一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

HS-MRM 检测方法的总体目标是通过将肽段前体的离子淌度分离与碎片离子的高分辨质谱检测相结合，减少影响肽段或蛋白质定量的 MRM 干扰现象。该方法有助于回答生物治疗药物表征领域以及蛋白质或肽类生物标志物定量和定量蛋白质组学中的关键问题。该技术的主要优势在于能够检测生物制药蛋白中可能存在的低丰度宿主细胞蛋白。

首先，在数据采集软件中点击“创建分析方法”，选择“生成并采集和处理方法”。输入方法名称和描述，浏览至方法文件夹，然后点击下一步。对于分析类型，选择肽图谱离子迁移谱（peptide map IMS），然后点击下一步。

然后选择当前系统配置，单击下一步和完成。在新创建的方法中，点击仪器选项卡，选择二元溶剂管理器，并编辑梯度设置，以实现肽段在0.2毫升/分钟流速下的分离。采用在30分钟内溶剂B从1%线性梯度稀释至40%的程序，随后进行2分钟的柱清洗和10分钟的平衡，总运行时间为45分钟。

接下来，选择样品管理器，将样品温度设置为 10 摄氏度，柱温设置为 60 摄氏度。在仪器选项卡中，选择 Vion IMS QTof 仪器。在设置部分，选择分析模式为灵敏度模式，并输入毛细管电压为 3 千伏，源温度为 100 摄氏度，脱溶剂温度为 250 摄氏度，锥孔气体流速为 50 升/小时，脱溶剂气体流速为 500 升/小时。

单击实验选项卡，并在模式中选择高分辨率 MSE。然后在低质量数中输入 100，高质量数中输入 2000，扫描时间输入 0.4 秒。在碰撞能量部分，低能量设置输入 6 电子伏特，高能量梯度选择从 15 到 40 电子伏特。

对于采集时间，使用5至30分钟之间的自定义运行时间。接下来，点击“选项”标签，选择自动锁场校正模式，并将自动锁场校正间隔设为5分钟。然后选择“继续进行锁场校正”选项，并确保自动检测器检查功能已关闭。

在当前系统配置菜单中，选择 Vion IMS QTof 仪器并点击工具。将毛细管电压设为 3 千伏，采样锥电压设为 40 伏，源偏移电压设为 100 伏，源温度设为 100 摄氏度，脱溶剂温度设为 250 摄氏度，锥孔气体流速设为 50 升/小时，脱溶剂气体流速设为 500 升/小时，参考毛细管电压设为 3 千伏。使用上述刚刚描述的 LC-HDMSE 检测方法，将 10 微升已制备好的 10 纳摩尔假加标样品注入仪器进行分析。

此处列出了假肽混合物中包含的六种磷酸化酶B肽段标准品的各自序列，以及它们在HDMSE实验中观察到的保留时间和最丰富的前体离子。此处还展示了在英夫利昔单抗酶解产物中添加的一种假肽所获得的HDMSE谱图。在数据采集软件中，单击创建分析方法，然后选择生成并采集和处理方法。

输入方法名称和描述，浏览至方法文件夹，然后单击下一步。在分析类型中，选择“定量”，选中“Quantify Assay Tof 2D Chromatographic”并单击下一步。然后选择当前系统配置，单击下一步，最后完成。

在新创建的方法中，点击“仪器”选项卡。选择二元溶剂管理器，并编辑梯度设置，以实现肽段在0.2毫升/分钟流速下的分离。采用梯度洗脱，30分钟内溶剂B从1%升至40%，随后进行2分钟的色谱柱清洗，再用10分钟平衡，总运行时间为45分钟。

在仪器选项卡中，选择样品管理器，并将样品温度设置为 10 摄氏度，柱温设置为 60 摄氏度。然后选择 Vion IMS QTof 仪器，在设置部分选择分析模式为灵敏度模式。接着输入毛细管电压为 3 千伏，源温度为 100 摄氏度，脱溶剂温度为 250 摄氏度，锥孔气体流速为 50 升/小时，脱溶剂气体流速为 500 升/小时。

单击实验选项卡，在实验类型中选择一个或多个用于函数表的 MS、MSMS 或 MRM 函数。删除默认的采集函数，单击添加加号 MRM，然后在运行时间部分编辑保留时间窗口参数。在 Tof MRM 函数编辑器中，输入肽段前体母离子的质荷比，为前体分辨率选择“低”，并输入前体电荷态。

然后输入产物母离子电荷比为16电子伏特作为起始碰撞能量，固定扫描时间为0.1秒，谱图模式选择宽（wide）。使用复制按钮，再添加10个MRM跃迁，并在18至36电子伏特范围内使用不同的碰撞能量值。在确定每种肽段的三个最佳跃迁后，进行Tof MRM实验，以寻找能够使每种肽段产生的信号最强的最优碰撞能量。

接下来，建立一个每种肽仅包含一个碎片离子的HS-MRM方法。通过选择HS-MRM功能替代先前创建的Tof MRM功能，来修改已建立的Tof MRM方法。在HS-MRM功能编辑器中，输入母离子电荷比，选择“低”作为前体离子分辨率，并输入前体离子电荷态。

然后输入前体离子的碰撞截面积（CCS）值，并选择前体离子CCS分辨率为低。对于产物离子，输入其母体质荷比，选择最佳碰撞能量，设定扫描时间为0.4秒，并选择宽谱模式以包含其所有同位素。最终的HS-MRM检测方法为每种肽段保留唯一的最佳跃迁通道，并用于分析所有加标样品。

在为HS-MRM数据采集方法创建的分析方法中，单击目的选项卡并选择管理组分。在实验类型下拉菜单中，选择HS MSMS/HS MRM选项。单击创建，输入组分名称、预期保留时间、提取时间窗口以及前体母离子电荷比。

选择XIC提取模式并输入预期的CCS值。对于碎片离子，输入其电荷态和主电荷比。然后输入HS-MRM检测所监测的所有肽段组分。

在相同 HS-MRM 采集方法的目的选项卡中，单击默认量，然后为所有模拟肽组分分别输入 0.1、1、10 和 100 纳摩尔。输入第一个数值后，右键单击并选择向下填充选项，以将相同浓度应用于所有组分。对校准曲线的全部四个浓度重复相同操作。

现在切换到处理选项卡，然后点击提取设置。在质量容差中输入 10 PPM。接着点击 CCS 漂移时间容差，并在 CCS 容差中输入 5%。

在处理选项卡中，选择峰处理设置。在平滑部分，选择“均值”作为平滑算法，半宽设为1，迭代次数设为1。在积分部分，确保勾选自动峰宽和自动检测选项。

接下来，在处理选项卡中选择目标筛查设置，并在保留时间窗口中选择最接近室温（RT）的选项。然后输入 0.2 分钟作为保留时间容差。选择定量设置，在校准菜单中，选择线性作为校准曲线拟合类型，选择“1/x²”作为权重类型，选择浓度作为组分值类型，选择毫摩尔每升（millimoles per liter）作为组分值单位，选择“无”作为校准点计算的平均方式。

在“量化”菜单中，选择“面积”作为响应值。此处展示了针对所有浓度下模拟肽段生成的高灵敏度 MRM 色谱图示例。此处还展示了对每个肽段的高灵敏度 MRM 峰进行积分后得到的校准曲线。

基于四次重复进样的峰面积相对标准偏差总结如下。由于高选择性 MRM 检测方法结合了离子淌度前体离子分离和靶向高分辨质谱检测，因此在对多批生物制药中的多种宿主细胞蛋白进行快速、高通量监测方面具有巨大潜力。观看本视频后，您应能够充分理解如何在 Vion IMS QTof 仪器上建立高选择性 MRM 检测方法。