模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

本实验的总体目标是构建一种基于微流控技术的动态共培养平台，以模拟卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包括其中的细胞和力学组分。通过使用该微流控平台，有助于解答肿瘤生物学领域中的关键问题，例如腹膜播散的微环境特征。该技术的主要优势在于，在精确控制的自由流动条件下进行三维共培养，能够更真实地模拟卵巢癌细胞与间皮细胞在腹腔内所发生的体内相互作用。

在设计并绘制微流控通道图案，并根据文本方案完成加工后，将SU82075光刻胶以1800 RPM的转速旋涂到硅晶圆表面。将涂有光刻胶的晶圆直接置于热板上，在65摄氏度下烘烤5分钟，随后在95摄氏度下烘烤25分钟，以去除多余的溶剂。

在晶圆上旋涂第二层SU82075光刻胶，最终厚度为250微米。将涂有光刻胶的晶圆直接置于热板上，在65摄氏度下加热7分钟，然后在95摄氏度下加热30分钟，再缓慢冷却至室温。接着，对准并将光掩模直接放置在晶圆表面。

然后将其暴露于紫外光下20秒，以交联固化图案。将涂覆的晶圆置于加热板上，在65摄氏度下烘烤5分钟，再在95摄氏度下烘烤12分钟，以去除溶剂并实现预固化。将晶圆浸入SU8显影液中25分钟，以去除未交联固化的光刻胶。

然后用异丙醇冲洗晶圆，并用加压空气将其吹干。按10:1的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂与固化剂，并使用离心搅拌机在混合与脱泡模式下搅拌均匀。缓慢将PDMS混合物倒入晶圆表面，厚度约为5毫米。

将PDMS置于真空干燥器中脱气40分钟。然后在65摄氏度的烘箱中固化PDMS两小时。小心地将PDMS膜从模具上剥离，并沿微通道修剪PDMS，直至其大小与玻片相当。

然后使用1毫米的活检打孔器对PDMS进行打孔，以形成装置的入口和出口。用加压空气清洁PDMS表面，再用粘性胶带去除灰尘和PDMS碎屑。现在将PDMS切片的沟道面朝上放入等离子清洗仪中。

然后将一块洁净的玻璃载玻片与PDMS块一同放入等离子清洗仪中。在高射频（RF）条件下，以空气等离子体处理PDMS和玻璃载玻片1分钟。随后将样品从等离子清洗仪中取出，立即将PDMS与玻璃载玻片贴合，形成不可逆的共价键结合。

将PDMS芯片置于150摄氏度的加热板上加热一小时，以增强键合强度，并在使用前恢复PDMS的疏水性。为用纤连蛋白包被微流控通道，首先使用30微升75%乙醇对通道进行灭菌。去除乙醇后，用PBS冲洗通道两次。

然后彻底吸除通道中的 PBS。用无血清的 M199MCDB105 培养基配制浓度为 10 微克/毫升的纤连蛋白溶液，取 30 微升该溶液缓慢灌注通道，并用胶带密封。随后将芯片置于 4°C 条件下孵育过夜。

将原代腹膜间皮细胞或HPMCs接种至微流控通道中时，首先根据文本方案洗涤培养的细胞，然后用2毫升含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬HPMCs。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至每毫升3.5 × 10⁶个细胞。使用前，将纤维连接蛋白包被的微流控芯片置于37°C培养箱中预热5分钟。

然后完全吸除纤连蛋白溶液，并缓慢将30微升HPMC悬浮液移液至每个通道中。使用胶带密封通道，并将装置置于CO2培养箱中过夜。为诱导卵巢癌球状体形成，将0.5%琼脂糖溶解于无菌水中。

向96孔板的各孔中加入50微升琼脂糖溶液。计数先前培养的人上皮癌细胞后，将细胞重悬于含5%FBS的培养基中，密度为每毫升5,000个细胞。向每孔包被有琼脂糖的孔中加入200微升细胞悬液。

在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞48小时。将肿瘤球转移至预先加入1毫升无血清培养基的50毫升离心管中，750 × g离心5分钟以收集肿瘤球。随后，在无血清M199MCDB105培养基中配制2.5微克/毫升的CMFDA溶液。

将肿瘤类球体重新悬浮于1毫升溶液中，并在37°C下孵育30分钟。随后计数类球体数量，并用无血清培养基将浓度调整至每毫升2,000个类球体。在加载类球体之前，缓慢注入100微升无血清M199MCDB105培养基，以冲洗掉通道内未贴壁的间皮细胞。

将30微升荧光标记的球状体悬液加入每个通道中。然后将微流控芯片放入CO2培养箱。通过将装有新鲜无血清M199MCDB105培养基的注射器连接到一根一米长的管子上，组装灌注平台。

将注射器放置在注射泵上，并固定活塞和注射器筒身。然后将注射泵水平安装在培养箱内，使其高度与微流控芯片保持一致。通过按住快进按钮并持续按压，推动培养基快速充满整个管路，直至培养基在管路中溢出为止。

然后以设定的流速进行注射。根据文本方案，将管路连接至通道的入口。再使用一段短输出管将通道的出口连接至一个50毫升的锥形管，以收集流出的液体。

最后，使用明场或荧光显微镜观察人腹膜间皮细胞（HPMCs）和癌细胞球。利用本视频中描述的微流控平台，在流体动力条件下建立了卵巢癌细胞球与间皮细胞的共培养模型。如图所示，在微流控装置中培养16小时后，间皮细胞成功形成了单层HPMCs。

在本实验中，将直径约为100微米的多细胞球状体（其大小与患者体内发现的细胞聚集体相似）用绿色荧光染料CMFDA进行标记。随后将这些球状体转移至HPMC包被的微流控通道中，使其保持悬浮状态，并采集细胞形态图像。若操作得当，掌握该技术后可在三天内、数小时内完成实验。

在此操作步骤中，十分之一的情况需要注意避免将气泡引入微流控通道中。完成此步骤后，还可进行其他方法，如药物处理、黏附实验、间皮清除实验，以回答更多问题，例如腹腔内微环境对癌症进展的影响。该技术建立后，为癌症生物学领域的研究人员探索人类腹膜转移提供了途径。

观看本视频后，您应充分了解如何制备带有流体流动的腹膜微装置，以启动卵巢癌在腹膜腔内的行为研究。请注意，使用丙酮等有机溶剂作为显影剂和环己烷时可能具有极高危险性。首次执行该操作时，务必采取包括佩戴手套和实验服在内的安全防护措施。

所有涉及该办公室的程序均应在高度保密的情况下进行。