用运动调节血清治疗韧带结构:转化组织工程模型

该模型的总体目标是确定运动和营养对结缔组织合成和功能的影响。该技术使用运动前后服用的人体血清来治疗 3D 组织，以便我们了解运动如何影响韧带和肌腱的功能。3D 组织确保将充分表征的体外分析的优势与体内组织的功能、形态和生化特性相结合。

根据文本协议预先准备硅涂层 35 毫米板后，通过在模具中每个圆柱形孔的中心放置一个 minutien pin 来准备锚定模具。将 β 磷酸三钙和正磷酸柠檬酸溶液以每毫升 1 至 3 克的浓度混合在冰上的塑料称量船中。使用塑料细胞刮刀用力混合水泥。

研磨水泥以继续混合，并将混合物移液到模具中，然后将填充的模具以 2， 250 倍 g 离心 5 分钟。离心后，让 brushite 水泥锚栓在室温下放置过夜。第二天早上，从模具中取出锚栓，并在每个硅涂层板上固定两个相距 12 毫米的锚栓。

用 70% 乙醇喷洒固定板，填充板和盖子，然后将板放入生物安全柜或 BSC 中。至少 30 分钟后，吸出板并让它们在 BSC 中尝试。装回盖子并将其存放在 BSC 中，以备不时之需。

遵守当地生物危害法规，以正确使用和处置生物危害材料。在生物安全柜中保持无菌并执行构建体形成步骤。在制备带有固定刷石锚的原代成纤维细胞、试剂和硅涂层板后，根据文本方案，在 15 厘米板中培养细胞至 70% 汇合。

接下来，制备由以下物质组成的预混液：每个细胞悬液构建体 681 μL，每个凝血酶构建体 29 μL，每个抑肽酶构建体 2 μL，每个氨基己酸构建体 2 μL。将溶液充分混合后，在刷石水泥锚周围以 8 字形向每个固定板中加入 714 微升，确保预混液直接接触锚栓的侧面。轻轻敲击每个板，使混合物均匀分布。

最关键的步骤是形成细胞坐位的纤维蛋白凝胶。确保细胞固定预混液直接接触锚定物，然后点击板以均匀分布混合物。一次一个板，以逐滴方式在板上均匀添加 286 微升纤维蛋白原。

立即来回和左右滑动板，使纤维蛋白原分布以形成细胞包埋的纤维蛋白凝胶，然后进行下一个板。将构建体置于保持 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的无菌培养箱中，并孵育至少 15 分钟，以使纤维蛋白原聚合。通过在生长培养基中补充 200 μml 抗坏血酸、50 μmol Prolene 和每毫升 5 ngng TGF β 1，制备每个进料培养基构建体 2 mL。

使用两毫升补料培养基覆盖每个构建体，并在保持 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的无菌培养箱中培养构建体总共 14 天，或达到所需的终点，每隔一天用两毫升补料培养基刷新培养基。要收集人类血清，请根据文本方案抽取静息血样，然后让参与者进行适合您研究目标的运动模式。此处显示的是 30 分钟的高强度阻力运动。

运动后 15 分钟采集血样，然后在让血液凝结后，以 1， 500 倍 g 的速度旋转样本 10 分钟。在无菌条件下，将血清转移到无菌管中进行培养基制备。准备韧带结构后，在 PBS 浴中使用拉伸测试仪进行拉伸测试，该夹具带有连接到力传感器的反向模制夹具。

在测试过程中将 brushite 水泥锚固定到位。使用数字卡尺，确定韧带结构的长度和带，并计算组织的横截面积。从板上解开韧带结构，将锚点放在反向模制的夹具中，确保结构浸没在 PBS 中，然后调整夹具之间的距离，将结构的长度设置为其初始长度。

开始测试，并以每秒 0.4 毫米或 3% 的应变速率将结构应变至失效。测试后，处理组织并根据文本协议对工程韧带进行胶原蛋白定量。培养 1 到 2 天后，ACL 成纤维细胞附着在纤维蛋白凝胶上，延长了细胞过程，并开始施加牵引力。

两个锚点之间产生张力，细胞平行于该轴对齐，并开始沉积胶原蛋白。此处显示的是经过失效测试的韧带的代表性应力应变图。在这些实验中，从运动前和运动后的血液样本中分离出人血清，并代替 FBS 生成富含运动诱导生化环境的培养基。

如图所示，经过 14 天的培养期后，韧带构建体在运动后血清的响应下表现出最大拉伸负荷和胶原蛋白含量的显著增加。一旦掌握，韧带结构可以在两天内制作出来，并将在两周内准备好进行拉伸测试、胶原蛋白含量定量和其他生化分析。这种转化体外体内模型是更广泛使命的一部分，旨在了解运动如何改善韧带、肌腱，实际上，几乎是身体每个组织的功能。

因此，这是一项非常强大和强大的技术，我们可以在接受运动、营养、负荷、任何类型的生长因子以及我们可以在人类或动物身上进行的所有类型的不同干预后确定胶原蛋白含量和结缔组织功能。