Name: 在荧光蛋白融合的一代念珠菌物种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解利用PCR介导基因修饰在Candida物种中生成荧光蛋白融合的方法。该技术通过标记蛋白编码序列实现稳定整合，便于酵母细胞和蛋白的鉴定与定量分析。

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感谢 N. Dean 提供原始的 mCherry 荧光蛋白序列，M. Gerami-Nejad 提供质粒构建，B. Larson 提供技术协助，以及 T. Heisel 在本项目开发过程中提供的有益建议。J.B. 的研究得到了欧洲研究委员会高级奖 340087（RAPLODAPT）的支持。显微镜和成像系统由明尼苏达大学儿科基金会和明尼苏达大学成像中心提供。

1. 从模板质粒中分离 E. coli
<ol>
	<li>在37 °C、振荡条件下，将含有模板质粒的 E. coli 在10 ml LB培养基（含200 mg/L氨苄青霉素，AMP）中过夜培养。</li>
	<li>以6,000 × g离心2分钟，收集菌体。</li>
	<li>弃去上清液，按照Ausubel et al.8 中所述的标准方法从 E. coli 细胞中分离并纯化DNA。</li>
	<li>将DNA重悬于TE缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA，pH 8.0）中，工作浓度为50–100 ng/µl。</li>
</ol>
2. 设计引物

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="0.5in" style="width:50px">引物</td>
			<td>引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1</td>
			<td>5' GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG 
			GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R1</td>
			<td>5' GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC 
			GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>5' GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG 
			GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>5' GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC 
			ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的引物序列。 加粗斜体文本表示与ENO1基因组位点具有同源性，常规字体区域则与质粒DNA具有同源性。
<ol>
	<li>设计引物，使其与待扩增的盒式元件两侧的质粒序列同源，同时与目的基因（例如 ENO1）的3'端同源，以促进该盒式元件重组至基因组位点（图2 和 表1）。
	<ol>
		<li>确保正向引物序列包含目的基因最后70个碱基对（bp），方向为5'-3'，不包含终止密码子，以维持编码框的连续性，同时包含待扩增质粒序列的前约30 bp。需注意，每个引物中的GGTGGTGGTT为一段多甘氨酸连接子，与荧光蛋白（FP）无同源性。值得注意的是，若无此连接子，功能结构域可能直接融合，理论上可能导致蛋白质错误折叠、蛋白表达产量降低或生物活性受损。</li>
		<li>确保反向引物序列包含基因下游紧邻的70 bp序列（方向为3'-5'），不包含任何基因本身的序列，同时包含质粒中所用营养标记或药物抗性标记的最后约30 bp序列。</li>
		<li>使用F1和R1分别以pMG2120和pMG2263为模板扩增GFP-NAT1和YFP-NAT1盒式元件，使用F2和R2以pMG2343为模板扩增mCherry-NAT1盒式元件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过 PCR 生成荧光蛋白表达盒（第1天）
<ol>
	<li>准备PCR试剂。在1.5 ml离心管中加入以下体积和浓度的组分，配制总终体积为500 µl的预混液：50 µl PCR缓冲液（500 mM氯化钾，100 mM Tris，pH 8.0，溶于水），20 µl脱氧核苷三磷酸（dNTPs；每种核苷酸浓度均为10 mM的储存液混合物），40 µl 25 mM氯化镁，20 µl纯化的质粒（来自约50–100 ng/µl的储存液），正向和反向引物各10 µl（来自10 mM储存液），30 µl Taq DNA聚合酶（通用型，5,000单位/ml），以及320 µl水。
	<ol>
		<li>将50 µl预混液分装至10个适用于PCR的0.5 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PCR管放入热循环仪中，运行以下程序：94 °C变性双链DNA，持续5分钟，1个循环；随后进行40个循环，依次为94 °C 45秒，55 °C 30秒（使引物与质粒模板DNA退火），68 °C延伸DNA产物，持续4分钟；最后进行1个终末延伸循环：72 °C 15分钟。 
	注意：PCR预混液和循环参数可能需要根据所使用的特定Taq DNA聚合酶进行调整。</li>
	<li>将10个PCR反应的全部产物汇集至一个1.5 ml离心管中。
	<ol>
		<li>取5 µl汇集后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过与DNA分子量标记物比较，验证扩增片段大小并估算产物浓度。通常，后续每次转化反应中使用约250 µg的表达盒DNA。</li>
		<li>向产物中加入50 µl 3 M乙酸钠和750 µl 95%乙醇，沉淀DNA，并在-20 °C孵育至少30分钟。</li>
		<li>将离心管在16,000 × g离心10分钟以收集PCR产物。小心移除并弃去上清液，将沉淀物在室温下干燥过夜。将干燥的DNA表达盒沉淀重悬于40 µl TE缓冲液（pH 8.0）中，室温保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用荧光蛋白DNA片段转化Candida细胞
<ol>
	<li>第1天，从-80 °C保存的15%甘油冻存菌种中，用接种环刮取少量结晶，划线接种至含腺嘌呤的酵母胨葡萄糖琼脂培养基（YPAD）上，于30 °C培养以复苏待转化的酵母菌株。待菌落生长恢复后，挑取单菌落接种于含2 ml液体YPAD培养基的玻璃培养管中（管口配有透气盖），于30 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>第2天，将300 µl过夜培养的酵母菌液稀释至50 ml新鲜YPD培养基中（终浓度OD600 在125 ml带透气盖的锥形瓶中，于30 °C振荡培养约3小时（至最终OD约为0.2）600 ~0.6-0.8).
	<ol>
		<li>将过夜培养物倒入50 ml锥形管中，在台式离心机中以1 500 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>倒掉上清液并妥善处理。将细胞沉淀重悬于5 ml水中。使用台式离心机以1,500 × g离心5分钟，再次收集细胞沉淀。</li>
		<li>倒掉上清液并妥善处理。将细胞重悬于500 µl TELiAc（TE锂酸盐：10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA，pH 8.0，0.1 M乙酸锂）中，并转移至1.5 ml离心管。在微量离心机中以3,000 x g离心2分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于250 µl TELiAc中，总体积（包括沉淀）应约为300 µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向一支洁净的微量离心管（与步骤 4.2.4 中使用的不同）中加入 5 µl 载体 DNA（10 mg/ml）和 150 µl 制备好的 假丝酵母 细胞（来自4.2.4）。这是转化的阴性对照。
	<ol>
		<li>向第二个干净的微量离心管中加入5 µl变性载体DNA（90 °C煮沸10分钟并冷却至4 °C），全部40 µl已制备的PCR产物（来自3.3.1）以及150 µl已制备的 假丝酵母 细胞（来自4.2.4）</li>
		<li>将两种转化混合物在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>向每个转化混合管中加入 700 µl PLATE 混合液（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA，pH 8.0，含 50% 聚乙二醇 3350 的 0.1 M 醋酸锂）。轻轻颠倒混匀管内液体，并于室温下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天，将转化混合物在42 °C孵育1小时（热激）。
	<ol>
		<li>在微量离心机中以16,000 × g离心转化混合物30秒。移除上清液并妥善弃置。用150 µl水轻轻吹打重悬各细胞沉淀，避免损伤细胞。</li>
		<li>对于利用营养缺陷型标记基因的转化例如 URA3），用移液器将每种混合液全部接种到相应的选择性培养基平板上（例如 缺乏尿苷）并用无菌玻璃珠将混合物均匀涂布。</li>
		<li>对于利用杀结核菌素抗性标记基因（nourseothricin resistance marker gene）的转化实验NAT1），如文中所述，将平板转化后的混合物首先涂布于非选择性的YPAD琼脂平板上，在30 °C培养6–12小时。此步骤有助于细胞在热激后恢复，再施加杀稻瘟菌素（nourseothricin）压力。</li>
		<li>部分生长恢复后，进行复制平板 假丝酵母 细胞接种于含有 400 µg/ml 诺尔斯霉素的 YPAD 培养基上。对于使用营养标记基因的转化实验（例如 URA3），此中间铺板步骤无需进行，可将细胞直接铺于选择性酵母培养基上（例如 YPAD 缺乏尿苷，如 4.4.2 所述。 
		注意：若转化成功，菌落应在一至三天内出现（在含诺尔斯苏利霉素的琼脂平板上进行筛选时，可能需要长达五天的生长时间）。仅含有载体DNA的转化混合物涂布的平板上不应出现任何菌落（阴性对照）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于营养缺陷型和杀结核菌素抗性标记筛选，将疑似转化子以单菌落形式划线接种于新鲜的选择性培养基琼脂平板上，于30 °C培养，以扩增酵母细胞，用于筛选荧光蛋白融合构建成功的克隆。</li>
	<li>筛选转化子以确认标签盒的正确整合（参见 代表性结果 如果目标基因表达量足够高，可能会出现整个菌落发出荧光的现象，此时可利用具有荧光检测功能的平板成像系统检测潜在的候选整合子（详见示例）。
	<ol>
		<li>使用与整合区域外序列同源的引物通过PCR检测假定整合子，以确认与目标基因的融合。</li>
		<li>此外，可考虑采用蛋白质印迹分析以确定融合蛋白的表达水平及分子大小，并结合单细胞荧光显微镜观察，对已知的蛋白定位情况进行直观验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bendel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+and+epithelial+adhesion+in+the+pathogenesis+of+neonatal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis.</a> Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+PCR-mediated+construction+of+green%2C+yellow%2C+and+cyan+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans.</a> Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+cassettes+for+epitope+and+fluorescent+fusion+proteins+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans.</a> Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+function+in+clinical+C.+albicans+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates.</a> Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).</li>
<li>Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+the+PCR-mediated+construction+of+regulatable+alleles+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans.</a> Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).</li>
<li>Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+gene+modification+strategy+for+construction+of+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis.</a> Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).</li>
<li>Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassettes+for+PCR-+mediated+gene+tagging+in+Candida+albicans+utilizing+nourseothricin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance.</a> Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).</li>
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<li>Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hypothesis+testing+with+Candida+albicans+through+gene+disruption+with+short+homology+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.</a> J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).</li>
<li>Pulver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rsr1+focuses+Cdc42+activity+at+hyphal+tips+and+promotes+maintenance+of+hyphal+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).</li>
<li>Falgier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species+differ+in+their+interactions+with+immature+human+gastrointestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells.</a> Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).</li>
<li>Nosek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).</li>
<li>Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).</li>
<li>Benjamin, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+candidiasis+among+extremely+low+birth+weight+infants%3A+risk+factors%2C+mortality+rates%2C+and+neurodevelopmental+outcomes+at+18+to+22+months%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months.</a> Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444731">Invasive Candidiasis.</a> N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用上述基于PCR的基因修饰策略，在Candida属物种中构建表位标签序列可概括为三个步骤。第一步，通过PCR扩增获得一个基因盒，该基因盒包含待整合的序列以及与酵母基因组插入位点区域同源的序列。第二步，用乙酸锂处理待转化的酵母细胞，使其具备化学感受态，随后与基因盒共孵育。第三步，将细胞涂布于选择性培养基上，以筛选转化子，并对获得的菌落进行检测，确认基因盒是否正确整合至目标基因组位点。
在本实验方案中，有多个关键步骤可提高在白色念珠菌（C. albicans）和近平滑念珠菌（C. parapsilosis）中获得荧光融合蛋白的成功率。首先，强烈建议使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE；由生产商完成）纯化的引物。若未进行纯化，最终产物中可能出现长度错误的引物，从而降低标记盒通过同源重组整合至目标基因组位点的效率。其次，建议通过琼脂糖凝胶电泳分析约 5 µl 的 PCR 扩增标记盒 DNA，以确认 PCR 产物大小正确，从而验证所生成的标记盒具有高质量。第三，为获得最适合转化的酵母细胞，应选择处于对数生长期的细胞，并在使用前通过显微镜观...

Candida 属是定植于所有人肠道和泌尿生殖道的共生真菌。在免疫功能低下情况下（例如早产或因癌症治疗导致的免疫抑制），Candida 属真菌可成为机会性病原体。Candida 属中，Candida albicans 是最常见的定植真菌，也是引起大多数侵袭性真菌感染的主要原因。其他 Candida 物种，如 C. glabrata、C. parapsilosis、C. tropicalis 和 C. kruseii，也可在免疫功能受损患者中引起严重感染，其中一些菌种对常用抗真菌药物（如氟康唑和两性霉素 B）具有内在耐药性。因此，这些菌种引起的感染在临床上日益常见，尤其是在接受预防性抗真菌治疗的患者中。即使给予及时且适当的抗真菌治疗，侵袭性 Candida 感染仍与较高的发病率和死亡率相关1。鉴于 Candida 属真菌在人类健康中的重要性，迫切需要易于获取的分子工具，以研究并阐明其致病机制。
一种使研究人员能够可视化并定量微生物细胞及其表达蛋白的重要工具是荧光蛋白（FP）融合技术。本文所述的聚合酶链式反应（PCR）介导的基因修饰方法，可实现荧光蛋白序列与目标基因之间的融合构建 假丝酵母 目的蛋白编码序列在其基因组位点。该构建体的稳定整合有助于分析蛋白表达以及蛋白定位动态。含有FP序列的质粒经优化后可用于表达 白色念珠菌 并且已预先构建了可用于PCR介导的基因修饰策略的载体2,3,4,5质粒包含荧光蛋白转化“盒式结构”：一段与营养标记基因相连的荧光蛋白序列，可促进转化 白色念珠菌和近平滑念珠菌2,3,4,5,6,7目前可获得的质粒包含多种可选择的营养标记基因（URA3, HIS1, ARG4) 用于营养缺陷型菌株的转化以及一种显性药物抗性标记（NAT1），有助于转化缺乏营养缺陷型标记的临床菌株。此外，质粒提供了最多四种不同的荧光蛋白序列（绿色 [GFP]、黄色 [YFP]、青色 [CFP] 和樱桃色 [mCherry]）以及任一选项 ADH1 用于构建羧基末端蛋白融合的终止序列，或用于构建氨基末端蛋白融合的启动子序列。引物设计为与荧光蛋白（FP）盒两侧的质粒DNA具有同源性。此外，引物还包含5'端延伸序列，该延伸序列与目标酵母基因具有同源性，从而通过同源重组促进盒式结构整合至基因组位点图1）。通过PCR生成基因特异性的FP盒，然后将其转化进入 假丝酵母 经乙酸锂处理后具有摄取DNA能力的细胞。
<img alt="包含PCR、转化和FP盒整合步骤的基因编辑过程示意图。" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：Candida物种中FP序列融合体的生成示意图。（A）质粒DNA包含一个FP序列和一段编码诺尔斯曲霉素抗性的序列（NAT1）。图中显示了正向（FWD）和反向（REV）引物的相对位置，引物的黑色部分表示与质粒序列同源的区域，紫色部分表示基因特异性的同源区域或引物延伸部分。（B）将FP盒转化至Candida细胞中，并通过同源重组（虚线表示）整合到ENO1基因组位点。（C）在ENO1基因3'端形成的FP融合序列。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文中，我们以Candida species中的蛋白融合（Eno1-FP）构建为例进行说明。我们使用含有NAT1转化标记基因以及编码GFP、YFP或mCherry序列的标签质粒（图2）。这些质粒与PCR引物联合使用，以生成基因特异性的表达盒，从而实现荧光蛋白（FPs）与ENO1基因3'端的融合，最终表达出在其羧基末端融合了荧光蛋白的Eno1蛋白。
<img alt="含有 GFP 和 M-Cherry 基因的质粒图谱；图中显示 ADH1 Ter 位点、AMP、NAT1 标记。" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：含有荧光蛋白（FP）盒的质粒图谱。用于从质粒扩增盒式结构的正向（F）和反向（R）引物已在图中标出，并标明其相对于质粒的同源位置。引物序列见表 1。F1 和 R1 还用于扩增 pYFP-NAT1 盒式结构。含有 YFP-NAT1 盒式结构的质粒（pMG2263）与 pMG2120 完全相同，仅以 YFP 替代了 GFP 序列。盒式结构大小：GFP-NAT1，3.7 kbp；mCherry-NAT1，3.2 kbp；YFP-NAT1，3.7 kbp。本图改编自 Gerami-Nejad，等4 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>100 W 汞灯</td><td>CHIU Technical Corporation</td><td>M-100T</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>载体DNA</td><td>Ambion</td><td>AM9680</td><td>剪切的鲑鱼精子DNA，10 mg/ml</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Photometrics</td><td>CoolSNAP HQ</td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>培养管旋转仪</td><td>New Brunswick</td><td>2013923</td><td>TC-8，或任意培养管旋转仪</td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP），PCR级</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td>022363719, 022363212</td><td>0.5 ml, 1.5 ml</td></tr><tr><td>锥形烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>7250089</td><td>125 ml</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱（-80 &amp;deg;C）</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>ULT-1386-9-V</td><td>Revco Ultima II</td></tr><tr><td>GFP、YFP和Texas Red滤光片组</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>49002, 86004v2, 49008</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1496126</td><td>75 mm</td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗兔抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2301</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（30 &amp;deg;C）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Lysogeny Broth）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td>Nikon Eclipse E600</td></tr><tr><td>显微镜图像分析软件</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>6.3r7</td><td>MetaMorph 软件系列 6.3r7</td></tr><tr><td>小鼠抗GFP抗体</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>诺尔斯氏菌素（Nourseothricin）</td><td>Fisher Scientific</td><td>50997939</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪（热循环仪）</td><td>Applied Biosystems</td><td>9700</td><td>GeneAmp PCR系统</td></tr><tr><td>PCR管</td><td>BioExpress, GeneMate</td><td>T-3035-1</td><td>0.2 ml</td></tr><tr><td>聚乙二醇3350</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>兔抗mCherry抗体</td><td>BioVision</td><td>5993-100</td><td></td></tr><tr><td>冰箱（4 &amp;deg;C）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Labnet</td><td>Z 400</td><td>Hermle Z 400</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA聚合酶</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基</td><td>任意</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

在 candida 物种中构建荧光蛋白融合体

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Candida 属真菌是人类肠道和泌尿生殖道常见的定植菌，也是引起大多数侵袭性真菌感染的病原体。因此，需要分子和遗传学工具来促进对其致病机制的研究。通过聚合酶链式反应（PCR）介导的基因修饰是一种简单且快速的方法，可用于构建表位标签蛋白，从而便于检测。特别是荧光蛋白（FP）融合技术，是一种强大的工具，可通过荧光显微镜观察酵母细胞，或通过免疫印迹法对蛋白进行定量分析。目前已构建出含有荧光蛋白编码序列以及营养标记基因的质粒，这些质粒有助于 Candida 属真菌的转化，可用于在 Candida 中构建和表达荧光蛋白。本文介绍了一种在 Candida 属真菌中构建荧光蛋白融合体的策略。该方法使用含有新霉素类抗生素诺尔斯霉素抗性转化标记基因（NAT1）以及绿色、黄色或樱桃红色荧光蛋白（GFP、YFP、mCherry）编码序列的质粒，结合包含基因特异性序列的引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增生成荧光蛋白表达盒。该基因特异性表达盒可通过同源重组整合至相应基因位点的3'末端。通过遗传学方法确认荧光蛋白序列是否成功地以正确阅读框融合至目标基因位点，随后利用显微镜观察和/或免疫检测方法分析融合蛋白的表达情况。此外，对于高表达蛋白，可通过荧光成像技术为主要手段进行融合成功的筛选。

例如，我们采用上述方案构建了光滑假丝酵母（C. parapsilosis）实验室菌株中Eno1与GFP及mCherry的融合蛋白。每个潜在转化子最初均重新划线培养以获得单菌落。在此示例中，由于目标融合蛋白（烯醇化酶）表达水平较高，且荧光蛋白（FPs）荧光信号强，因此在进行诊断性PCR之前，我们可通过荧光显微镜直接筛选转化子（图3）6。
<img alt="细菌菌落荧光实验；含有 mCherry、YFP、GFP 标签的培养皿。" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：Candida 转化子表现出的菌落荧光。 使用配备 Cy3 滤光片的激光扫描...

通过PCR介导的基因修饰可在假丝酵母属（Candida）物种中构建荧光蛋白融合体，从而便于对酵母细胞和蛋白质进行可视化观察与定量分析。本文中，我们介绍了一种在近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）中构建荧光蛋白融合体（Eno1-FP）的策略。

在 Candida 物种中构建荧光蛋白融合体

念珠菌属物种是人类肠道和泌尿生殖道常见的定植菌，也是引起大多数侵袭性真菌感染的原因。

本实验的总体目标是利用PCR介导的基因修饰技术，在白色念珠菌（Candida）物种中于其天然基因组位点对编码蛋白的序列进行标记，从而生成荧光蛋白融合体，确保目标序列能够稳定整合并长期表达。该方法可用于构建带有荧光标记的白色念珠菌菌株及蛋白，便于在体外和体内实验中对目标物进行鉴定与定量分析。该技术的主要优势在于，与传统的克隆方法相比操作更快速，并且能够通过菌落或单细胞荧光显微镜观察直接对转化子进行筛选。尽管该方法最初是为在白色念珠菌中标记蛋白质而开发的，但也可应用于其他酵母菌种，例如本方案中所述的近平滑念珠菌。通常，初次使用该方法的研究人员难以获得在目标基因位点正确整合了表达盒的转化子。通过优化方案中强调的每个实验步骤中的条件和试剂，可最大限度地减少这一问题。根据文本方案设计引物后，为配制500微升的PCR主混合液，需混合320微升无菌水、50微升PCR缓冲液、20微升dNTPs、40微升25毫摩尔氯化镁、20微升纯化的质粒、各10微升的正向与反向引物，以及30微升Taq DNA聚合酶。将主混合液涡旋混匀，然后将50微升分装至10个0.5毫升PCR管中，随后将PCR管放入热循环仪中并运行以下步骤。将10个PCR管中的所有产物汇集至一个1.5毫升离心管中，取5微升混合后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段大小，并通过与DNA分子量标记比较估算产物浓度。通过向产物中加入50微升3摩尔的醋酸钠，随后加入750微升95%乙醇来沉淀DNA。将样品在-20摄氏度孵育至少30分钟。以16,000 ×g离心10分钟，收集PCR产物。小心移除并弃去上清液，将沉淀物在室温下干燥过夜，然后加入 40 µL TE 缓冲液（pH 8.0）重悬干燥的 DNA 磁珠沉淀，样品于室温保存备用。第一天，从 15% 甘油冻存菌种中复苏待转化的酵母菌株。将 2 mL 液体 YPAD 培养基于 30 °C 振荡培养过夜。第二天，使用 50 毫升新鲜 YPAD 培养基，在 125 毫升锥形瓶中稀释 300 微升过夜培养的酵母菌液，锥形瓶使用透气盖。在 30 °C 下振荡培养约 3 小时。将过夜培养物转移至 50 毫升圆锥形离心管中，通过将离心管放入已平衡的台式离心机中，在 1,500 ×g 下离心 5 分钟，使细胞沉淀。倒掉上清液并妥善处理，加入5毫升水重悬细胞沉淀，然后通过离心重新收集细胞。移除并弃去上清液，加入500微升TE-醋酸锂溶液重悬细胞，将悬液转移至1.5毫升离心管中。在3,000 × g离心2分钟。用250微升TE氯化锂溶液重悬细胞。为制备阴性对照，向一个新的离心管中加入5微升浓度为10毫克/毫升的载体DNA和150微升制备好的假丝酵母细胞。将样品在室温下孵育30分钟。向每个转化体系中加入 700 微升的涂板混合液。轻轻吹打混匀，于室温下孵育过夜。第三天，将转化混合物在 42

generation-of-fluorescent-protein-fusions-in-candida-species

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在荧光蛋白融合的一代<em&gt;念珠菌</em&gt;物种

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

介绍了一种基于绿色荧光蛋白融合技术，用于在大肠杆菌（Escherichia...

基于绿色荧光蛋白的膜蛋白表达筛选 大肠杆菌

基因枪转化是一种通过同源重组将DNA稳定整合到机会性病原体Cryptococcus neoformans基因组中的方法。我们将演示将一个编码乙酸激酶与荧光标签mCherry融合的基因构建体通过基因枪转化导入 C.

将荧光标记基因通过基因枪法转化至机会性真菌病原体 Cryptoc游戏副本occus neoformans

我们提供了一种可重复的基本方法，用于裂殖酵母有性生命周期的长期显微观察。通过文中所述的少量调整，该方案可使研究聚焦于生殖过程的不同阶段。...

裂殖酵母有性生命周期的显微观察

上述 秀丽隐杆线虫 排泄管是用于可视化研究的单细胞独特模型 在体内 分析 从头...

TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像

本文描述了评估荧光蛋白对错误折叠的多聚谷氨酰胺扩展的聚集性和毒性影响的实验方案，可用于在荧光报告系统背景下快速评价一种新发现但尚未表征的荧光蛋白。...

利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia...

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida...

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

本方案描述了一种在人类真菌病原体Candida...

全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&amp;RUN方法与数据分析流程

了解利用PCR介导基因修饰在Candida物种中生成荧光蛋白融合的方法。该技术通过标记蛋白编码序列实现稳定整合，便于酵母细胞和蛋白的鉴定与定量分析。

在 Candida 物种中构建荧光蛋白融合体

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