Name: 测量与建模干燥收缩人类角质层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习测量人类角质层干燥收缩的动态力学刚度与干燥应力，使用Sylgard 184弹性体基底技术。该方法可快速评估化学处理对皮肤组织生物力学特性的影响，为化妆品科学研究提供高效分析手段。

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作者没有致谢。

已获得豁免批准（3002-13），依据美国卫生与公共服务部法规 45 CFR 46.101(b)(4)，可使用去标识化的组织样本开展研究。全层皮肤组织来源于择期手术。本文所用组织来自一名66岁白人女性的乳腺组织。
1. 弹性体包被盖玻片的制备
<ol>
	<li>在20 mL玻璃小瓶中，将0.107 g Sylgard 184固化剂与5.893 g基础剂混合。总混合物质量为6 g，基础剂与固化剂的比例为55:1。</li>
	<li>用玻璃棒搅拌以确保混合均匀后，将玻璃小瓶放入真空室中脱气，以去除所有气泡。</li>
	<li>将一块玻璃盖玻片（55 mm × 25 mm）置于旋涂仪中心。在盖玻片中心加入约1 mL混合液，使用剪去末端的5,000 µL移液器进行操作。以2,000 rpm转速旋涂60秒。
	<ol>
		<li>重复此步骤以制备5–6个基底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片在60 °C烘箱中固化12小时。</li>
	<li>使用剃刀刀片从牺牲基底上部分剥离弹性体薄膜。用永久性记号笔标记弹性体薄膜的上表面以及暴露的玻璃表面。</li>
	<li>将样品安装在倒置显微镜上，并使用远程聚焦附件记录两个标记物焦平面之间z轴高度的差异。该差值即为弹性体基底的厚度h。</li>
</ol>
2. 角质层的制备
<ol>
	<li>使用水浴锅或加热搅拌仪将装有一半去离子水（DW）的玻璃烧杯加热至 60 °C。在生物安全柜内，将全层人皮肤浸入水中 4 分钟。</li>
	<li>立即将皮肤样本转移至另一烧杯中，烧杯内盛有冷却至 &lt;10 °C 的去离子水，浸泡 4 分钟。烧杯半满可最大限度减少生物危害性物质的飞溅。</li>
	<li>将皮肤从烧杯中取出，放入培养皿中，使用弯头组织镊子小心分离表皮。</li>
	<li>将分离出的表皮基底面朝下放置于铺有纱布的培养皿中。确保基底层完全与纱布接触。
	<ol>
		<li>用含有 0.25%（质量/体积）IX-S 型猪胰蛋白酶的溶液浸泡纱布，该溶液溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，室温下孵育 6–8 小时。容器中加入的胰蛋白酶量应仅足以润湿纱布即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用组织镊子提起纱布，并将其漂浮于部分装有去离子水的容器中。轻轻拉扯角质层（SC），使其与纱布分离。</li>
	<li>用去离子水清洗角质层 3–4 次，以去除仍附着在角质层上的残留表皮组织。</li>
	<li>将分离的角质层漂浮于含 0.4% 大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂的去离子水溶液中。使用平板摇床振荡组织 10 分钟。</li>
	<li>将角质层漂浮于部分装有去离子水的培养皿中。使用平板摇床振荡组织 10 分钟。</li>
	<li>将分离的角质层片置于超细塑料网筛上，在室温（25 °C，相对湿度 40%）条件下干燥 48 小时。</li>
	<li>将角质层从网筛上取下，使用圆形打孔器切割成直径为 R=3 mm 的圆形样品。用永久性记号笔在样品最外表面中心处标记一个小螺旋符号，以作为识别角质层正面的视觉标识。 
	注意：永久性标记应位于样品中心，此处干燥变形最小，可最大限度减少记号对记录的干燥位移曲线的影响。</li>
</ol>
3. 样品处理与沉积
<ol>
	<li>将角质层（SC）样品在含有90 µL荧光标记微珠（505/515 nm，直径1 µm，羧基修饰）的15 mL去离子水（DW）中振荡30分钟。此步骤可使微珠沉积于SC表面 
	注意：尽管大量微珠沉积在SC上可能会略微减缓其干燥速度，相较于未加微珠的样品12，但可最大限度提高后续获得的面内变形场的空间分辨率。因此，微珠添加量应根据具体情况临时决定（ad hoc）。</li>
	<li>取出SC样品，并将其置于部分装有去离子水的培养皿中。</li>
	<li>以15–30°的浅角度将基底部分浸入去离子水中。</li>
	<li>将漂浮的SC样品的一边固定在基底与水界面的接触线处。垂直提起基底可使SC样品平滑地贴附于基底上，避免产生皱褶或夹入气泡。</li>
	<li>重复步骤3.4，将最多6个SC样品贴附至同一基底上。样品之间应至少保留2–3 mm的间隙，并避免在基底边缘附近进行贴附。这可防止一个样品的干燥过程影响其他样品的干燥位移。</li>
	<li>在实验室条件下将固定好的SC样品干燥60分钟。此过程可使SC与基底之间的残留水分完全蒸发，并确保组织完全粘附。 
	注意：在此阶段，可通过将基底倒置浸入所需溶液中一定时间，对SC样品施加化学或化妆品制剂处理7,8。处理完成后，重复步骤3.6。干燥后，可使用透射光显微镜检查SC样品是否完全粘附于基底。样品下方夹杂的气泡或脱层边缘会在样品中形成具有清晰边界的明显对比区域。</li>
	<li>通过将部分装水的培养皿放入密闭容器中，构建一个湿度控制环境（湿度室）。</li>
	<li>将基底放入该环境中24小时，使其平衡至99%的相对湿度。注意勿将基底直接放入培养皿的水中。</li>
</ol>
4. 显微镜环境控制
<ol>
	<li>通过连接至显微镜可安装灌流腔的湿度控制系统，实现对环境条件的控制。该湿度控制系统的详细信息以德文提供。 等 (2013)7 和 Liu 与 German（2015）8.</li>
	<li>将基底安装到显微镜上，在基底上放置灌流室，并使用真空脂将灌流室边缘密封至弹性体。</li>
	<li>安装后，在开始实验前将内部空气平衡至99%相对湿度（R.H.），以防止实验前水分蒸发。一旦开始第5或第7节的成像，将内部空气湿度降低至所需值。 
	注意：本文中，SC样品被干燥至25%相对湿度。</li>
</ol>
5. 平面干燥驱替成像
<ol>
	<li>使用倒置显微镜和10倍物镜获取SC样品的图像。利用带有FITC滤光片（503-530 nm发射带通）的光源激发荧光微珠。可通过自动化的x-y载物台，在样品干燥过程中连续成像多个样品。</li>
	<li>使用数字CCD相机以1,392 x 1,040像素的分辨率记录荧光和透射光图像。每幅图像的视场为8.98 x 6.71 mm，可单幅图像完整捕获整个SC样品。以每10分钟一次的频率连续采集图像，持续16小时。</li>
</ol>
6. 厚度测量用基底的制备
<ol>
	<li>在通风橱中，取 1 mL 硅烷（3-氨基丙基三乙氧基硅烷；≥98%）放入一个小塑料盖内。将第 1 节中的弹性体基底和该盖子一同放入密封容器中，静置 5 小时。注意避免基底直接接触硅烷。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中加入 5 mg EDC（N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐；≥99%），再加入 500 µL 去离子水（DW）。使用涡旋振荡器震荡溶液 10 秒。</li>
	<li>将 0.076 g 四硼酸钠和 0.1 g 硼酸加入 20 mL 去离子水中。在 70 °C 下使用磁力搅拌器搅拌 1 小时。持续加入硼酸直至溶液 pH 达到 7.4。</li>
	<li>将 20 mL 硼酸盐缓冲液转移至 50 mL 离心管中。向缓冲液中加入 60 µL 的 1 µm 微球（535/575 nm，羧基修饰）。最后，向管中加入 200 µL EDC 溶液。振荡混匀后，将混合液倒入直径为 10 cm 的培养皿中。</li>
	<li>从容器中取出硅烷化处理后的基底，将弹性体膜面朝下缓慢放入微球溶液中，避免产生气泡。每个培养皿中可放置两个基底。</li>
	<li>让基底在微球溶液中漂浮 45 分钟。</li>
	<li>用镊子将基底从微球溶液中取出，然后用去离子水冲洗，以去除未结合的微球。</li>
	<li>将基底自然晾干。用压缩空气吹扫弹性体膜表面可减少水渍的形成。</li>
	<li>将基底密封于不透光容器中，避免微球发生光漂白，直至进行单细胞样品沉积。</li>
</ol>
7. 角质层厚度成像
<ol>
	<li>使用第3节方法将角质层（SC）样品沉积到基底上。但在执行步骤3.1时，不要向去离子水中添加荧光微珠。此外，在完成步骤3.6之前，用移液器将5 µL未稀释的荧光标记微珠溶液（505/515 nm，直径0.1 µm）滴加到每个沉积的SC样品表面。</li>
	<li>使用配备40倍物镜的显微镜测定SC厚度。通过远程聚焦附件，测量位于SC-基底界面和SC上表面的两层微珠的焦平面之间的z轴高度差，从而记录SC样品随时间变化的厚度。</li>
	<li>在3小时的干燥过程中，测量每个SC样品的3个区域的厚度。在此时间段内，SC样品的厚度将达到稳定状态值8。</li>
</ol>
8. 组织形变的量化与建模
<ol>
	<li>使用粒子图像测速技术13，从每个记录时间步长的荧光图像中获取空间分辨的平面内干燥位移。</li>
	<li>使用 MATLAB 从每个径向对称角质层（SC）样品的位移场中获得方位角平均的径向和方位向位移分布。 
	注：补充信息中已提供一个示例数据集（名为 'd.mat'）和 MATLAB 代码（名为 'PIV-processing.m'），可用于完成此步骤及步骤 8.3。</li>
	<li>将径向位移分布拟合到一个模型7,8,14,15,16，该模型将干燥的角质层描述为一个厚度随时间变化（hSC）、半径为 R、弹性模量为 ESC 的收缩线性弹性圆盘，且该圆盘附着在弹性模量为 E 的可变形弹性基底上。假设角质层具有明确且恒定的泊松比，νSC = 0.47,8。采用最小二乘法进行最优拟合。 
	注：用于拟合的模型以修正贝塞尔函数表示径向位移，其表达式如下： 
	<img alt="柱坐标系下含贝塞尔函数的径向位移方程。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">             (1) 
	其中 <img alt="材料应力分析公式，α = Psc(1+νsc)(1-2νsc)/Esc(1-νsc)，方程图示。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">，<img alt="静态平衡，β=R/lₚ 公式，说明物理方程中的关系。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 和 <img alt="静态平衡方程，弹性公式，数学表达式，物理分析，A(β)^-1 方程。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
	项 <img alt="普朗克长度符号 \(l_p\) 方程；科学记数法中的理论物理概念。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 对应于穿透深度，其表达式为： 
	<img alt="静态平衡公式；工程应力分析方程；力学性能；示意图。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">。 
	<img alt="杨氏模量方程 Y=E/2(1+ν)h，材料科学中的弹性计算公式。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 表示基底刚度参数；当样品尺寸远大于基底厚度时该参数有效。此处，参数 <img alt="静态平衡，ΣFx=0 方程，教学图示，物理概念，力平衡分析。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 和 <img alt="色谱过程；Rf 值，TLC 板图示；溶剂体系，化合物分离。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 分别表示基底厚度和泊松比。硅基弹性体基底17 的泊松比为 ν = 0.5。</li>
	<li>通过将方程 (1) 对径向位移分布进行最小二乘拟合，获得每个时间步长的模型参数 α 和 β。
	<ol>
		<li>利用拟合参数 β，结合以下表达式计算角质层弹性模量 ESC： 
		<img alt="静态平衡公式，E_sc 方程，结构分析中的数学表达式。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
		<li>利用拟合参数 α，结合以下表达式计算随时间变化的收缩性干燥应力 PSC： 
		<img alt="静态平衡公式 \(P_{sc}\)，应力计算方程，用于教学，工程数学。" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Van Hal, D., Jeremiasse, E., Junginger, H. E., Spies, F., Bouwstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+fully+hydrated+human+stratum+corneum%3A+a+freeze-fracture+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Structure of fully hydrated human stratum corneum: a freeze-fracture electron microscopy study.</a> J. Invest. Dermatol. 106 (1), 89-95 (1996).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种可用于测量人体角质层（SC）动态干燥行为和机械性能的技术。先前的研究表明，该技术可用于量化环境条件以及化妆品清洁剂和保湿剂中常用化学产品对角质层动态干燥行为的影响7,8。本实验方案包含若干关键步骤。首先，角质层的含水量会显著影响其膨胀程度，因此，准确测量角质层的厚度以及面内位移对于精确预测弹性模量和干燥应力大小至关重要。其次，样品必须完全粘附于基底上。应避免粘附不完全、非径向对称的样品，或存在微小撕裂或孔洞的样品，因为这些因素会显著影响干燥变形的分布以及用于模型拟合的径向位移曲线。
若无法获得湿度控制系统，可采用该技术。在无环境控制的条件下，组织样本在实验室环境中会脱水干燥12。因此，应持续监测并维持实验室环境，因为干燥行为及实验结果的可重复性会受到温度和湿度的昼夜变化及季节性变化的影响。
目前，该技术仅限于能够附着在基底上并引起弹性体薄膜形变的样品...

表皮的最外层，即角质层（SC），由充满脂质基质包围的紧密连接的角质细胞构成1,2。角质层的组成和结构完整性对于维持正常的屏障功能至关重要3，该屏障功能可防止微生物侵入，并抵抗机械力和过度水分流失4。个人护理产品维持或破坏皮肤屏障功能的能力，是皮肤健康护理和化妆品行业广泛关注的问题5。已知日常使用个人护理产品会改变角质层的机械性能6,7,8。例如，化妆品清洁剂中的表面活性剂可显著增加角质层的弹性模量，并在其中积累干燥应力，从而提高组织开裂的倾向7,9。几乎所有化妆品保湿剂中含有的甘油则可软化角质层，减少干燥应力的积累8,10,11，从而降低组织破裂的可能性。
本文所述方法能够在受控环境中定量分析角质层（SC）干燥过程中的动态干燥行为及其力学特性7,8。此前，该技术已成功用于阐明不同化妆品对角质层组织动态干燥行为及力学特性变化的影响。该方法通过定量测定粘附于柔软弹性基底上的人体角质层组织在干燥过程中产生的收缩，利用简化的收缩模型拟合干燥位移，并从拟合曲线中提取弹性模量和干燥应力。当需要测试多个角质层样本时，该方法相较于单轴张力测试更为快速，所需组织量显著减少，同时通过防止样本底面蒸发，实现了更符合生理条件的干燥过程。

<table><tbody><tr><td>硅弹性体基质</td><td>Dow-Corning</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>硅弹性体固化剂</td><td>Dow-Corning</td><td>1015311</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基 0.1 &amp;micro;m 黄绿色荧光 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基 1 &amp;micro;m 黄绿色荧光 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8823</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基 1 &amp;micro;m 尼罗红荧光 535/575&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8819</td><td></td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂 II-s 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0294</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(二甲基氨基丙基)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙基碳二亚胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 直径打孔器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z708860</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 6-LCR-SB&amp;nbsp;</td><td>Lummencor 光源引擎</td><td>No.3526</td><td></td></tr><tr><td>Cfi Plan Achro Uw 1X 物镜</td><td>Nikon Plan UW</td><td>MRL00012</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40X 油镜 1.3 数值孔径 - 0.20&amp;nbsp;mm 工作距离</td><td>Nikon Plan Fluor</td><td>MRH01401</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-U 倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53200</td><td></td></tr><tr><td>Clara-E 相机</td><td>Andor</td><td>DR-328G-C02-SIL</td><td></td></tr><tr><td>远程聚焦附件 E-RFA Ergo 设计</td><td>Nikon</td><td>99888</td><td></td></tr><tr><td>Ti-S-E 电动载物台</td><td>Nikon</td><td>MEC56110</td><td></td></tr></tbody></table>

测量与建模人体角质层的收缩性干燥

Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

角质层（SC）是皮肤的最表层。由于其与外界环境直接接触，该组织层会受到清洁剂和环境湿度日常变化的影响，这两者均可能改变组织的含水量。当皮肤屏障功能严重受损或处于低湿度环境时，角质层含水量下降，可能导致其刚度发生变化，并产生干燥应力的累积。在极端情况下，这些因素可导致组织发生机械性破裂。我们已建立一种高通量方法，用于量化角质层在干燥过程中力学性质的动态变化。该技术可用于评估在使用化妆品清洁剂和保湿剂处理后，角质层干燥行为及其力学性质的变化。该方法通过测量粘附于弹性基底上的圆形组织样本在干燥过程中空间分辨的面内干燥位移的动态变化来实现。干燥过程中获取的面内径向位移经过方位角平均后，采用基于线性弹性收缩模型的曲线进行拟合，进而从拟合的模型曲线中提取干燥应力和角质层弹性模量的动态变化信息。

图1(a) 显示了涂覆有荧光微球的角质层（SC）样品的代表性荧光图像（见第3节）。图1(b) 显示了该样品对应的透射光图像，并叠加了在25%相对湿度下干燥16小时后形成的、空间分辨的干燥位移的矢量图。由于样品具有圆对称性，这些位移可进行方位角平均。图1(c) 显示了径向位移（ur，实心红线）和方位角位移（uθ，虚线蓝线）随无量纲径向位置 r/R 变化的分布曲线。其中，R 表示SC样品的平均半径，r/R = 0 表示样品中心，r/R = 1 表示样品边缘。各径向位置的标准差由均值周围的阴影区域表示。这些变异主要源于SC结构的异质性3,7,12。在整个干燥过程中，方位角位移始终保持较小值；而径向位移则从中心到边缘单调增加，并持续增大直至达到平衡状态...

本文介绍了一种通过测量粘附在弹性体基底上的圆形组织样本在平面内的空间分辨干燥位移，来量化角质层动态干燥行为和机械性能的方法。该技术可用于测量不同化学处理对干燥过程及组织机械性能的影响。

角质层（SC）是皮肤的最表层。由于其与外部环境直接接触，该组织层会受到多种外界因素的影响……

本方法的总体目标是定量分析经不同化学处理后的人体角质层离体样本在干燥过程中动态力学刚度的变化及干燥应力的累积情况。该方法有助于解答生物力学和化妆品科学领域中的关键问题，例如角质层的组成成分或皮肤组织经个人护理产品处理后，如何影响其力学性能和动态干燥行为。该技术的主要优势在于，与其它力学评估方法相比，它提供了一种更为快速的替代方案，所需皮肤组织显著减少，并通过防止样本底面蒸发，实现了更具生理相关性的干燥过程。制备弹性体包被的盖玻片时，首先按55:1的基体与固化剂比例将Sylgard 184固化剂与基础固体混合，直至形成均匀混合物，总共需要6克。接着，对溶液进行脱气处理。然后使用该溶液在旋涂仪上对盖玻片进行涂覆。用宽口移液管将一毫升混合物滴加在盖玻片中央，随后以 2,000 rpm 的转速旋涂 60 秒。以这种方式制备五到六个包被的盖玻片。为固化盖玻片，将其置于60°C烘箱中保持12小时。第二天，测量弹性体薄膜的厚度。使用剃刀刀片将弹性体薄膜的一边从盖玻片上掀起。然后使用永久性记号笔标记弹性体薄膜的上表面，并标记其下方经过处理的盖玻片。接着，使用倒置显微镜测量两个标记所在焦平面之间的Z轴高度，以测定薄膜的厚度。按照标准操作程序制备角质层（SC）组织。制取样品时，从角质层上取下直径为6毫米的组织块。使用永久性标记笔在样品最外层表面的中心位置做一标记。接下来，将样品置于含有约90微升微珠浓缩液的15毫升水中漂浮，使荧光标记微珠沉积到角质层表面。使用温和振荡处理30分钟，并根据需要调整磁珠浓度。处理结束后，将每个样品浸入水中，使其贴附于弹性体上。将涂覆的盖玻片以15至30度的浅角置于SC下方，弹性体朝向SC的底侧。然后将盖玻片连同上方附着的SC一起从水中提起，从而将SC样品平滑贴合，避免产生皱褶或夹入气泡。接下来，将装载好的样品在常温条件下干燥约一小时。干燥后，将样品转移至含有盛水培养皿的密闭容器中，使样品在该湿度环境中平衡 24 小时。第二天，将样品安装到灌流室中，进行长时间成像。将灌流室置于基底上，并使用真空脂将灌流室边缘与弹性体密封。然后，使用足够大的视野采集荧光和透射光图像，以完整捕获整个SC样品。在接下来的16小时内，每隔10分钟拍摄一次图像。在化学通风橱中，取一毫升硅烷加入小型塑料盖内。将该塑料盖放入一个密封容器中，容器内放置一片带有弹性体涂层的盖玻片，注意塑料盖与盖玻片不要直接接触。在室温下孵育五小时。孵育期间，根据文本方案配制20毫升珠溶液，然后将其倒入10厘米培养皿中。五小时后，将硅烷化基底弹性体面朝下缓慢放入珠溶液中。将两种底物加入每个培养皿中，使其与微珠反应45分钟。随后用镊子取出底物，并用蒸馏水冲洗以去除未结合的微珠。然后在温和的压缩空气流下干燥，并将其存放在密封的不透明盒子中。采用先前描述的技术，将SC样品转移至水浴中的经处理基底上。在固定SC后立即在其上滴加5微升未稀释的荧光标记微球溶液。然后让SC干燥60分钟。现在，使用配备40倍物镜的显微镜在灌流腔室内测量角质层（SC）厚度。利用远程调焦附件，通过记录两层微珠之间的Z轴高度差，随时间测量角质层的厚度。其中一层位于角质层与基底的界面，另一层位于角质层表面。采用上述技术，制备了一例角质层样本，并在其表面涂覆了荧光微珠。干燥16小时后，在25%相对湿度下测量了位移。由于样品具有圆对称性，这些位移进行了方位角平均。在整个干燥过程中，方位角方向的位移始终保持较小。然而，径向位移曲线从中心到边缘呈单调递增，并且其幅值逐渐增大直至达到平衡。每隔30分钟记录的曲线显示了面内位移随时间的演变过程。在干燥过程中，角质层的平均厚度减小，主要发生在前两个小时。随后通过最小二乘法将位移曲线拟合到线性弹性收缩模型，以分析干燥动力学。根据该模型提取了收缩干燥应力以及弹性模量。这两个参数在干燥开始的前两小时内迅速增加。进行该操作时，重要的是要确保将样品完全贴附在基底上。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如脂质染色）来回答更多问题，例如特定化妆品处理如何改变组织中的脂质组成。

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测量与建模干燥收缩人类角质层

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