Name: 泄殖腔按摩与精子 DNA 分离法采集禽精 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习使用泄殖腔按摩法采集雄禽精液，并通过改良商业试剂盒提取高质量精子DNA。该方法操作简便、无创温和，适用于野外及实验室环境，可支持鸟类行为生态学、精子竞争及表观遗传学研究。

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感谢 Jose Noguera 在泄殖腔按摩技术方面的早期协助，以及 Jeffrey Kittilson 提供的实验室支持。本研究工作由 ND EPSCoR 授予 BJH 的 FAR0022429 项目资助。论文发表费用由北达科他州立大学生物科学系慷慨支持。

本方案涉及脊椎动物实验对象，并已获得北达科他州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 利用泄殖腔按摩法从雀形目鸟类采集精液
注意：泄殖腔按摩仅对具有生殖活性的鸟类是一种有效的精液采集技术，但在适当的圈养条件下，也可在繁殖季节之外成功实施。在使用泄殖腔按摩技术前，应先确定目标物种的生殖活动状态。该技术可用于捕获后的野生鸟类，也可用于圈养鸟类。
<ol>
	<li>以雄鸟（处于繁殖状态）开始，用非惯用手以持鸟手法握住，然后将其转移到惯用手，使鸟的腹侧接触掌心（图1）。
	<ol>
		<li>确保鸟的头部靠近掌心的外侧边缘，用小指、无名指和中指轻轻固定头部和身体，使鸟的泄殖腔和尾部暴露出来。</li>
		<li>鸟的双腿可保持松散或用掌心轻微固定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="鸟类环志过程，手持鸟类，野外研究，野生动物保护研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：泄殖腔按摩操作手法。 用惯用手轻轻握住鸟类，使其腹面贴住掌心，小指固定头部。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>用优势手的食指和拇指分别置于泄殖腔上端两侧，轻轻捏合手指，同时向尾部施加轻微压力（图2）。泄殖腔将外翻，露出泄殖腔黏膜（粉红色内壁）。 
	​注意：若鸟类当前未产生精液，泄殖腔突起可能较小，泄殖腔不易外翻。随着经验积累，可轻易区分生殖活跃期与非活跃期雄性个体的泄殖腔形态5,11。</li>
</ol>
<img alt="鸟类血液样本采集方法；野外数据采集示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：手指位置与泄殖腔突起。 通过对手指上方末端施加轻微压力使泄殖腔外翻（A）。在生殖活跃期的雄性鸣禽中，泄殖腔突起明显且坚实（B）。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>用非优势手将食指指腹置于尾部基部背侧以固定手部，然后将拇指指尖置于外翻泄殖腔下方。 
	注意：短而光滑的指甲有利于进行泄殖腔按摩，并可防止鸟类意外受伤。</li>
	<li>用非优势手的拇指在泄殖腔下方施加中等压力，反复向深部和头侧方向移动。持续操作直至鸟类射精。根据个体差异，通常需要1次至数十次按摩动作。</li>
	<li>一旦鸟类射精，立即用微量血细胞比容管收集精液。可重复泄殖腔按摩以获取多次射精样本。 
	​注意：鸣禽精液呈浅棕色，通常具有一定的黏稠度。从泄殖腔排出的白色或深色物质并非精液，可能污染精液样本。泄殖腔或精液中出现少量血液通常是由按摩时压力过大所致。</li>
	<li>用于DNA提取时，将精液放入含20 µL 1×PBS（pH 7.4）的微量离心管中。注意：保存在1×PBS中的精液不适合人工授精，但若储存于-80 °C条件下，可用于日后DNA提取。PBS可为室温或预冷状态，但在加入精液样本时应保持液态。
	<ol>
		<li>取少量稀释后的样本在复式显微镜下观察，以确认样本中存在精子（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将稀释后的精液储存于-80 °C直至进行提取。</li>
</ol>
2. 从鸟类精液中提取DNA
注意：本实验方案已使用多种商业化的DNA提取试剂盒进行测试，但仅在使用某一种DNA试剂盒时获得成功12。相对于试剂盒说明书所修改的步骤以 * 标注。
<ol>
	<li>配制1 M的二硫苏糖醇（DTT）水溶液，并用涡旋振荡器混匀。*
	<ol>
		<li>分装DTT溶液，并于-20℃保存20 °C 直至使用前立即取出。每个待提取的样本均需 10 µL 1 M DTT 溶液的</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含有 20 mM Tris-Cl，pH 8.0；20 mM EDTA；200 mM NaCl；以及 4% SDS 的缓冲液。每个待提取的样品均需 90 µL 此缓冲液。*
	<ol>
		<li>将缓冲液置于室温保存。若出现沉淀，可将其升温至 56 °C 以溶解。*</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有摇床或振荡器的培养箱预热至 65 °C.*</li>
	<li>开始提取前立即混合 10 µL DTT 溶液与 90 µL 步骤2.2中制备的缓冲液，每份待提取样品需加入 例如 900 µL 缓冲液加 100 µL 若提取10个样本，则使用DTT溶液。该混合液称为DTT缓冲液。*</li>
	<li>添加 70 µL 用涡旋振荡器将1x PBS与全部稀释后的精液样本充分混匀。*</li>
	<li>添加 100 µL DTT缓冲液和 10 µL 向样品中加入蛋白酶K溶液。涡旋振荡20秒，然后在预热的培养箱中于摇床或振荡器上孵育1小时。*</li>
	<li>添加 200 µL 缓冲液 AL 和 200 µL 新鲜乙醇（100%）涡旋20秒。*</li>
	<li>将全部样品转移至离心柱中，6,000 x g 离心1分钟。弃去收集管。</li>
	<li>将柱子置于新的离心管上并加入 500 µL 加入缓冲液 AW1，6,000 × g 离心 1 分钟。弃去收集管。</li>
	<li>将柱子置于新离心管上并加入 500 µL 加入缓冲液AW2。在6,000 × g条件下离心1分钟。弃去穿流液，将吸附柱重新放回收集管中。</li>
	<li>离心3分钟，20,000 × g。弃去收集管，将柱置于1.5 mL 微量离心管上。</li>
	<li>移液器 35 µL 将AE缓冲液直接加入到离心柱膜上，在室温下孵育5分钟。*</li>
	<li>离心1分钟，14,000 × g。弃去离心柱，将提取的样品储存于 -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
<li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347296904236">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li>
<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

我们介绍一种简单且可靠的方法，用于采集处于繁殖活跃状态的小型和中型鸟类的精液，并从禽类精子中提取DNA。
所述精液DNA提取方案在试剂盒方法基础上进行了简化，但针对鸟类精液进行了优化。精子对标准提取试剂具有较强的抗裂解性9,13，且从雀形目鸟类采集的精液样本量通常较小（一般仅为几微升）。这些因素带来的挑战可通过使用适当浓度的DTT并在65 °C下孵育得以有效克服。采用该方法，我们 consistently 获得了可用于qPCR分析精子端粒长度的DNA量（通常为40 - 250 ng/µL，具体取决于射精体积）。
二硫苏糖醇（DTT）此前已被用于结合苯酚/氯仿反应从鸟类精子中提取DNA13。苯酚/氯仿反应在分离DNA方面效果良好，但耗时较长、危险性较高，且需要在通风橱中操作。本提取方案的一个显著局限性在于，其成功仅限于使用某一特定品牌和类型的提取试剂盒，这可能与起始...

鸟类是研究精子质量与竞争1、精子端粒动态2、表观遗传学3以及类似课题的理想对象，因其在生物学研究中被广泛应用，且可通过泄殖腔按摩法轻松采集精子。泄殖腔按摩是一种温和、非侵入性的手动采精技术4,5,6。该方法易于获取重复样本，且无需特殊工具，适合在野外或实验室中操作。尽管泄殖腔按摩已使用数十年，但仅凭现有的文字描述难以掌握。本出版物旨在缩短学习该技术所需的时间并减少学习过程中的不确定性。
通过泄殖腔按摩法采集的鸟类精液可立即用于活力评估4,7或人工授精8，也可冷冻保存以用于其他用途，如高级成像和DNA提取。雀形目鸟类的精液样本量较少，但含有高度密集的精子。为简化操作，可使用商业DNA提取试剂盒提取DNA，并对操作步骤进行适当修改，以克服精子特有的保护结构9。提取DNA后，可采用qPCR技术测定精子端粒长度10。

<table><tbody><tr><td>微量血细胞比容毛细管</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>可使用任意供应商的产品。对于采集少量精液样本（例如来自体型非常小的雀形目鸟类，如树雀鹀）而言，较小的毛细管可能更为有效。</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>任意</td><td></td><td>用于DNA提取前精液样本的储存。</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>可使用任意供应商的产品。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>可使用任意供应商的产品。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>可使用任意供应商的产品。</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>可使用任意供应商的产品。</td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>特别推荐使用Qiagen公司的QIAamp DNA micro试剂盒。本DNA提取方案曾尝试使用其他商业试剂盒，但效果不佳。具体原因尚不明确。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过泄殖腔按摩法采集禽类精液及精子dna的提取

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

精液采集在多种研究中具有重要用途，包括涉及精子质量、精子端粒动态以及表观遗传学的研究。鸟类被广泛用于生物学研究，是进行重复精子取样研究的理想对象。然而，目前可供希望学习如何采集鸟类精子并从中提取DNA的研究人员参考的资源十分有限。本文介绍了泄殖腔按摩法，这是一种温和、非侵入性的手动技术，用于采集鸟类精子。尽管该技术在文献中已有记载，但仅凭现有描述往往难以掌握。我们还提供了使用商业化试剂盒并结合改进步骤从鸟类精液中提取DNA的具体方法。泄殖腔按摩法可便捷地应用于任何处于繁殖状态的小型至中型雄性鸟类。采集后的精液可立即用于精子活力检测，或按照本文所述方案冷冻保存以备后续DNA提取。本DNA提取流程针对鸟类精子进行了优化，已成功应用于多种雀形目鸟类（Passer domesticus、Spizella passerina、Haemorhous mexicanus 和 Turdus migratorius）以及一种鸠鸽科鸟类（Columba livia）的样本。

采用所述方案，已对多种雀形目鸟类及一种鸠鸽科鸟类进行泄殖腔按摩取精及DNA提取（表1）。通过泄殖腔按摩采集的精液样本中是否存在精子，已使用复合显微镜在400倍放大倍率下观察少量稀释样本予以确认（图3）。按照本文所述方案从家麻雀精液样本中提取DNA后，将八个样本与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳分析（图4中可见三个样本）。在全部八个样本的泳道中均观察到清晰条带且无拖尾现象，表明成功分离出高质量DNA。使用该方案提取的其余所有样本均采用分光光度计测定DNA浓度（见表1）。
<img alt="真菌菌丝的显微镜分析；左侧：用于分离的针尖位置；右侧：菌丝网络。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig...

本方案描述了泄殖腔按摩技术，这是一种用于采集鸟类精液的非侵入性手动方法，以及利用商业试剂盒并加以改进从鸟类精子中提取DNA的技术。

通过泄殖腔按摩法采集禽类精液及精子DNA的提取

精液采集可用于多种应用，包括涉及精子质量、精子端粒动态以及表观遗传学的研究。

本实验的总体目标是从雄性鸟类中采集精液，并从精液样本中分离DNA。该方法可用于解答行为生态学和进化生态学领域中有关精子竞争和表观遗传继承的关键问题。该技术的主要优势在于操作简便。泄殖腔按摩可在野外或实验室中快速完成，DNA提取方法采用市售试剂盒并进行了改良。该技术可在繁殖季节用于野生或圈养鸟类，在某些圈养条件下亦可全年有效。用非惯用手以持鸟手法抓住处于生殖活跃期的雄鸟。然后将其转移到惯用手，腹侧贴着手掌，头部位于手掌的外侧边缘。现在用小指、无名指和中指轻轻固定头部和身体，使鸟类的泄殖腔和尾部暴露出来。可将鸟腿保持松散状态，或用手掌轻轻固定。接下来，用惯用手的食指和拇指分别置于泄殖腔上端两侧，轻轻捏住并向尾部方向施加轻微压力，使泄殖腔外翻。此时应清晰可见粉红色的泄殖腔黏膜，除非该鸟未产生精液。随着经验的积累，很容易区分生殖活跃期与非活跃期雄性的泄殖腔。采集精液时，将非惯用手的食指指腹置于尾基部背面以保持稳定，然后将拇指尖放在外翻的泄殖腔下方。强烈建议保持短而平滑的拇指甲。然后以中等压力反复向深部和头侧方向移动拇指，保持在泄殖腔下方，直至鸟类射精。此过程可能需要一次推压，也可能需要数十次推压。一旦鸟类射精，立即用微量压积管收集黏稠的浅棕色精液。白色或深色物质为污染物，而任何量的血液均表明施加压力过大。必要时，可重复按摩以获取多个射精样本。用于DNA提取时，将样本转移至含有20微升PBS的微量离心管中。为确认样本中存在精子，取少量稀释后的样本在400倍放大倍数的复式显微镜下观察。随后将精子样本于-80°C保存，直至需要使用。本方案是对商用试剂盒的改良。已准备好1 mol/L DTT的水溶液，分装成10 µL每份，于-20 °C保存。在开始DNA提取前，为每个样品取一份DTT与一份Tris氯化物混合。然后向每个样品中加入70 µL PBS，并涡旋振荡混合物。然后向每个样品中加入一份DTT缓冲液混合物和10 µL蛋白酶K溶液。为混匀样品，涡旋振荡20秒。随后将样品置于65 °C摇床培养箱中，于温和振荡条件下孵育1小时。孵育后，向每个样本中加入 200 微升缓冲液 AL 和 200 微升新鲜的 100% 乙醇，涡旋振荡样本 20 秒。然后将每个样本转移至离心柱中，在 6,000 ×g 条件下离心 1 分钟。弃去收集管，将离心柱置于新的收集管上。向柱中加入 500 微升 AW1 缓冲液，再次离心柱子。再次弃去收集管，并将柱子放入新的收集管中。现在加入 500 微升 AW2 缓冲液，并重复离心步骤。接下来弃去穿流液，将离心柱重新放回离心机中，在20,000G条件下离心3分钟。然后弃去收集管，将离心柱置于一个微量离心管上。现在直接向离心柱的膜中央加入35 µL的AE缓冲液，并在室温下静置5分钟，使溶液洗脱DNA。然后使用60秒离心，将含有DNA的洗脱缓冲液转移至微量离心管中。

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