Name: 模拟卵巢癌多细胞球体行为动态三维微型腹膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学习使用微流控技术构建动态三维共培养平台，模拟卵巢癌腹腔转移微环境。该方法通过精确控制流体流动，研究卵巢癌细胞与间皮细胞的相互作用机制，为癌症生物学研究提供重要工具。

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本工作由香港研究资助局（资助编号：17122014、C1013-15G、719813E 和 17304514）资助。A. S. T. Wong 获得胡文耀高级研究员奖学金。

1. 微流控装置的设计与制备
<ol>
	<li>微流控母版设计
	<ol>
		<li>使用任意计算机辅助设计（CAD）软件设计并绘制微流控通道图案。 
		注意：通常可将CAD图纸发送至光掩膜公司以制作光掩膜。本微流控设计包含三条相同的平行通道，每条通道尺寸为4 mm × 25 mm × 250 µm（宽 × 长 × 高），通道之间相距2 mm。通道两端设计为127°夹角，以利于液体进出（图1B）。本方案中所用通道设计此前已有文献报道13。</li>
		<li>将硅片依次在丙酮、异丙醇和去离子水中进行超声清洗（500 W/42 kHz），每次15分钟。用加压氮气吹干硅片。将硅片置于加热板上，在250 °C下加热15分钟以彻底干燥。</li>
		<li>在硅片上旋涂一层SU-8 2075光刻胶（厚度125 µm），转速为1,800 rpm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在65 °C下烘烤5分钟，再在95 °C下烘烤25分钟，以去除多余溶剂（具体参数依据SU-8产品说明书）。</li>
		<li>重复步骤3，再旋涂一层SU-8 2075光刻胶，使最终厚度达到250 µm。将涂有光刻胶的硅片直接置于加热板上，先在65 °C下烘烤7分钟，再在95 °C下烘烤30分钟。随后将硅片缓慢冷却至室温。禁止使用加压空气冷却。</li>
		<li>将光掩膜对准并直接放置在硅片表面，用紫外光照射20秒，使图案发生交联。</li>
		<li>将带有光刻胶的硅片置于加热板上，分别在65 °C和95 °C下烘烤5分钟和12分钟，以去除聚合过程中的溶剂（具体参数依据SU-8产品说明书）。之后将硅片冷却至室温。</li>
		<li>将硅片浸入SU-8显影液中25分钟，去除未交联的光刻胶。用异丙醇冲洗硅片，并用加压空气吹干。 
		注意：若在异丙醇冲洗过程中观察到乳白色溶液，表明显影不完全，应将硅片重新浸入SU-8显影液中延长显影时间。</li>
		<li>将硅片置于180 °C加热板上加热10分钟，以修复图案中可能出现的裂纹。关闭加热板，让硅片留在加热板上缓慢冷却至室温。</li>
		<li>在离心管盖中加入几滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷。将管盖放入真空干燥器中，将硅片置于管盖旁，进行10分钟的硅烷化处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS芯片制备
	<ol>
		<li>用铝箔包裹硅片，制成托架。</li>
		<li>按10:1的质量比将聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与固化剂混合，在离心搅拌机中启动混合与脱气程序。将PDMS混合物缓慢倾倒至硅片上，厚度约为5 mm。在真空条件下脱气40分钟。将PDMS置于65 °C烘箱中固化2小时。</li>
		<li>小心地将PDMS块从母版上剥离，并沿通道修剪至载玻片大小。使用1 mm活检打孔器在PDMS上打孔，形成装置的进样口和出样口。</li>
		<li>用加压空气和粘性胶带清洁PDMS表面，以去除灰尘和PDMS碎屑。</li>
		<li>将PDMS块通道面朝上放入等离子清洗仪中。同时将一块洁净的载玻片也放入等离子清洗仪中，与PDMS块并列放置。</li>
		<li>在高射频功率下使用空气等离子体处理PDMS和载玻片1分钟。将PDMS与载玻片键合，形成不可逆的共价连接。</li>
		<li>将PDMS芯片置于150 °C加热板上加热1小时，以增强键合强度，并在使用前恢复PDMS的疏水性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用原代腹膜间皮细胞（HPMCs）接种微流控芯片
<ol>
	<li>微流控通道的纤连蛋白包被
	<ol>
		<li>使用 30 µL 75% 乙醇对微流控通道进行灭菌。吸除乙醇后，用移液枪头加入 30 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两次。彻底抽吸通道中的 PBS。 
		注意：为尽量减少污染，微流控细胞培养应在层流罩内严格无菌条件下操作。</li>
		<li>在无血清 M199:MCDB105（1:1）培养基中配制 10 µg/mL 的纤连蛋白溶液。轻轻吹打混匀，特别注意避免产生气泡。禁止涡旋振荡。</li>
		<li>缓慢向每个通道中加入 30 µL 纤连蛋白溶液。用封口膜密封通道，并将芯片在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 HPMCs 接种至微流控通道中
	<ol>
		<li>在含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基（M199:MCDB105 添加 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 HPMCs，直至细胞融合度达到 80%。</li>
		<li>用 3 mL PBS 清洗 HPMCs，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/0.01% EDTA（TE）溶液消化 30 秒。用 4 mL 含 10% FBS 的培养基中和，然后在 1,000 × g 离心 5 分钟收集细胞。</li>
		<li>将 HPMCs 重悬于 2 mL 含 10% FBS 的培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至 3.5×106/mL。</li>
		<li>使用前将纤连蛋白包被的微流控芯片置于 37 °C 培养箱中预热 5 分钟。彻底抽吸掉纤连蛋白溶液。</li>
		<li>缓慢向每个通道中加入 30 µL HPMC 悬液。用封口膜密封通道，将装置置于 CO2 培养箱中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 卵巢癌类球体形成与共培养
<ol>
	<li>卵巢癌球体形成
	<ol>
		<li>将人上皮性卵巢癌细胞系 SKOV-3 培养于含 5% FBS 的培养基（M199:MCDB105 加 5% FBS 及 100 U/mL 青霉素/链霉素）中，置于 5% CO₂ 条件下培养2 在 37 °C 实验前</li>
		<li>将0.5%琼脂糖溶于灭菌水中，煮沸溶解。分装 50 µL 将琼脂糖溶液加入96孔板的每个孔中。将板置于超净工作台中20分钟，使琼脂糖凝固；凝固后的琼脂糖会覆盖孔壁，防止细胞贴壁，表明板已可使用。</li>
		<li>用 3 mL PBS 清洗 SKOV-3 细胞。加入 2 mL TE 溶液消化 3 min。加入 4 mL 5% FBS 培养基中和，于 1,000 x g 离心 5 min 收集细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板对SKOV-3细胞进行计数，并用含5% FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度至5,000个/mL。转移 200 µL 将细胞悬液加入每个琼脂糖包被的孔中，并在5% CO₂条件下培养2 在 37 °C 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤球体接种
	<ol>
		<li>将肿瘤球转移至已用1 mL无血清培养基预润湿的50 mL离心管中，在750 × g下离心5分钟。 
		注意：预先润湿的移液器吸头和离心管可防止类球体非特异性地黏附在离心管上。</li>
		<li>准备 2.5 µg/mL 无血清M199:MCDB105培养基中的5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA）溶液。将癌细胞球体重悬于1 mL CMFDA溶液中，并在以下条件下孵育： 37 °C 30分钟。以750 × g离心5分钟。</li>
		<li>用 2 mL 无血清培养基冲洗肿瘤类球体，750 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次，以去除培养基中残留的荧光染料。 
		注意：荧光信号在类球体中可保持超过96 h。</li>
		<li>将肿瘤球重悬于无血清的M199:MCDB105培养基中，使用血细胞计数板对肿瘤球数量进行计数。用无血清培养基将浓度调整至2,000个肿瘤球/mL。</li>
		<li>在类球体加样前，缓慢注入 100 µL 用无血清的 M199:MCDB105 培养基冲洗通道，以去除未贴壁的间皮细胞。 
		注意：快速注射、抽吸或气泡形成会导致间皮单层细胞脱落。</li>
		<li>加载 30 µL 将荧光标记的球状体悬液加入每个通道中。将微流控芯片放入 CO2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注平台组装与共培养
	<ol>
		<li>将装有新鲜无血清M199:MCDB105培养基的注射器连接至一根1米长的管路。</li>
		<li>将注射器安装在注射泵上，并固定推杆和注射器筒体。将注射泵水平安装在培养箱内，使其与微流控芯片处于同一高度。 
		注意：注射器的数量和规格取决于所用通道的数量以及实验的持续时间。</li>
		<li>通过按住快进按钮，迅速将培养基充满整段管路，直至培养基溢出管路。</li>
		<li>以所需的流速进行注射。使用以下公式估算壁面剪切应力： 
		<img alt="用于物理学中流体流动分析的剪切应力公式 τ=6Qμ/h²w" src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		其中 τ 表示腔室内的壁面剪切应力， ǫ = 流速， μ = 黏度（0.01 g·cm⁻¹·s⁻¹）-1); h = 流动室高度，以及 w = 流动室宽度。</li>
		<li>将管路连接至通道的入口。将多余的进样管路置于培养箱中，以确保培养基在注入通道前已预热。为便于管路与通道之间的连接，可选择合适的连接件。注意：切勿在注射器、管路及连接处引入气泡。</li>
		<li>将通道出口通过一段短的输出管连接至一个50 mL锥形管，用于收集流出的培养基。 
		注意：完整的动态共培养系统如图所示 图1D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 灌注后对高穿透性微血管内皮细胞和肿瘤球体的观察
<ol>
	<li>灌注1小时后，使用明场或荧光显微镜观察人腹膜间皮细胞（HPMCs）和肿瘤球体，并拍照记录。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该检测方法提供了一种灵活且具有生理相关性的模型，可与多种生物化学和基于细胞的检测技术联合使用，包括但不限于黏附实验、间皮清除实验以及药物筛选。该模型可用于评估腹腔内微环境对癌症进展的影响。然而，具体的实验条件可能需要根据研究目标进行优化（例如， 每通道接种的HPMCs数量和癌细胞球体数量、共培养时间， 等等。）。为了研究卵巢癌球体与邻近细胞之间的重要相互作用，该系统还可纳入腹膜内微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞。此外，也可使用其他细胞外基质（ECM）成分，如层粘连蛋白（laminin）、玻璃体粘连蛋白（vitronectin）或胶原蛋白（collagen）。该方案的一个局限性在于，尽管营养补充与剪切应力的耦合情况类似于体内所见，但这一点可能需要加以考虑。 体内目前系统中无法独立控制营养补充和剪切应力。此外，还需采用芯片内胰蛋白酶消化结合荧光激活细胞分选等技术，以分别收集卵巢癌细胞和人腹膜间皮细胞，用于针对不同类型细胞的进一步分子研究。
与传统方法相比，该技术具有多项优势。首先，三维共培养能更好地模拟 <e...

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，其特征是广泛的腹膜播散和恶性腹水的形成1。这种广泛的腹膜转移构成了重大的临床挑战，并与不良的临床预后相关。与大多数通过血液转移的实体癌不同，卵巢癌主要在腹膜腔内播散。在转移过程中，肿瘤细胞以多细胞聚集体/球状体的形式存在2。悬浮培养能够富集卵巢癌干细胞/肿瘤起始细胞，这一事实进一步表明，这些球状体可能与肿瘤侵袭性增强以及化疗耐药性提高有关3,4。二维（2D）和三维（3D）培养体系在药物反应上存在差异，这可能是由于其分子机制不同所致5。
与间皮细胞的相互作用构成了卵巢肿瘤进展的主要微环境。这些间皮细胞位于细胞外基质（ECM）上，其中纤连蛋白是一种普遍存在的组分。已有研究显示，间皮细胞来源的纤连蛋白表达增加与肿瘤进展之间存在关联。在恶性腹水中可检测到大量纤连蛋白6,7。卵巢癌细胞还能够诱导间皮细胞分泌纤连蛋白，从而促进早期卵巢癌的转移8。
越来越多的证据表明，机械刺激（包括剪切应力）可以调节肿瘤细胞的形态、基因表达，从而影响其表型。9,10,11. 恶性腹水 在肿瘤进展过程中发育并积累，卵巢肿瘤细胞暴露于 流体流动及其结果 剪切应力. 多个研究团队（包括我们自己）已证实剪切应力对卵巢癌进展的影响，包括细胞骨架的改变、上皮-间质转化以及肿瘤干细胞特性的获得12,13,14,15因此，生理相关的微环境对于研究肿瘤腹膜转移至关重要。然而，目前 体外 流体动力学培养系统在模拟和控制恒定、低水平且具有生理相关性的剪切应力方面存在局限性16,17,18,19. 传统方法 体外 仅关注细胞或机械环境的方法在模拟具有适当生理相关性的腹腔内微环境的复杂性方面仍然存在局限性。
在此，为了构建一种新型腹膜模型，以克服传统策略的局限性，并推动对癌症转移过程中腹腔内环境的研究，设计了一种基于微流控技术、具有可控流体流动的三维微流控平台。在该模型中，将卵巢癌类球体与原代人腹膜间皮细胞在微流控芯片中进行共培养，并施加持续的流体流动（图1A）。间皮细胞被接种于纤维连接蛋白包被的表面，而非黏附性的卵巢癌类球体则被接种至微流控通道中，并通过注射泵持续灌注培养基。三维环境和动态机械力均为转移级联过程中的关键因素。该平台可用于研究腹腔内微环境，涵盖复杂的细胞间及共培养相互作用，以及动态机械信号的影响。

<table><tbody><tr><td>硅片</td><td>University wafer</td><td>#1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 光刻胶&amp;nbsp;</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液&amp;nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS) + 固化剂套装</td></tr><tr><td>活检打孔器&amp;nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td>1 mm 直径</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.86 mm（内径）</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Longer precision pump&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>199 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>添加 2.2 g/L 碳酸氢钠</td></tr><tr><td>MCDB 105 培养基</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30068.02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% 胰蛋白酶 - 0.01% EDTA，含酚红</td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>5-氯甲基荧光素二乙酸酯</td><td>Life technologies</td><td>C7025</td><td>绿色 CMFDA</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>型号：80i 或 ECLIPSE Ti；软件：SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由加拿大不列颠哥伦比亚大学 N Auersperg 博士惠赠</td></tr></tbody></table>

模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

卵巢癌的特征是广泛的腹膜转移，恶性腹水中常可见肿瘤球体。这种情况与不良的临床预后相关，目前尚缺乏有效的治疗方法。三维（3D）环境和动态机械力在此转移级联过程中均为极为重要的因素。然而，传统的细胞培养方法无法重现这种天然的肿瘤微环境。因此， 体内类器官模型能够模拟腹腔内环境，具有重要意义。本研究建立了一种新的腹膜微流控平台，用于模拟卵巢癌细胞球在转移过程中于腹腔内的存在状态。在非黏附条件下生成的卵巢癌细胞球被培养于微流控通道中，通道内壁覆盖有经生理相关剪切应力处理的腹膜间皮细胞。综上所述，这一动态三维卵巢癌-间皮微流控平台可为癌症基础生物学研究提供新见解，并可作为潜在药物筛选与开发的平台。

采用本方案，建立了在流体动力条件下模拟卵巢癌类球体与间皮细胞相互作用的微流控平台。将原代人腹膜间皮细胞在微流控装置中培养16小时，并在明场显微镜下观察。如图2A所示，微通道底部已成功覆盖单层人腹膜间皮细胞（HPMCs）。需要注意的是，在纤连蛋白或HPMC铺覆过程中若产生气泡，将导致通道涂层失败。通过非黏附悬浮培养方法，生成了直径约100 µm的多细胞类球体，其尺寸与患者腹水中发现的类球体相似，并使用绿色荧光染料CMFDA进行标记。随后将这些类球体转移至HPMC包被的微流控通道中并保持悬浮状态。在显微镜下观察细胞形态并采集图像（图2B）。在荧光显微镜下，荧光标记的癌类球体可与间皮细胞清晰区分（图2C）。
<img alt="微流控芯片示意图及装置：卵巢癌细胞在PDMS通道中的流动；注射泵系统。" src="/files/ftp_upload/55337/...

为了在生理相关模型中研究卵巢肿瘤的进展，将多细胞球体在微流控装置中于模拟流体流动条件下进行培养。该动态三维模型模拟了卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包含其中的细胞和机械组分。

卵巢癌的特点是广泛的腹膜转移，恶性腹水内常可见肿瘤球体。这与……相关。

本实验的总体目标是构建一种基于微流控技术的动态共培养平台，以模拟卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包括其中的细胞和力学组分。通过使用该微流控平台，有助于回答肿瘤生物学领域中的关键问题，例如腹膜播散过程中的微环境特征。该技术的主要优势在于，在精确控制的自由流动条件下进行三维共培养，能够更真实地模拟卵巢癌细胞与间皮细胞在腹腔内所发生的体内相互作用。在设计并绘制微流控通道图案，并按照文本方案完成加工后，将SU82075光刻胶以1800 RPM的转速旋涂在硅晶圆表面。随后将涂有光刻胶的晶圆直接置于热板上，在65摄氏度下预烘5分钟，再在95摄氏度下烘烤25分钟，以去除多余的溶剂。在晶圆上旋涂第二层SU82075光刻胶，最终厚度为250微米。将涂有光刻胶的晶圆直接置于热板上，在65摄氏度下加热7分钟，然后在95摄氏度下加热30分钟，再缓慢冷却至室温。接着，对准并将光掩模直接放置在晶圆表面。然后将其暴露于紫外光下20秒，以交联固化图案。在热板上，将涂覆的晶圆于65摄氏度烘烤5分钟，再于95摄氏度烘烤12分钟，以去除溶剂并实现预固化。将晶圆浸入SU8显影液中25分钟，以去除未交联固化的光刻胶。然后用异丙醇冲洗硅片，并用加压空气将其吹干。按10:1的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂与固化剂，使用离心搅拌机在混合与脱泡模式下搅拌均匀。将PDMS混合物缓慢倾倒于硅片上，厚度约为5毫米。将PDMS置于真空干燥器中脱气40分钟。然后在65摄氏度的烘箱中固化PDMS两小时。小心地将PDMS膜从模具上剥离，并沿微通道修剪PDMS，直至其大小与玻片相当。然后使用1毫米的活检打孔器对PDMS进行打孔，以形成装置的进样口和出样口。用加压空气清洁PDMS表面，再用粘性胶带去除灰尘和PDMS碎屑。现在将PDMS切片放置于等离子清洗仪中，使带有微通道的一面朝上。然后将一块干净的玻璃载玻片与PDMS切片一同放入等离子清洗仪中。在高射频（RF）条件下，使用空气等离子体对PDMS和玻璃载玻片处理1分钟。随后将样品从等离子清洗仪中取出，立即将PDMS与玻璃载玻片贴合，形成不可逆的共价键结合。将PDMS芯片置于150摄氏度的加热板上加热一小时，以增强键合强度，并在使用前恢复PDMS的疏水性。为用纤连蛋白包被微流控通道，首先使用30微升75%乙醇对通道进行灭菌。去除乙醇后，用PBS冲洗通道两次。然后彻底吸除通道中的 PBS。用无血清的 M199MCDB105 培养基配制每毫升含 10 微克的纤连蛋白溶液，取 30 微升该溶液缓慢灌注通道，并用胶带密封。随后将芯片在 4 摄氏度下孵育过夜。将原代腹膜间皮细胞或HPMCs接种至微流控通道时，首先根据文本方案洗涤培养的细胞，然后用2毫升含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬HPMCs。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至每毫升3.5 × 10⁶个细胞。使用前，将纤维连接蛋白包被的微流控芯片置于37 °C培养箱中预热5分钟。然后彻底吸除纤连蛋白溶液，并缓慢将30微升HPMC悬浮液移液至每个通道中。使用封口膜密封通道，并将装置置于CO2培养箱中过夜。为诱导卵巢癌细胞球体形成，将0.5%琼脂糖溶解于无菌水中。向96孔板的各孔中加入50微升琼脂糖溶液。计数先前培养的人上皮癌细胞后，将细胞重悬于含5% FBS的培养基中，密度为每毫升5,000个细胞。将200微升细胞悬液转移至每个包被有琼脂糖的孔中。在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞48小时。将肿瘤类球体转移至预先加入1毫升无血清培养基的50毫升离心管中，750 × g离心5分钟以沉淀类球体。随后，在无血清M199MCDB105培养基中配制2.5微克/毫升的CMFDA溶液。将肿瘤类球体重新悬浮于1毫升溶液中，并在37°C下孵育30分钟。随后计数类球体数量，并用无血清培养基将浓度调整至每毫升2,000个类球体。在加载类球体之前，缓慢注入100 µL无血清M199MCDB105培养基，以冲洗掉通道内未贴壁的间皮细胞。将30微升荧光标记的球状体悬液加入每个通道中。然后将微流控芯片放入CO2培养箱中。通过将装有新鲜无血清M199MCDB105培养基的注射器连接到一根一米长的管子上，组装灌注平台。将注射器安装到注射泵上，并固定推杆和注射器筒身。随后将注射泵水平安装在培养箱内，使其与微流控芯片处于同一高度。通过按住快进按钮并保持按压，用培养基快速充满整个管路，直至培养基在管路中溢出。然后以设定的流速进行注射。根据文本方案，将管路连接至通道的入口。再使用一段短的输出管将通道的出口连接至一个50毫升的锥形管，用于收集流出的液体。最后，使用明场或荧光显微镜观察人腹膜间皮细胞（HPMCs）和肿瘤球。利用本视频中描述的微流控平台，在流体动力条件下建立了卵巢癌肿瘤球与间皮细胞的共培养模型。如图所示，在微流控装置中培养16小时后，间皮细胞成功形成了单层HPMCs。在本实验中，将直径约为100微米的多细胞球状体（其大小与患者体内发现的细胞聚集体相似）用绿色荧光染料CMFDA进行标记。随后将这些球状体转移至HPMC包被的微流控通道中，保持悬浮状态，并采集细胞形态图像。若操作得当，掌握该技术后可在三天内、数小时内完成实验。在此操作步骤中，十分关键的一点是注意避免将气泡引入微流控通道。完成该步骤后，可进一步开展其他方法，如药物处理、黏附实验、间皮清除实验等，以回答更多科学问题，例如腹腔内微环境对癌症进展的影响。该技术建立之后，为癌症生物学领域的研究人员探索人类腹膜转移提供了重要途径。观看本视频后，您应充分了解如何制备带有流体流动的腹膜微装置，以启动卵巢癌在腹膜腔内的行为。请注意，使用丙酮等有机溶剂作为显影剂和环己烷时可能具有极高危险性。首次进行此操作时，务必采取安全预防措施，例如佩戴手套和实验服。所有涉及该办公室的程序均应在高度保密的情况下进行。

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