向调控Shh通路的孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）Gpr1617，均以动态方式定位于纤毛中。已有多个GPCR被报道可在脑内神经元的纤毛中定位7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。纤毛及其介导的信号通路缺陷会影响多种组织，统称为纤毛病17,18,19。纤毛病的疾病谱常包括神经发育缺陷，例如颅面异常20,21,22。此外，下丘脑神经元中的初级纤毛调控中枢饱腹信号通路，其缺陷可导致中枢性肥胖23，这与Bardet-Biedl综合征等综合征型纤毛病中的肥胖表现相似24。同时，纤毛内的神经肽受体信号传导也参与调控中枢饱腹通路11,14。腺苷酸环化酶III（ACIII）和某些GPCR（如海马神经元中的生长抑素受体3）在纤毛中的定位异常会导致新物体识别障碍和记忆缺陷25,26，并伴随纤毛完整性缺失27。纤毛介导的信号通路在发育过程中的作用与组织稳态密切相关；特别是，纤毛在小脑颗粒前体细胞来源的Shh亚型髓母细胞瘤进展中具有重要作用28,29。因此，初级纤毛在胚胎期、出生后及成年期的神经元发育与功能中均发挥关键作用。
神经干细胞（NSCs）存在于哺乳动物侧脑室的室下区（SVZ）、海马齿状回的颗粒下区以及下丘脑第三脑室的室管膜区30,31,32。NSCs具有多向分化潜能，具备自我更新能力，在脑发育和再生医学中具有重要作用30。SVZ中的大多数NSCs处于静息状态，具有单一的初级纤毛，该纤毛在许多情况下会延伸至侧脑室33。初级纤毛通过多种受体的定位介导信号转导，引发下游细胞反应，尤其涉及Shh、TGFβ以及受体酪氨酸激酶通路2,34,35,36。由于初级纤毛伸入侧脑室，人们推测其可感知脑脊液（CSF）中的细胞因子，从而激活NSCs37。近期研究表明，Shh信号通路和初级纤毛在多种组织（包括嗅上皮、肺和肾）的修复与再生过程中对干细胞的激活至关重要38,39,40,41。然而，CSF与NSCs之间的通讯机制以及初级纤毛是否参与其中仍不清楚。培养中的贴壁NSCs具有纤毛，可将Shh通路组分（如Smo和Gpr161）定位于纤毛内，并对Shh产生响应42。因此，NSCs可作为研究Shh通路、纤毛运输及神经元分化通路的重要模型系统。此外，由NSCs分化而来的神经元也可用于纤毛运输检测实验。
神经球是由神经干细胞/前体细胞在特定生长因子和非黏附表面条件下增殖形成的游离细胞簇43,44神经球具有重要意义 体外 用于研究正常发育与疾病中神经干细胞/前体细胞的培养模型31,45,46,47在此，我们介绍一种基于神经球的实验方法，用于培养神经干细胞/前体细胞并诱导其分化为神经元和胶质细胞。我们特别关注信号通路组分在神经干细胞/前体细胞及分化后神经元纤毛中的转运过程图1与原代神经元培养相比，原代神经球相对易于培养，可进行多次传代和冻融循环，并能分化为神经元和胶质细胞。重要的是，我们发现神经球来源的神经干细胞/前体细胞及分化后的神经元在培养中均具有纤毛结构，并且与纤毛功能相关的信号分子定位于这些纤毛区室中。基于神经球的培养方法可作为研究神经干细胞及分化神经元中纤毛发生和纤毛转运的理想模型系统。

<table><tbody><tr><td>12 mm 圆形盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm 培养皿</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure 驴抗兔 IgG（H+L）</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>驴抗兔 Alexa 488 二抗</td></tr><tr><td>Arl13B，克隆 N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50X），无血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>一次性乙烯基标本模具</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm × 10 mm × 5 mm</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 10X，改良型，不含氯化钙和氯化镁，液体，无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片液</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>封片液</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG1 二抗，Alexa Fluor 555 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>羊抗小鼠 IgG1，Alexa 555 二抗</td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG2a 二抗，Alexa Fluor 555 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>羊抗小鼠 IgG2a，Alexa 555 二抗</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>人 bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm 深度</td><td>改进型 Neubauer 计数板</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤基底膜来源层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>层粘连蛋白</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&amp;nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF 蛋白，CF</td><td>R and D systems</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine science tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>载玻片</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液（10X）</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>胰蛋白酶</td></tr><tr><td>COSTAR 6 孔板，带盖，平底，超低吸附表面聚苯乙烯，无菌</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>超低吸附 6 孔板</td></tr><tr><td>&amp;beta;-微管蛋白 III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

利用原代神经球培养物研究初级纤毛

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

初级纤毛在胚胎期、出生后及成体生命过程中神经干细胞/前体细胞的增殖以及神经元分化中具有根本性的重要作用。此外，大多数已分化的神经元均具有初级纤毛，其内含有信号受体（如G蛋白偶联受体）和信号分子（如腺苷酸环化酶）。初级纤毛决定了多种发育通路的活性，包括在胚胎神经元发育过程中音猬因子（sonic hedgehog）信号通路的调控，同时在成体神经元功能中发挥促进细胞内区室化信号传导的作用。毫不意外的是，初级纤毛的生成与功能缺陷已被证实与脑部发育异常、中枢性肥胖以及学习和记忆障碍相关。因此，迫切需要在神经干细胞/前体细胞和已分化神经元的背景下研究初级纤毛的生成及纤毛内物质运输。然而，原代神经元的培养方法需要较高的专业技术，且不适用于冻融循环。在本实验方案中，我们介绍了利用原代神经球培养混合群体神经干细胞/前体细胞的方法。基于神经球的培养方法兼具多种优势：可进行多次传代和冻融操作，具备向神经元和胶质细胞分化的潜能，并可进行转染操作。重要的是，我们发现来源于神经球的神经干细胞/前体细胞及分化后的神经元在体外培养中均具有纤毛结构，并能将与纤毛功能相关的信号分子定位于这些区室中。利用此类培养体系，我们进一步描述了在神经干细胞/前体细胞及分化神经元中研究纤毛形成和纤毛运输的方法。这些基于神经球的研究方法使我们能够在神经干细胞/前体细胞和分化神经元的背景下，研究由纤毛调控的细胞信号通路，包括G蛋白偶联受体和音猬因子（sonic hedgehog）信号通路。

将室下区（SVZ）细胞接种于神经干细胞（NSC）培养基中培养一周后，可观察到悬浮生长的神经球（图2A）。神经球的大小在50至200 µm之间。为了检测这些神经球是否来源于神经干细胞/前体细胞，将神经球接种于多聚赖氨酸（PLL）和层粘连蛋白（Laminin）包被的盖玻片上，在NSC培养基中培养2天，随后使用神经干细胞/前体细胞标志物Nestin进行免疫染色。培养2天可使神经球充分贴附于盖玻片并以单层细胞形式生长。免疫染色结果显示，该单层细胞表达Nestin（图2B）。为了检测神经球的多向分化潜能，按照第2节所述步骤，将神经球直接接种于PLL和Laminin包被的盖玻片上，置于分化培养基中培养7–10天，无需解离。分化过程至少需要一周时间。神经球贴壁后扩展形成单层细胞。固定细胞后，分别对神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物进行免疫染色。结果显示，贴壁的神经球可分化为β-Tubulin III阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞以及O4阳性的少突胶质细胞（图2C–E）...

初级纤毛在神经前体细胞增殖、神经元分化以及成年神经元功能中具有根本性的重要作用。本文中，我们描述了一种利用原代神经球培养体系研究神经干细胞/前体细胞及分化神经元中纤毛形成过程以及信号蛋白向纤毛转运的方法。

初级纤毛在胚胎发育期间神经干细胞/前体细胞的增殖以及神经元分化过程中具有根本性的重要作用，……

本实验的总体目标是利用基于神经球的培养方法，对原代神经干细胞和前体细胞进行培养，以研究初级纤毛的形成及其分子运输过程。该方法有助于回答初级纤毛领域中的关键科学问题，例如初级纤毛的生成以及纤毛相关分子向初级纤毛的转运过程，特别是在原代神经干细胞、神经前体细胞和神经元中的相关机制。该技术的主要优势在于，我们可以利用神经干细胞、神经前体细胞和神经元的原代细胞特征，在原纤毛的背景下分析其生物发生及纤毛相关通路。通常，初次接触该方法的研究者会面临一定困难，因为神经干细胞的培养对初学者而言在技术上具有挑战性。我们将对此方法进行示范，这十分关键，因为侧脑室的解剖、神经球的培养以及原纤毛的定量分析等关键步骤，通过观察示范可快速掌握。使用整体解剖法从成年小鼠侧脑室的室下区开始本实验操作。将含有室下区（SVZ）的组织置于一个1.5毫升离心管中。加入500 µL含0.05%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，在37°C水浴中孵育15分钟。孵育结束后，加入500微升终止培养基，使用1毫升枪头轻柔吹打20至30次。吹打过程中避免产生气泡。随后在500 × g离心8分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，加入1毫升PBS，使用1毫升枪头轻轻吹打5次重悬细胞。在500 × g离心8分钟。然后使用1毫升枪头吸去上清液，加入1毫升基础培养基。计数细胞后，将一个SVZ的细胞接种到含10毫升NSC培养基的10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。5至7天后可观察到神经球。如需通过免疫染色分析贴壁神经球中的细胞，可将含有多个神经球的1毫升培养基转移至1.5毫升离心管中，以500 × g离心8分钟。去除培养基后，用 4% 多聚甲醛固定类球体 15 分钟。去除多聚甲醛后，用 30% 蔗糖孵育类球体过夜。然后再次离心。用 PBS 洗涤。然后同前法离心，弃去上清液。接着，将移液枪配装剪去末端的 1 毫升枪头，加入 500 微升 OCT 溶液至神经球上。将含有神经球的OCT溶液转移至一次性塑料冷冻模具中。随后，将模具置于干冰上冷冻至少15分钟。使用冷冻切片机切片。为了在神经球中观察干细胞，需对干细胞标志物Nestin进行免疫染色。为了观察神经球中的初级纤毛，需对ARL13B进行免疫染色。在将贴壁培养的解离神经干细胞接种到经Poly-L-Lysine和Laminin包被的盖玻片上后的一至两天内开始本实验。将实验孔中的培养基更换为饥饿培养基，对照孔中更换为新鲜的NSC培养基，继续培养24小时。次日，在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟。固定后，在室温下用 PBS 洗涤两次，每次五分钟。然后按照标准方案进行免疫荧光染色。用封片液封固盖玻片。然后，将载玻片在室温避光条件下干燥过夜。次日，使用复式显微镜在所需放大倍数下采集图像。显微镜的相机和物镜应通过配套软件进行控制。以0.5至0.8微米的间隔采集足够的Z轴光学切片。对于贴壁细胞中纤毛定位的定量分析，通过观察DAPI通道选择三个到八个连续的、细胞融合良好的视野。从每个视野采集图像堆栈。使用 ImageJ 定量初级纤毛的数量。打开 Plugins Analyze 对话框，选择 Cell Counter 工具来计数具有 GPCR 阳性纤毛的细胞。为计数和导出目的，同一实验的所有图像应采用相似的图像强度和对比度参数。在NSC培养基或饥饿培养基中培养解离细胞24小时后，对细胞进行固定，并分别对GPR161（绿色）、ARL13B（红色）以及DNA（蓝色）进行免疫染色。左侧对照细胞和右侧饥饿处理细胞中均可见GPR161阳性的纤毛。如这些放大图像所示。白色箭头和箭头尖分别指示 GPR161 阳性和阴性的纤毛。该图像显示了 ARL13B 阳性纤毛细胞的定量结果。定量分析来自单次实验的两个技术重复，每个重复选取两个视野进行。饥饿处理后，ARL13B阳性纤毛细胞的比例增加。该图像显示了对照组和饥饿处理组细胞中定位于ARL13B阳性纤毛的GPR161的定量结果。饥饿处理后，定位于ARL13B阳性纤毛中的GPR161比例也有所增加。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在完成此操作后，可进一步采用另一种培养原发性肿瘤来源细胞的方法，以探究纤毛在肿瘤发生中的作用等其他科学问题。该技术建立后，为原发性纤毛领域的研究人员探索基于原代神经球系统的纤毛生成及运输机制开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分析源自神经球培养体系的神经干细胞、神经前体细胞及神经元中的初级纤毛。

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用主神经球文化研究纤毛

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

本文介绍了一种从高密度接种的神经元中自发生成富含神经前体细胞的神经球的实验方案。在同一实验中，当神经元以较低密度接种时，该方案还可实现原代大鼠神经元的长期培养。...

从E14-E16天Sprague Dawley大鼠胚胎分离的原代海马和皮层神经元混合培养中生成神经球

尽可能充分地在体外实验中模拟体内条件并非易事。使用原代细胞培养是理解完整生物体中细胞生物学的重要一步。本方案详细介绍了如何成功培养和培育小鼠胚胎小脑神经元。...

从小鼠胚胎小脑分离神经元的原代培养

初级纤毛是与中心粒相关的胞外结构。通过免疫荧光染色检测初级纤毛是一种相对简单的实验方法，可获得极高分辨率的图像。本实验方案中，表达初级纤毛的成纤维细胞经固定、免疫染色后，使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。...

初级纤毛的免疫荧光简易检测方法

与常用方法相比，利用人工智能（Ai）分析图像正成为一种更强大、更少偏倚且更快速的方法。本文中，我们训练人工智能识别一种细胞器——初级纤毛，并以严谨且可重复的方式分析其长度和染色强度等特性。...

评估初级纤毛的人工智能方法

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

此处，我们展示一种可重复的 体外...

一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。...

从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

该方法描述了利用ARL13B-CENTRIN-2转基因小鼠模型中的内源性信号对初级纤毛进行成像的技术 原位，可在大范围矿化组织中从组织采集到纤毛排列的分析，进行三维观察。该方案也可应用于其他类型的组织。...

利用ARL13B-CENTRIN-2小鼠模型对肌肉骨骼组织中初级纤毛的三维成像与分析

的 离体 直立液滴培养是现有方法的一种替代方案 体外 和 体内 实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。...

使用 离体 直立式液滴培养法培养小鼠胎儿完整器官以研究器官发生过程中的发育机制

学习利用主神经球培养技术研究神经干细胞和祖细胞中的初级纤毛发生与信号蛋白运输。该方法为理解纤毛在神经发育中的功能提供了重要的实验基础。

利用原代神经球培养物研究初级纤毛

探索更多视频