Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

该方法的总体目标是稳健、一致地生成任何大小的工程血管。该技术允许可靠和有效地设计血管。这种技术的主要优点是可以轻松可靠地制造任何尺寸的容器。

当我们讨论如何设计一管组织时，我们第一次有了这种方法的想法，并将我们的方法比作建造公路隧道，一次一段。要制备 3D 打印嵌件，首先在 35、60 或 100 毫米培养皿的底部分别添加一层 2 mL、4 mL 或 6 mL 的未固化硅胶薄层。要为 35 毫米板创建柱子，请将 PDMS 倒入不同的 100 毫米板中，高度为 7 毫米，然后在 60 摄氏度的加热板上加热 PDMS 两到三个小时。

当 PDMS 固化后，使用 5 毫米的活检打孔器创建圆柱形柱子。使用少量未固化的 PDMS 将圆柱体固定到每个 35 mm 板的中心。将直径约为 66.7 毫米的 3D 打印外壳与柱子等距放置在 100 毫米板中。

在 60 毫米和 100 毫米板底部的 PDMS 固化之前，将直径为 10 毫米和 20 毫米的 3D 打印柱分别放入每个 60 毫米和 100 毫米板的中心。让餐具在 60 摄氏度的加热板上露天固化 2 到 3 小时，然后进行 18 小时的聚合物脱气。脱气结束时，用 70% 乙醇对所有板的内部进行消毒，并覆盖每个板 30 分钟。

然后小心地从每个板中吸出乙醇，使其风干。当板干燥后，将它们转移到相应的正面朝上盖子旁边的生物安全柜中。并将材料暴露在紫外线下 30 分钟以完成灭菌。

要制备纤维蛋白水凝胶，首先将 0.5、1.1 和 1.81 mL 补充有纤维蛋白凝胶和 TGF β 1 的生长培养基分别添加到 35、60 和 100 mm 培养皿中。接下来，分别向 35、60 和 100 mm 板中加入 40 、 88.4 和 145 微升凝血酶，然后用手轻轻旋转每个板。当凝血酶均匀分布时，以逐滴圆周运动向 35、60 和 100 mm 板中的凝血酶培养基混合物中分别加入 160、354 和 580 微升纤维蛋白原，并轻轻旋转板以均匀分布水凝胶。

让水凝胶在室温下固化 10 到 15 分钟。然后用胰蛋白酶消化感兴趣的平滑肌细胞，在 150 mm 细胞培养板中扩增，并通过离心收集分离的细胞。将沉淀重悬于 3 ml 分化培养基中，并使用 2 mL 移液器大力研磨细胞以打碎任何细胞团块。

计数后，将细胞分成 2/10 10 至第 6 个、1/10 第 7 个和 1.4 x 10 至第 7 个细胞/mL 等分试样，装在 50 ml 锥形管中，根据相应的培养板标记。向每个试管中加入分化培养基，每个 35、60 和 100 mm 板的最终接种体积分别为 2、4 和 5 mL然后，小心地将细胞溶液逐滴添加到每个相应板中制备好的水凝胶上，以便在细胞培养箱中扩增。两到四天后，光环将完全收缩到它们的柱子上。

因此，分别向每个 35、60 和 100 mm 环中加入 10、20 或 35 mL 的 TGF Beta 1。为了组装 35 mm 容器的血管结构，从 50 mL 聚碳酸酯锥形管的顶部切下 2 英寸的截面，然后 PDMS 将顶部边缘粘合到 35 mm 的板中，以形成用于环堆叠的高板。对于 60 和 100 mm 的容器高环形堆叠板，将直径为 1.75 英寸的聚碳酸酯管纵向切割成 2.5 英寸的截面，用作高板壁。

对于高板底部，将 0.125 英寸厚的聚碳酸酯板切成直径为 2 英寸的圆块。使用丙烯酸溶剂水泥将聚碳酸酯管部分粘合到圆形切割件上。3D 打印直径为 5 毫米、10 毫米和 20 毫米、长度为 50 毫米的柱子。

然后向每个容器中加入 10 mL 未固化的硅胶，在 PDMS 完全固化之前，将每个 3D 打印的柱子集中放入每个 35、60 和 100 毫米的容器中。并将盘子放在 60 摄氏度的热板上 2 到 3 小时。当 PDMS 固化后，如前所述，用 70% 乙醇对板进行消毒，然后将干燥的乙醇灭菌容器暴露在紫外线下 30 分钟。

现在，使用两对非常细的镊子小心地将紧卷的平滑肌水凝胶环的一侧，然后是另一侧，从其柱子上提起。然后小心地将环的一侧滑动，然后将另一侧滑到相应的下一个尺寸较大容器的高柱上。沿圆周工作，轻轻地逐渐移动，慢慢地将环推下柱，然后堆叠额外的组织环，直到获得所需的血管长度。

当所有环都堆叠好后，转动板，使柱子与工作表面平行，然后分别向每个 35、60 和 100 毫米容器的外表面轻轻添加 40、80 和 160 微升凝血酶，同时缓慢旋转板。接下来，在每个 35、60 和 100 mm 构建体中分别添加 40、80 和 160 微升纤维蛋白原，同时快速均匀地旋转构建体。凝血酶和纤维蛋白原在混合后会迅速凝固成坚硬的凝胶。

然后向每个构建容器中加入 20 mL 分化培养基，并将容器放入 37 摄氏度的培养箱中，直到需要。组织学分析显示，所有环状大小均具有高细胞结构，在小环的外边缘观察到少量残留的纤维蛋白凝胶。在较大的环中，一些纤维蛋白凝胶散布在细胞内容物中，在中间环和大环中都有明显的胶原蛋白产生的迹象。

α 平滑肌肌动蛋白和原肌球蛋白表达的组织环分析显示，两种抗体的所有环大小均呈阳性，验证平滑肌表型得以维持。拉伸试验表明，在所有三种尺寸的环中，强度增加的趋势与环和容器尺寸的增加相关。用于创建各种环大小的细胞接种编号也与接种表面积相关。

这些容器结构还能够以每分钟 100 至 417 ml 的流速承受长达 5 分钟的流动，并且在容器连接到富集系统的地方仅观察到轻微的泄漏。一旦掌握了，如果技术正确，可以在一小时内设计出戒指。在尝试此过程时，请务必记住彻底混合 Hydrogel 组分，以确保凝胶凝固和正确的环形成。

按照此程序，可以执行其他方法，例如创建其他细胞类型的环，以工程化其他类型的组织。看完这个视频后，您应该对如何使用环堆叠法来设计各种大小的血管组织有很好的了解。