利用原代神经球培养物研究初级纤毛

本实验的总体目标是利用基于神经球的培养方法，对原代神经干细胞和祖细胞进行培养，以研究初级纤毛的生成及其分子运输过程。该方法有助于回答初级纤毛领域中的关键科学问题，例如初级纤毛的形成，以及纤毛相关分子向初级纤毛的转运过程，特别是在原代神经干细胞、神经祖细胞和神经元中的相关机制。

该技术的主要优势在于，我们可以利用神经干细胞、神经前体细胞和神经元的原代细胞特征，在初级纤毛的背景下分析其生物发生及纤毛相关通路。通常，初次接触该方法的研究者会面临一定困难，因为神经干细胞的培养对初学者而言在技术上具有挑战性。我们将通过演示展示该方法的关键步骤，因为侧脑室的解剖、神经球的培养以及初级纤毛的定量分析等操作，通过观察关键步骤可较为容易地掌握。

使用整体解剖法从成年小鼠侧脑室的室下区开始本实验操作。将含有室下区（SVZ）的组织置于一个1.5毫升离心管中。加入500微升含0.05%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，在37摄氏度水浴中孵育15分钟。

孵育结束后，加入500 µL终止培养基，使用1 mL枪头轻柔吹打20至30次。吹打过程中避免产生气泡。随后，以500 ×g离心8分钟，沉淀细胞。

弃去上清液，然后加入1毫升PBS，使用1毫升枪头轻轻吹打5次重悬细胞。在500 × g离心8分钟。然后使用1毫升枪头吸去培养基，并加入1毫升基础培养基。

计数细胞后，将一个SVZ的细胞接种到含10毫升NSC培养基的10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。5至7天后可观察到神经球。若需通过免疫染色分析贴壁神经球中的细胞，取含有多个神经球的1毫升培养基转移至1.5毫升离心管中，以500 × g离心8分钟。

去除培养基后，用 4% 多聚甲醛固定类球体 15 分钟。去除多聚甲醛后，将类球体与 30% 蔗糖在 4°C 过夜孵育。然后再次离心。

用PBS洗涤。然后，同前法进行离心，移除并弃去上清液。接着，将移液枪配装剪去末端的1毫升枪头，加入500微升OCT溶液至神经球中。

将含有神经球的OCT溶液转移至一次性塑料冷冻模具中，然后将模具置于干冰上冷冻至少15分钟，再使用冷冻切片机切片。

为了在神经球中可视化干细胞，需对干细胞标志物Nestin进行免疫染色。为了可视化神经球中的初级纤毛，需对ARL13B进行免疫染色。在将贴壁培养的解离神经干细胞接种到聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上后的一至两天开始本实验。

将实验孔中的培养基更换为饥饿培养基，对照孔中更换为新鲜的NSC培养基，继续培养24小时。次日，用4%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定细胞15分钟。

固定后，在室温下用 PBS 洗涤两次，每次五分钟。然后按照标准方案进行免疫荧光染色。用封片液封片。

然后，在避光条件下于室温下将载玻片干燥过夜。次日，使用复式显微镜在所需放大倍数下采集图像。显微镜的相机和物镜应通过配套软件进行控制。

以 0.5 至 0.8 微米的间隔采集足够的 z 轴断层图像。对于贴壁细胞中纤毛定位的定量分析，通过观察 DAPI 通道选择三个至八个具有融合细胞的连续视野。从每个视野采集图像堆栈。

使用 ImageJ 定量初级纤毛的数量。打开 Plugins Analyze 对话框，选择 Cell Counter 工具来计数具有 GPCR 阳性纤毛的细胞。为计数和导出目的，对同一实验中的所有图像使用相似的图像强度和对比度参数。

在NSC培养基或饥饿培养基中培养解离细胞24小时后，对细胞进行固定，并分别对GPR161（绿色显示）、ARL13B（红色显示）以及DNA（蓝色显示）进行免疫染色。左侧对照组细胞和右侧饥饿处理细胞中均可见GPR161阳性的纤毛。如这些放大图像所示。

白色箭头和箭头指示分别为 GPR161 阳性和阴性的纤毛。该图像显示了 ARL13B 阳性纤毛细胞的定量结果。定量分析来自单次实验的两个技术重复，每个重复取两个视野进行。

在饥饿条件下，ARL13B阳性纤毛细胞的比例增加。该图像显示了对照组和饥饿处理细胞中GPR161定位于ARL13B阳性纤毛的定量结果。GPR161定位于ARL13B阳性纤毛中的比例在饥饿条件下也增加。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在完成此操作后，可进一步采用另一种培养原发性肿瘤来源细胞的方法，以探究纤毛在肿瘤发生中的作用等其他科学问题。该技术的建立，为原发性纤毛领域的研究人员探索基于原代神经球系统的纤毛生成及运输机制铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何分析源自神经球培养体系的神经干细胞、神经前体细胞及神经元中的初级纤毛。