Name: 用运动调节血清治疗韧带结构:转化组织工程模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解运动调节血清处理韧带组织的3D组织工程模型。本方法利用人血清处理纤维蛋白凝胶构建体，通过拉伸测试和胶原定量分析肌腱功能与生化特性。

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本工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会博士后奖学金（DWDW）、ARCS基金会奖学金（AL）以及加州大学戴维斯分校生物科学学院资助（KB）的支持。

以下操作步骤遵循加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的方案；在开始研究前，请咨询当地的伦理委员会。
1. 从人前交叉韧带残余组织中分离原代成纤维细胞
注意：保持无菌状态，所有步骤均须在生物安全柜（BSC）中进行。
<ol>
	<li>按照下述方法，获得相关伦理审查委员会对人源组织采集与使用的批准。</li>
	<li>通过将100倍浓度的抗生素/抗真菌素（ABAM）溶液稀释于1倍磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制5倍浓度的抗生素/抗真菌素（ABAM）溶液。</li>
	<li>将前交叉韧带（ACL）组织碎片收集于50 mL锥形管中的5倍ABAM溶液内，4 °C保存直至进行消化步骤。如有必要，使用刀片将组织切割为最大尺寸不超过1×1×1 cm3的小片段。 
	注意：须遵守当地生物危害物管理规定，正确处理生物危害材料，并对生物危害废弃物进行去污与处置。</li>
	<li>配制足量胶原酶溶液以完全浸没组织碎片。将II型胶原酶（终浓度1 mg/mL）溶解于含1倍青霉素/链霉素及20%胎牛血清（FBS）的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，经0.22 µm滤膜过滤除菌。</li>
	<li>用PBS清洗前交叉韧带组织3次。</li>
	<li>进行组织消化。将前交叉韧带组织转移至新的50 mL锥形管中，加入足量胶原酶溶液以完全浸没组织，于37 °C孵育过夜（约17 h）。</li>
	<li>在消化完成前，提前配制生长培养基（GM）：在高糖DMEM培养基中添加10% FBS和100 U/mL青霉素。</li>
	<li>在消化结束前15分钟，每隔5分钟对含有组织的50 mL管进行短暂涡旋振荡，共3次。</li>
	<li>使用25 mL刻度移液管剧烈吹打已消化的组织，进一步破碎组织并释放细胞。</li>
	<li>以1,500 × g离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于10 mL生长培养基（GM）中。</li>
	<li>重复步骤1.8–1.9，再进行三次。</li>
	<li>最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于5–10 mL生长培养基（GM）中。取少量细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数，并用台盼蓝染色评估细胞活力。</li>
	<li>将细胞悬液以每皿3–4 × 105个细胞的密度接种至15 cm组织培养皿中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的无菌培养箱中培养至70%汇合度，每三天更换一次生长培养基（GM）。细胞在5代内使用或冻存（见下文）。</li>
	<li>将细胞冻存以供后续使用。
	<ol>
		<li>当细胞达到70%汇合度时进行胰酶消化：吸除培养基，用PBS洗涤细胞；加入足量预热（37 °C）的0.05%胰蛋白酶溶液，使其刚好覆盖组织培养皿底部；将培养皿放入培养箱中孵育约5分钟，直至细胞脱落（通过倒置显微镜观察确认细胞已悬浮）。使用移液器收集细胞并转移至Falcon管中。</li>
		<li>离心收集细胞沉淀，将细胞重悬于含20% FBS和10%二甲基亚砜（DMSO）的高糖DMEM培养基中。将细胞悬液分装至冻存管中，以-1 °C/min的速率降温至少24小时。将冻存管储存于液氮中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备硅化处理的培养板
<ol>
	<li>准备 35 mm 组织培养皿：取下皿盖，将敞口的培养皿平放在平坦表面上。</li>
	<li>按照生产商说明书混合硅胶弹性体试剂盒。</li>
	<li>使用 10 mL 注射器，每 35 mm 培养皿分配约 2 mL。</li>
	<li>让硅胶在室温下固化 2–3 天。</li>
</ol>
3. 制备磷酸八钙骨水泥锚
<ol>
	<li>提前制备含有圆柱形孔的硅胶反向模具，用于锚定结构的形成。反向模具可根据所需锚定物的形状和尺寸进行定制。
	<ol>
		<li>确定最终锚定物所需的高和直径。本方案使用在35 mm组织培养皿中由手工硅胶制成的定制模具，其中放置了直径约3.25 mm的塑料圆柱体，使最终模具高度约为6.5 mm。最终锚定物的尺寸约为高3-3.5 mm、直径约3.4 mm，底部有1.5 mm的针状突起。</li>
		<li>将未固化的硅胶加入将要制作模具的35 mm培养皿中，并按设计放置塑料圆柱体。 
		注意：塑料圆柱体的尺寸将决定最终锚定物的直径。通过调整塑料圆柱体的位置和所用硅胶的量，可制备不同高度的锚定物。模具中孔底部与模具自身底部之间的厚度将决定锚定物底部针状突起的长度，从而确保锚定物之后能牢固地插入涂有硅胶的培养皿中。</li>
		<li>待硅胶完全固化后，取出塑料圆柱体，并将模具从35 mm培养皿中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制3.5 M正磷酸/100 mM柠檬酸溶液：将0.961 g柠檬酸溶解于11.5 mL正磷酸中，再用MilliQ水定容至50 mL。溶液于室温保存，并避光。</li>
	<li>准备模具：将一根微小针置于每个模具圆柱形孔的中心位置。</li>
	<li>在冰上的塑料称量舟中，将β-磷酸三钙与正磷酸/柠檬酸溶液按1 g/mL的浓度混合。</li>
	<li>使用塑料细胞刮刀剧烈搅拌水泥状混合物。</li>
	<li>用移液器反复吹打水泥以继续混合，并将混合物转移至模具中。</li>
	<li>将装满混合物的模具在2,250 × g条件下离心1分钟。</li>
	<li>让磷酸八钙锚定物在室温下静置过夜固化。</li>
	<li>从模具中取出锚定物，并在每个涂有硅胶的培养板中以12 mm间距固定两个锚定物。</li>
	<li>通过喷洒70%乙醇对固定好锚定物的培养板进行灭菌，同时将培养板和盖子内部润湿，然后放入生物安全柜中。至少30分钟后，吸除液体并重新盖上盖子，存放于生物安全柜中待用。</li>
</ol>
4. 获取人血清
<ol>
	<li>确保已获得相关伦理审查委员会对该方案的批准。</li>
	<li>确保已从参与特定干预措施的人类受试者处获得书面知情同意例如，运动、食物或药物干预）以引起血清中期望的变化。本文描述了在静息状态下以及抗阻运动后15分钟的样本采集方法。</li>
	<li>由经过培训的采血员使用真空采血管通过静脉穿刺采集受试者的静息状态血液样本。</li>
	<li>在参与者完成预定的运动方案后15分钟，采集运动后血液样本。如前所述1，使用本实验中的抗阻训练方案来刺激内源性生化反应。
	<ol>
		<li>让受试者完成五组腿部推举，每组之间休息1分钟。接着，让受试者连续完成一组膝关节伸展和一组腘绳肌屈曲，中间不休息，随后重复该连续训练3次，每组之间休息1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让血液凝固后，在1,500 x g离心10分钟。在无菌条件下，将血清转移至无菌试管中，用于后续培养基补充（血清储存于 4 °C）以及生化分析（少量血清在 -20 °C).</li>
</ol>
5. 构建工程化韧带
注意：提前扩增原代成纤维细胞，并用固定有磷酸氢钙锚的硅胶包被板做好准备。
<ol>
	<li>准备试剂：
	<ol>
		<li>制备凝血酶。将牛凝血酶以200 U/mL的浓度溶解于高糖DMEM培养基中。经0.22 µm滤膜过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>制备纤维蛋白原。将牛纤维蛋白原以20 mg/mL的浓度溶解于高糖DMEM培养基中。在37 °C水浴中孵育3–4小时，每30分钟轻轻摇动以促进溶解。经0.22 µm滤膜过滤（可能需要多个滤器），分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>制备抑肽酶。将抑肽酶以10 mg/mL的浓度溶解于水中。经0.22 µm滤膜过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>制备氨基己酸。将氨基己酸以0.1 g/mL的浓度溶解于水中。经0.22 µm滤膜过滤，分装后于4 °C保存。</li>
		<li>制备抗坏血酸。将抗坏血酸以50 mM的浓度溶解于高糖DMEM培养基中。经0.22 µm滤膜过滤后于4 °C保存。</li>
		<li>制备L-脯氨酸。将L-脯氨酸以50 mM的浓度溶解于PBS中。经0.22 µm滤膜过滤后于4 °C保存。</li>
		<li>制备转化生长因子-β1（TGF-β1）。根据生产商说明书，将TGF-β1以10 µg/mL的浓度进行重悬。分装后于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定实验所需的构建体数量，并确保已准备好足够数量的固定板。建议设置生物学重复和技术重复。在本研究1中，采用双份技术重复和12份生物学重复（来自12名个体在静息状态和运动后的血清）。 
	注意：以下所有步骤均需在生物安全柜（BSC）中无菌条件下进行。</li>
	<li>在15 cm培养皿中培养细胞至70%汇合度以扩增细胞。每个构建体需要2.5 × 105个细胞。</li>
	<li>用胰蛋白酶消化细胞，并以3.67 × 105个细胞/mL的浓度重悬于生长培养基（GM）中。</li>
	<li>根据所需构建体数量配制主混合液：每1个构建体的主混合液包含681 µL细胞悬液（含2.5 × 105个细胞）、29 µL凝血酶、2 µL抑肽酶和2 µL氨基己酸。</li>
	<li>充分混匀主混合液后，以“8”字形方式将714 µL主混合液加入每个固定板中，围绕磷酸钙水泥锚点周围添加。确保主混合液直接接触锚点的侧面。</li>
	<li>轻轻敲击每个培养板，使主混合液在板上均匀分布。</li>
	<li>每次对一个培养板，迅速以滴加方式将286 µL纤维蛋白原均匀加入该板，然后立即在生物安全柜台面上前后左右滑动培养板，使纤维蛋白原均匀分布，形成包埋细胞的纤维蛋白凝胶。完成后进行下一个培养板。</li>
	<li>将构建体置于维持在37 °C和5% CO2的无菌培养箱中，孵育至少15分钟，以使纤维蛋白原发生聚合。</li>
	<li>配制足够的喂养培养基（FM），每构建体需2 mL。在生长培养基（GM）中添加200 µM抗坏血酸、50 µM脯氨酸和5 ng/mL TGF-β1。</li>
	<li>每构建体加入2 mL喂养培养基（FM）覆盖。将构建体置于维持在37 °C和5% CO2的无菌培养箱中培养共14天或至预定终点，每隔两天更换一次培养基，每次加入2 mL新鲜喂养培养基（FM）。</li>
</ol>
6. 工程化韧带的拉伸测试
注意：拉伸试验使用自行搭建的拉伸测试仪在 PBS 浴中进行；与力传感器相连的反向模制夹具用于在测试过程中固定磷酸氢钙水泥锚。
<ol>
	<li>使用数显卡尺测量韧带构建物的长度和宽度；计算组织的横截面积。</li>
	<li>将韧带结构从板上取下，并将锚点放入反向模制的夹具中，确保结构浸没在PBS中。</li>
	<li>调节夹具之间的距离，将构建物的长度设为其初始长度。</li>
	<li>开始测试：以0.4 mm/s（约3%/s）的应变速率对试样进行拉伸直至破坏。</li>
	<li>测试完成后，将组织残留物进行胶原含量分析（参见第7节）。</li>
	<li>根据所得的载荷-变形数据，计算应力-应变数据，并量化感兴趣的力学性能；例如，最大拉伸载荷、极限抗拉强度和模量（即，应力-应变曲线线性区域内的弹性性能。</li>
</ol>
7. 工程化韧带胶原含量的定量分析
<ol>
	<li>从磷酸二钙水泥锚中取出构建的韧带，并在 120 °C 下干燥 25 分钟。</li>
	<li>测定构建物的干重，并将其放入单独的 1.5 mL 离心管中。干燥后的构建物可在室温下储存，直至后续处理。</li>
	<li>向每个构建物中加入 200 µL 6 M HCl，在加热块中于 120 °C 沸腾 2 小时，操作在通风橱中进行。 
	注意：HCl 具有强腐蚀性和强酸性，建议使用耐煮沸/安全锁扣的离心管或其他方式固定离心管。</li>
	<li>短暂离心以收集液体，打开管盖，于 120 °C 加热块中在通风橱内蒸发 1.5 小时。</li>
	<li>将所得沉淀重悬于 200 µL 羟脯氨酸缓冲液中。使用前可于 -20 °C 保存。
	<ol>
		<li>配制羟脯氨酸缓冲液：在 300 mL 水中加入 16.6 g 柠檬酸、4 mL 冰醋酸、11.4 g NaOH，搅拌至完全溶解。调节 pH 至 6–6.5，加水定容至 500 mL。加入 250 µL 甲苯作为防腐剂，4 °C 避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制试剂。
	<ol>
		<li>配制反式-4-羟基-L-脯氨酸：溶于水中，配制成 4 mg/mL 溶液。</li>
		<li>配制氯胺-T：溶于水中，配制成 14.1 mg/mL 溶液。</li>
		<li>配制醛-高氯酸试剂：将 1.5 g 4-二甲氨基苯甲醛溶于 6 mL 1-丙醇、2.6 mL 高氯酸（注意：具腐蚀性，强氧化剂，需采取适当防护措施）和 0.5 mL 水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在一组新的 1.5 mL 离心管中，用羟脯氨酸缓冲液将每份重悬沉淀样品稀释至总体积为 200 µL。 
	注：稀释倍数可根据样品预期胶原含量在 1:4 至 1:50（样品:缓冲液）范围内调整；因此可能需要通过试验确定适合该样品集的稀释倍数（即使样品吸光度值位于标准曲线中段）。</li>
	<li>制备羟脯氨酸标准品。将羟脯氨酸用羟脯氨酸缓冲液（见第 7.5.1 节）稀释至 80 µg/mL，进行系列稀释，配制 6–8 个 200 µL 的标准品溶液，浓度范围为 0–20 µg/mL。</li>
	<li>向每个标准品和稀释后的样品中加入 150 µL 14.1 mg/mL 氯胺-T 溶液。涡旋混匀，在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>向每个样品和稀释后的样品中加入 150 µL 醛-高氯酸溶液。涡旋混匀，在加热块中 60 °C 孵育 15 分钟。根据当地法规，将多余的醛-高氯酸溶液作为危险废物处理（含高氯酸）。</li>
	<li>待标准品和样品冷却后，将每种溶液各取 200 µL，重复加样至 96 孔板中。</li>
	<li>在分光光度计中于 550 nm 波长读取吸光度。根据当地法规，将 96 孔板及 1.5 mL 管中剩余液体作为危险废物处理（含高氯酸）。</li>
	<li>总胶原含量与胶原比例的计算。
	<ol>
		<li>利用羟脯氨酸标准曲线，将各样品的吸光度值换算为羟脯氨酸微克数。</li>
		<li>将每孔数值乘以 2.5，计算稀释样品中羟脯氨酸的含量。注意：仅将 500 µL 总混合液（200 µL 稀释样品 + 150 µL 氯胺-T + 150 µL 醛-高氯酸溶液）中的 200 µL 加入每孔。</li>
		<li>乘以稀释倍数（第 7.7 节）以计算原始样品中羟脯氨酸的含量。</li>
		<li>除以 0.137 计算胶原含量（假设胶原中含 13.7% 羟脯氨酸20）。 
		注：哺乳动物胶原中羟脯氨酸的含量在不同组织和物种间略有差异；例如，猪和羊跟腱中羟脯氨酸含量分别为 13.5% 和 13.7%（羟脯氨酸质量/干组织质量）21。此处采用 13.7% 估算胶原中羟脯氨酸的百分比，用于通过以下公式计算组织样品的胶原含量： 
		<img alt="羟脯氨酸转胶原质量公式：羟脯氨酸质量 (μg) ÷ (13.7/100) = 胶原质量 (μg)。" src="/files/ftp_upload/55339/55339eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"></li>
		<li>除以干重，计算胶原比例，并转换为百分比。 
		<img alt="计算胶原百分比，公式，方程，教学示意图。" src="/files/ftp_upload/55339/55339eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 分子终点的定量分析
注意：除了拉伸测试和胶原蛋白含量等主要结局指标外，还可对二维或三维组织进行分子水平终点的检测，以提供机制层面的深入理解。可采用生物测定法来确定分子水平终点（参见下文“运动后血清环境对……的影响”部分以了解背景信息）。 体外 韧带功能
<ol>
	<li>对于三维组织：
	<ol>
		<li>按照上述第5步制备载体。</li>
		<li>在构建体处理/干预后，将构建体在液氮中速冻。</li>
		<li>使用在干冰上冷却的研钵和研杵将构建物研磨成粉末。继续进行步骤 8.4/5)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于二维组织：
	<ol>
		<li>在六孔板中用 DMEM 培养人前交叉韧带成纤维细胞至单层汇合。</li>
		<li>吸弃 DMEM，根据实验设计加入处理用培养基（例如，时间过程或剂量反应实验。</li>
		<li>吸弃处理用培养基，并用 PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>使用适当的提取缓冲液/试剂刮取细胞以收集（见下文）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质表达分析：使用细胞质提取缓冲液（例如，250 mM 蔗糖，50 mM Tris（pH 7.4），5 mM MgCl₂，以及蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物）以获得蛋白裂解液。进行蛋白浓度测定，并根据标准 Western 印迹实验流程继续后续分析。</li>
	<li>基因表达分析：使用总RNA提取法分离总RNA 500 µL 按照制造商说明书使用RNA提取试剂提取高质量RNA。按照标准操作程序进行逆转录和实时定量PCR分析。</li>
	<li>DNA 提取：根据试剂盒说明书，使用 DNA 提取试剂分离并提取基因组 DNA。采用分光光度计测定样品在 260 nm 处的吸光度，以定量 DNA 浓度。</li>
</ol>

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作者声明不存在利益冲突。

本文描述了一种韧带组织模型，该模型可作为实验平台，适用于从组织发育到转化/临床问题等广泛研究领域的科研人员。此处所述的工程化韧带模型基于一种通用性较强的实验方案，可在整个工作流程中的多个环节进行调整与优化。图1 和 讨论部分）。此外，这种本质上还原论的性质 体外 通过在培养基中添加经处理的人或动物血清，可使环境更接近生理状态。
可利用多种来源的成纤维细胞构建组织工程韧带 
尽管本文所示的方法和代表性结果基于人前交叉韧带（ACL）原代成纤维细胞的应用，但该细胞分离方案可调整用于获取其他类型的原代成纤维细胞。如图4所述，使用从年轻人类供体分离的原代细胞构建的工程化韧带表现出较低的供体间变异性。原代细胞的使用受限于初始分离难度和传代次数限制；采用细胞系可能有助于提高实验的可重复性。使用其他类型的细胞可能需要对细胞培养基和纤维蛋白凝胶配方进行调整。例如，我们观察到人源间充质干细胞（MSCs）在2周内无法在磷酸钙骨水泥锚点之间形成线性组织，而马源指深屈肌腱成纤维细胞、马源骨髓基质细胞、鸡胚肌腱成纤维细胞以及小鼠C3H10T1/2间充质干细胞则能迅速收缩并降解纤维蛋白凝胶，形成线性组织（未发表观察结果）。这种差异可能是由于细胞收缩能力、增殖能力以及纤溶酶产生水平的不同所致。
化学与机械刺激的应用 
在本方法中，纤维蛋白基质组织在磷酸二钙水泥锚周围形成，从而可通过拉伸生物反应器施加机械刺激11，以及用于终点拉伸测试。刷状磷灰石水泥与软组织界面（止点）的存在也为进一步研究和改进提供了机会22,26 （参见下文临床应用部分）。在此 体外 环境，化学和机械因素的贡献更容易被识别；这方面的一个示例如下所示 图5，从而将运动后血清环境的影响与运动的机械刺激分离开来。可能需要开展预试验以确定实验干预的时间范围、处理成分以及预期可观测变化的适当终点指标。例如，在运动后血清研究中1实验处理的时间受限于培养基补充用血清的供应量，每隔两天用该血清喂养构建物。此外，在培养的第二周，培养基中添加静息状态或运动后血清，并继续维持添加抗坏血酸和L-脯氨酸，同时去除TGF-β1。TGF-β1是一种已知的促纤维化生长因子，其在运动后的血清中水平升高27因此，为了避免掩盖运动后血清中与TGF-β1相关的作用，该细胞因子未保留在培养基中。
该工程化韧带模型还可用于测试机械拉伸的影响。通过设计反向建模的夹具来固定磷酸氢钙水泥锚端（类似于图示的单轴拉伸测试仪） 图1），可设计拉伸生物反应器以适配工程化韧带。本实验室此前已利用该模型，在定制的生物反应器中研究工程化韧带对单轴拉伸的分子信号响应11 这将有助于更合理地设计 体外 拉伸范式，甚至可能应用于体内拉伸/活动/治疗。
工程化韧带的评估 
与传统的单层培养一样，3D结构可用于检测基因/蛋白表达；此外，其3D形态还为评估功能和形态学变化提供了可能，并且这些结构可在培养中长期维持，适用于长期研究。图3）。尽管人工韧带与天然成熟的韧带并不等同，但其在结构上类似于发育中的肌腱/韧带，并且在营养刺激下的反应行为与天然组织相似26生长因子10，激素25，以及运动11,28因此，在基于任何单一研究做出广泛推论时，仍需保持谨慎 体外 模型，韧带构建物的测试结果可能揭示或阐明某种生理机制，而该机制在其他情况下可能难以研究 在体内
在补充饲料培养基中添加条件化血清，构建具有广泛应用前景的灵活动态模型 
人血清代谢组包含约 4,500 种化合物，包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、脂质衍生物、能量底物、代谢物、维生素、酶、激素、神经递质以及大量结构单元/中间代谢物。29 进一步按化合物类别分析人血清代谢组29，可揭示将实验用血清整合到体外实验中的额外优势。具体而言，血清中约 4,500 种化合物的大多数为疏水性或脂质来源的分子，突显了结合蛋白在运输/溶解过程中的关键作用。因此，若要在实验中完全重现内源性化合物的转运动力学过程，进而准确反映其生物利用度及化合物-靶点相互作用，几乎是不可能实现的。因此，实验用血清特别适用于研究那些已知依赖辅助分子进行溶解、转运、靶点结合及发挥作用机制的化合物。
我们实验室长期关注运动对健康的益处。运动可改善全身多种组织的细胞和器官功能12，这种效应可能归因于多种释放到体循环中的因子（例如，IL-613、IL-1514、Meteorin-like15、外泌体16,17）。运动后的生化微环境反映了由收缩的骨骼肌释放的运动响应性激素，以及因交感神经系统刺激分泌腺体而释放的其他因子（例如，肾上腺分泌的皮质醇和儿茶酚胺18，以及垂体前叶分泌的生长激素19）。我们最近采用运动前后血清模型，研究运动诱导的生化微环境对工程化组织的影响1。尽管仍有许多重要的与运动相关的科学问题有待探索，但该模型的应用远不限于此。例如，血清可来源于动物或人类，在饮食干预、药物干预后采集，或来自不同年龄组或临床人群30。通过这种方式，感兴趣的外源性或内源性化合物将以生物可利用的浓度存在于血清和处理培养基中，并在内源性微环境的协同作用下与靶组织相互作用（即，在更接近生理的环境中）。该方法具有动态性，因为特定干预很可能产生多器官（及多化合物）效应，从而共同改变生理微环境。尽管该方法存在某些挑战，例如多个系统性生化变量同时发生变化，但它可能有助于克服纯粹还原论实验方法的局限性31,32。综上所述，将条件化血清与组织工程（体外仿生）组织相结合，可作为生理学、营养学和临床研究的有力工具。
临床应用广泛 
本文所介绍的组织工程模型可用于研究传统体外模型无法解决的解剖学和临床研究问题。韧带或肌腱在体内存在一个从软组织到硬组织的过渡区域，称为附着点（enthesis）。该附着点易受与机械应力相关损伤的影响33，可通过组织化学和电子显微镜技术进行横切面研究22,26。对于活动能力低下或受限的人群而言，这一独特界面尤为重要，因为身体活动不足会削弱结缔组织将负荷从低顺应性区域传递至高顺应性区域的能力34，最终导致整体组织顺应性下降，增加受伤风险。
我们实验室最近利用这种组织工程模型25研究了另一类高风险人群——女性运动员，她们更容易发生结缔组织损伤：前交叉韧带（ACL）损伤的发生率约为同龄男性的五倍35。为探究导致这种性别差异的潜在机制，我们使用生理浓度的女性性激素雌激素处理韧带类组织，其浓度模拟了月经周期的不同阶段。有趣的是，高浓度雌激素抑制了赖氨酰氧化酶的基因表达及其活性，而赖氨酰氧化酶是负责在韧带和肌腱胶原基质中形成赖氨酸-赖氨酸交联的主要酶。重要的是，48小时的高浓度雌激素处理（模拟卵泡期）降低了韧带类组织的刚度，但并未改变其胶原密度。从生理学角度来看，这表明女性韧带松弛度的增加可能至少部分归因于交联结构形成的减少。从实验角度来看，这些发现25凸显了三维类组织模型的优势，该模型使功能性交联活性得以被检测。从临床角度来看，该模型现在可用于快速筛选能够预防雌激素对韧带功能产生不利影响的干预措施。
结束语 
本文介绍了一种构建工程化韧带及其作为三维体外组织模型应用的详细方法。该模型具有高度适应性，可根据不同研究目标灵活选择细胞类型、干预措施和关注的结局指标。在培养基中添加条件化血清可提供传统体外环境无法实现的生理背景，从而更真实地模拟体内生理状态。总之，我们认为该模型具有广泛的应用前景，对推动生理学和组织工程学领域的发展具有重要意义。

肌腱和韧带损伤十分常见，可能对正常活动能力和生活质量造成严重影响。通常需要手术干预，但疗效有限且效果差异较大4,5。目前对肌腱和韧带如何发育、成熟以及对损伤作出反应的理解尚不充分，因此需要有效的研究模型，以深入了解更有效治疗方法的开发5。为弥补这一知识空白，可采用动物模型，但in vivo研究本身较为复杂，难以控制环境条件，并难以将干预措施直接靶向目标组织。相比之下，传统的单层细胞培养可在体外（in vitro）轻松控制和监测实验环境。然而，该技术可能过度简化了化学和机械环境，因而无法重现细胞在体内的（in vivo）行为。组织工程技术能够结合动物模型中复杂的体内（in vivo）环境优势与体外（in vitro）环境的可控性，为生理学研究提供了一种额外的工具。此外，在更深入理解韧带发育的基础上，组织工程技术还可能在需要手术重建时提供移植物来源6。因此，本文所述方法验证了一种可用于研究韧带功能与形态的体外（in vitro）三维工程化组织。
基于纤维蛋白的肌腱或韧带构建物已被用作一种 体外 研究包括胶原蛋白原纤维形成在内的生理过程的模型7 和肌腱发育8以及在转化应用中，已利用绵羊前交叉韧带（ACL）重建模型评估其作为移植组织的效用9我们实验室先前已建立一种三维工程化韧带模型，该模型跨越两个由磷酸钙类骨替代材料——磷酸二钙制成的水泥锚。通过在培养基中添加不同的生物因子，可轻松地对该模型施加多种实验条件。10 或施加机械刺激11重要的是，这种骨-骨韧带模型可用于深入分析止点（enthesis），即骨组织与肌腱成分之间的界面，该部位易受损伤。
在本研究中重点强调1 在此介绍该方法时，我们关注运动引起的生化微环境变化对韧带功能的影响。运动可改善全身多种组织的细胞和器官功能。2,3,12，这一效应可能归因于多种已知因子的释放（例如，IL-6）13, IL-1514，Meteorin样15，外泌体16,17），以及其他释放到全身循环中的未知生化因子。此外，运动后的生化环境富含对运动有响应的激素，这些激素的释放由交感神经系统对分泌腺的刺激所引发。例如皮质醇和肾上腺素类物质（儿茶酚胺）来自肾上腺18，以及由腺垂体分泌的生长激素19）。然而，in 体内，无法区分运动的机械刺激效应与运动诱导的生化变化。尽管一些研究已如上所述，描述了运动后某些循环激素和细胞因子的预期升高，但存在太多已知和未知的因素，难以真实重现 体外 即，分离出少数几个因素进行 体外 该研究未能充分涵盖生化反应的复杂性。在本研究中，我们探讨了由运动引发的血清生化环境变化如何影响工程化韧带的功能。为分离生化变化的独立效应，我们采集了人类受试者在进行一次抗阻运动前后血清，并将其用于处理由人前交叉韧带（ACL）成纤维细胞构建的三维工程化韧带。利用该模型，我们可获得包括对力学性能和胶原含量影响在内的功能数据，并量化分子信号通路的变化效应。

<table><tbody><tr><td>Austerlitz 昆虫针，微细不锈钢，0.20 号</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>用于磷酸八钙水泥锚</td></tr><tr><td>&amp;beta;-磷酸三钙</td><td>Plasma Biotal Ltd (德比郡，英国)</td><td>N/A</td><td>用于磷酸八钙水泥锚</td></tr><tr><td>正磷酸，85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>用于磷酸八钙水泥锚</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>用于磷酸八钙水泥锚</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm 组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>用于硅胶涂层板</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>用于硅胶涂层板</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>用于细胞分离与扩增</td></tr><tr><td>100× 抗生素/抗真菌素溶液</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>100× 青霉素/链霉素溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>Steriflip-GP，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m 孔径，聚醚砜，γ 射线灭菌</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>用于试剂灭菌</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基，含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>用于细胞与组织培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>组织消化培养基和生长培养基的组分</td></tr><tr><td>青霉素 G 钾盐</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>生长培养基组分。溶于水至 100,000 U/mL，过滤灭菌，分装，-20&amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>CELLSTAR 聚苯乙烯组织培养皿 (145 mm × 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>用于细胞分离</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>用于细胞培养。用 PBS 稀释至 0.05%</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>用于细胞冻存培养基</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 红色塑料采血管，10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>用于人血清采集</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IV 导管，22 G × 1 英寸针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>用于人血清采集</td></tr><tr><td>凝血酶，牛源</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>用于工程化韧带形成。在高糖 DMEM 培养基中溶解至 200 U/mL。0.22 &amp;mu;m 过滤，分装，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>纤维蛋白原，牛源</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>用于工程化韧带形成。在高糖 DMEM 培养基中溶解至 20 mg/mL。0.22 &amp;mu;m 过滤，分装，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>抑肽酶，牛肺来源</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>用于工程化韧带形成。溶于水至 10 mg/mL。0.22 &amp;mu;m 过滤，分装，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>6-氨基己酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>用于工程化韧带形成。溶于水至 0.1 g/mL。0.22 &amp;mu;m 过滤，分装，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>饲液培养基组分。在高糖 DMEM 培养基中溶解至 50 mM 浓度。0.22 &amp;mu;m 过滤，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>饲液培养基组分。在 PBS 中溶解至 50 mM 浓度。0.22 &amp;mu;m 过滤，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>转化生长因子-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>饲液培养基组分。按生产商说明重悬至 10 &amp;mu;g/mL 浓度。分装，-20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Stericup-GP，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m，聚醚砜，250&amp;nbsp;mL，辐射灭菌</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>用于试剂灭菌</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>用水稀释至 6 M</td></tr><tr><td>4-二甲氨基苯甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>氯胺-T 三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>反式-4-羟基-L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>1-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>无水甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr><tr><td>Corning Costar 透明聚苯乙烯 96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>用于羟脯氨酸测定</td></tr></tbody></table>

利用运动训练后血清处理韧带类组织：一种可转化的组织工程模型

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

体外实验对于理解生物学机制至关重要；然而，单层组织培养与人体生理之间存在较大差距，研究结果的转化效果往往不佳。因此，有必要探索替代性的实验方法。本文介绍了一种方法：从人体前交叉韧带组织残余中分离人源细胞，在培养中扩增，并用于构建工程化韧带。运动可改变血液中的生化环境，从而改善多种组织、器官及生理过程的功能。在本实验中，工程韧带构建物的培养基中添加了经运动“条件化”处理的人体血清。因此，该干预手段具有更高的生物学相关性，因为实验组织暴露于完整的内源性生化环境之中，包括可能与目标未知因子活性同步变化的结合蛋白和其他辅助化合物。处理后，可对工程化韧带进行力学功能、胶原含量、形态学以及细胞生化特性的分析。总体而言，相较于传统的单层培养和动物模型，本文所提出的韧带组织生理模型具有四大主要优势。第一，韧带构建物为三维结构，可定量评估其力学性能（即功能），如极限抗拉应力、最大抗拉载荷和弹性模量。第二，可在功能背景下详细研究骨与肌腱连接处的界面——即附着点（enthesis）。第三，使用运动后血清制备培养基，可无偏倚地探究运动诱导的生化环境变化——这正是运动带来广泛健康益处的关键所在。最后，该实验模型以人道且符合伦理的方式推动科学研究，替代了动物使用，符合美国国立卫生研究院（NIH）、疾病控制与预防中心（CDC）以及食品药品监督管理局（FDA）的核心要求。

工程化韧带形成及实验干预概述
图1展示了工程化韧带形成的总体流程。磷酸钙骨水泥（一种骨替代材料）22通过将正磷酸/柠檬酸溶液与β-磷酸三钙在圆柱形孔中混合制备而成。或者，在不直接测量组织力学性能的情况下，可使用3-0丝线作为组织形成的锚定点。将丝线固定在相距12 mm的硅化涂层35 mm培养皿中，并通过浸泡于70%乙醇中进行灭菌。成纤维细胞从前交叉韧带重建手术中获取的前交叉韧带残余组织中分离得到。细胞扩增后，将2.5 × 105个细胞包埋于刷酸钙骨水泥锚定点固定的培养皿中形成的纤维蛋白凝胶内。形成后，可对韧带构建物进行力学性能、胶原含量、细胞增殖、基因表达、蛋白质水平及组织形态学等方面的检测分析。
在培养过程中，细胞收缩纤维蛋白凝胶，并在两个锚定点之间形成线性组织（图2A）。培养1-2天后，细胞已附着于纤维蛋白凝胶，伸出细胞突起，并开始施加牵引力（图2B）。随着细胞产生的牵引力收缩纤维蛋白凝胶，并通过细胞酶将其降解，两个锚定点之间产生张力，细胞沿此轴线平行排列（图2B），并开始沉积胶原蛋白。培养4-5天后，构建物在锚定点周围收缩，形成线性的圆柱状组织（图2A）；此时可对体系施加外部刺激（在此时间点进行干预可避免干扰线性组织的形成过程）。干预措施可包括在培养基中添加人或动物血清、外源性细胞因子和生长因子、施加机械刺激，或改变氧张力等其他环境因素。使用添加了200 µM抗坏血酸、50 µM L-脯氨酸和5 ng/mL TGF-β1的生长培养基（DMEM含10% FBS和100 U/mL青霉素），我们发现细胞增殖可持续整个为期2周的培养周期（图2C）；事实上，光学显微镜显示，培养14天时组织致密，细胞高度有序排列（图2B）。
工程化韧带的评估
培养期结束后，可采用多种方法对工程化韧带进行评估。该系统的一个主要优势在于能够通过力学测试来确定组织的功能性变化，这对于具有力学功能的天然韧带而言至关重要。可采用单轴拉伸试验测定包括最大断裂载荷、极限抗拉强度和杨氏模量在内的力学性能。此外，还可通过应力松弛试验和蠕变试验测量其黏弹性特性。图3A展示了在自制的单轴拉伸测试仪中，工程化韧带被固定在反向模制夹具中的示意图。右侧夹具连接至力传感器，用于在组织被拉伸至断裂过程中测量其承受的载荷。图3B显示了一次典型断裂试验的代表性应力-应变曲线。完成力学测试后，相同的样品可经干燥处理，用于羟脯氨酸测定23，以评估总胶原含量，也可进行其他生化分析。若每组实验条件具备足够数量的额外样本，则可对实验干预措施进行系统评估，包括其对细胞增殖、基因与蛋白表达以及组织学形态的影响。尽管14天是本研究常用的终点时间点，但工程化韧带的力学性能和胶原含量在培养至28天时仍持续改善，如图3C所示，且可在体外培养中存活至少3个月24。
供体差异性是实验可重复性的重要考虑因素。 图4 展示了李等人报道的一个代表性实验 等25 比较7名不同的前交叉韧带（ACL）供体（n = 3名男性，n = 4名女性），这些供体在前述补充培养基中培养2周后表现出典型的拉伸性能和胶原含量。使用来源相似的ACL组织、供体年龄、损伤后时间、性别等因素的细胞，所构建的工程化韧带在不同供体之间表现出较低的变异性，且男性与女性供体之间的特性相似，仅胶原组分存在差异。在上述研究中，工程化韧带被用作一种 体外 用于研究女性为何比男性具有显著更高的前交叉韧带（ACL）损伤风险，并证明从女性供体分离的ACL成纤维细胞在本质上并不会形成更弱且胶原含量更低的工程化韧带25.
运动后血清环境对 体外 韧带功能
我们先前已证明，工程化韧带可用于研究生理过程1,25。在West等人报道的以下代表性实验中1，我们确定了运动对韧带功能的生化影响，并在此突出介绍其方法与研究结果。我们使用人前交叉韧带（ACL）细胞构建工程化韧带，并在培养第7天施加干预措施，即用采集自人体运动前后血清所制备的条件培养基进行培养。简言之，我们招募了健康的年轻男性受试者，在一次急性抗阻运动前后采集血液样本，该运动可升高循环中的激素和细胞因子水平，包括人生长激素（GH）。从运动前和运动后的血液样本中分离人血清，并在工程化韧带培养的第二周中替代胎牛血清加入培养基中（图5A）。采用ELISA法分析运动前后血清样本中GH和胰岛素样生长因子1（IGF-1）的浓度变化，这些因子的浓度可因运动而改变（图5B）。该信息用于将血清对工程化韧带的影响与运动引起的血清成分变化相关联。经过14天的培养后，通过力学测试和羟脯氨酸测定法评估韧带构建物的胶原含量，结果显示，与运动前血清相比，运动后血清显著提高了最大抗张载荷和胶原含量。为了评估这一效应是否与运动诱导释放的GH或IGF-1有关，我们在另一项独立实验中构建工程化韧带，并分别给予不同浓度的人重组GH或IGF-1处理。有趣的是，尽管血液中GH水平在运动后升高（图5B-i），但在培养基中逐步增加重组GH浓度并未提高工程化韧带的胶原含量（图5D-i）或力学性能（数据未显示）。相反，血清IGF-1水平在运动后并未升高，但剂量-效应实验表明，提高培养基中IGF-1浓度可改善韧带构建物的胶原含量（图4D-ii）。因此，尽管运动确实导致运动后GH水平显著升高，但使用rhGH进行的剂量-效应实验提示GH可能并非直接介导工程化韧带表型增强的因素（至少单独22 kDa亚型似乎不具此作用）。相反，尽管运动后15分钟血清IGF-1水平未发生变化，但在广泛浓度范围内测试rhIGF-1发现IGF-1能够提升胶原含量；然而需指出的是，当rhIGF-1浓度在估计的生理水平范围内递增时，并未显著增加胶原含量。因此，运动后独特的血清环境对于改善工程化韧带的力学性能和胶原含量具有重要意义。
在本研究中1，由于伦理方面的考虑，实验所用血清的体积有限；因此，采用了对血清需求较低的短期二维生物测定法，以进一步探究导致胶原蛋白增加的分子机制。前交叉韧带（ACL）成纤维细胞在6孔板中培养至融合，分别用静息状态或运动后血清处理1小时，并与重组GH、IGF-1、TGF-β1的剂量反应进行比较，同时检测PI3K/mTORC1、ERK1/2和Smad信号通路中靶点的激活情况。在运动后血清存在的情况下，PI3K/mTORC1和ERK1/2通路的激活程度更高，分别通过S6K的磷酸化（图5D-i）和ERK1/2的磷酸化（图5D-ii）进行评估。与激素和细胞因子的剂量反应相比，尽管GH对mTOR信号通路有轻微的促进作用（图5D-i），IGF-1在最低剂量下也表现出促进作用，但GH、IGF-1和TGF-β1这三种处理均无法解释PI3K/mTORC1和ERK1/2信号通路的增强。综上所述，我们的三维工程化韧带模型和二维生物测定数据表明，运动后血清环境可通过激活PI3K/mTORC1和ERK1/2通路，改善工程化韧带的功能和胶原蛋白含量。
综上所述，通过使用工程化韧带模型结合运动后条件培养血清，我们能够：i）研究运动后血清环境对工程化韧带功能及胶原蛋白的影响；ii）将韧带表型的变化与血清激素浓度的变化进行关联，以确定血清中哪些变化导致了工程化韧带的改变；以及 iii）通过使用二维生物测定法进一步拓展研究范围，探究血清生化微环境中作用的分子靶点，从而明确运动后血清激活的、可改善韧带功能的分子机制。
<img alt="成纤维细胞收缩过程示意图，展示培养、凝胶包埋及胶原含量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：工程化韧带的构建与应用概述。 将磷酸二钙水泥锚钉制备成型，并固定于硅胶包被的板上。从前交叉韧带（ACL）残余组织中分离并扩增原代成纤维细胞。通过将成纤维细胞包埋于两个磷酸二钙水泥锚钉之间的纤维蛋白凝胶中，形成工程化韧带。工程化韧带在体外培养，并根据需要施加特定的化学或机械刺激（例如，通过生物反应器）。在预定的时间点，可收集工程化韧带，用于检测其力学性能、基因表达、胶原含量、蛋白质表达及组织学特征。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌菌落在琼脂上的延时生长、显微图像分析、DNA 定量图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 原代韧带成纤维细胞在两个磷酸氢钙水泥锚定点之间形成基于纤维蛋白的骨-骨工程化韧带。 (A随着时间的推移，成纤维细胞收缩围绕在磷酸氢钙水泥锚周围的纤维蛋白凝胶，形成线性组织。B在最初三天内，细胞附着于纤维蛋白凝胶并施加牵引力，使细胞沿构建物的长轴方向排列。经过14天，细胞形成高度有序的组织。比例尺 = 160 µm. (C工程化韧带的DNA含量在培养的14天内随着细胞增殖持续增加。数据以均值±标准差表示，每组包含3-4个构建物。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="机械测试装置及显示抗拉强度、最大拉伸载荷、模量和胶原蛋白含量的条形图的应力-应变曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：随时间推移，工程化韧带的力学性能和胶原蛋白含量逐步改善。（A）对韧带构建物进行单轴拉伸测试，以评估特定干预措施对韧带功能的影响。如图所示，两个反向模制的3D打印夹具固定形状互补的锚块，工程化肌腱跨越于锚块之间。锚块连接至步进电机和力传感器，从而生成被测组织的应力-应变曲线，进而确定其力学性能。（B）工程化韧带拉伸至断裂的代表性应力-应变曲线。在28天的过程中，（C）极限抗拉强度（UTS）、（D）最大拉伸载荷（MTL）、（E）杨氏模量以及（F）胶原蛋白比例持续提升。数据以均值±标准差表示，每组n = 5个构建物。*表示与其他所有组相比具有显著差异。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="按性别划分的肌肉指标比较柱状图；MTL、CSA、UTS、模量、胶原蛋白、占比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：工程化韧带可评估其功能性和生化成分，显示出较低的供体间变异性。 工程化韧带来自7名不同供体（n = 3 名男性，n = 4 名女性）。培养2周后，检测其在（A）最大拉伸载荷、（B）极限拉伸强度（UTS）、（C）杨氏模量、（D）横截面积（CSA）、（E）每构建体总胶原蛋白含量以及（F）胶原蛋白占干重比例方面的差异。数据以均值±标准差表示，统计学显著性采用Student t检验分析。* 表示与其他组相比具有显著差异（p &lt;0.05）。该图改编自 Lee et al.25 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="运动对胶原蛋白合成的影响；注射方法；柱状图和折线图显示生长激素和胰岛素样生长因子-1数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 工程化韧带在生物干预下表现出力学和生化特性变化。 (A) 从受试者运动前（静息状态，RestTx）和运动后（ExTx）采集的血液中分离血清，并用于在培养的第二周处理工程化韧带。B(i) 通过ELISA定量检测静息和运动后血清中的人生长激素（GH）水平；(ii) 通过ELISA定量检测静息和运动后血清中的胰岛素样生长因子（IGF）-1水平。C经 ExTx 处理的工程化韧带表现出更优的（i）胶原含量和（ii）最大拉伸载荷。配对比较（RestTx 与 ExTx）的统计学显著性通过 t 检验分析，显著性水平设定为 p &lt;0.05. (D) 采用 (i) 生长激素（GH）和 (ii) 胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的剂量-反应实验，以确定这些因子在ExTx引起胶原含量变化中的可能作用。E) 采用二维生物测定法比较不同剂量的GH、RestTx和ExTx对分子信号通路靶点的影响，例如 (i) S6K 的磷酸化水平Thr389 以及 (ii) ERK1/2Thr202/Tyr204对两个以上的实验组进行统计学比较时，采用方差分析（ANOVA）和Tukey's HSD检验。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。* 表示与对照组相比具有显著性差异（p < 0.05）。 &lt;0.05），§ 表示与 150 ng/mL 和 300 ng/mL IGF-1 组相比具有显著差异。图改编自 West 等1 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们提出了一种韧带组织模型，其中三维构建物经人运动后条件化血清处理，并对其胶原含量、功能及细胞生化特性进行分析。

体外实验对于理解生物学机制至关重要；然而，单层组织培养与人体生理之间的差距较大，……

该模型的总体目标是确定运动和营养对结缔组织合成与功能的影响。该技术利用运动前后采集的人体血清处理三维组织，以研究运动对韧带和肌腱功能的影响。三维组织模型结合了体外实验可精确表征的优点，以及体内组织在功能、形态和生物化学特性方面的优势。根据文本方案预先制备硅涂层35毫米培养板后，通过将一枚微型钉置于模具中每个圆柱形孔的中心来制备锚定模具。在冰上，于塑料称量皿中按每毫升1至3克的比例将β-磷酸三钙与正磷酸柠檬酸溶液混合。使用塑料细胞刮刀剧烈搅拌水泥混合物。将水泥继续研磨混合，并用移液器将混合物注入模具中，然后以2,250 × g离心已装填的模具5分钟。离心后，让磷酸氢钙水泥锚在室温下静置过夜固化。次日早晨，从模具中取出锚体，并在每块硅涂层板上以12毫米间距固定两个锚体。用70%乙醇喷洒固定好的培养皿，使培养皿及其盖子内部均被乙醇覆盖，进行灭菌处理，然后将培养皿放入生物安全柜（BSC）中。至少30分钟后，吸除乙醇，让培养皿在生物安全柜内晾干。盖上皿盖，并将其保存在生物安全柜内，直至使用。 遵守当地生物危害法规，妥善使用和处置生物危害性材料。保持无菌条件，并在生物安全柜中进行构建物的制备操作。根据文本方案，在制备原代成纤维细胞、试剂以及带有固定二水磷酸二钙锚的硅涂层培养板后，将细胞接种于15厘米培养皿中，培养至70%汇合度。接下来，配制主混合液，每份构建物包含以下成分：681 微升细胞悬液、29 微升凝血酶、2 微升抑肽酶和 2 微升氨基己酸。充分混匀溶液后，以“8”字形模式将 714 微升主混合液加入每个固定好的孔板中，确保主混合液直接接触磷酸氢钙水泥锚的侧面。轻轻敲击每个孔板，使混合液均匀分布。最关键的步骤是形成细胞附着的纤维蛋白凝胶。确保细胞附着主混合液直接接触锚点，并轻敲培养板以使混合物均匀分布。每次处理一块培养板，以逐滴方式将286微升纤维蛋白原均匀地加入培养板表面。立即前后左右滑动培养板，使纤维蛋白原均匀分布，形成细胞包埋的纤维蛋白凝胶，然后继续处理下一块培养板。将构建物置于无菌培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育，至少孵育15分钟，以使纤维蛋白原聚合。通过在生长培养基中添加200微摩尔抗坏血酸、50微摩尔脯氨酸和5纳克/毫升TGF-β1，为每个构建物准备2毫升换液培养基。使用 2 毫升培养基覆盖每个构建物，并将构建物置于无菌培养箱中培养，条件为 37 摄氏度及 5% 二氧化碳，总培养时间为 14 天，或根据实验需求确定终点时间，每隔两天用 2 毫升新鲜培养基更换一次。为收集人血清，首先按照文本方案采集静息状态下的血液样本，随后让受试者进行符合研究目标的运动方式。图中展示的是一次持续 30 分钟的高强度抗阻运动。在运动结束后15分钟采集血样，待血液凝固后，以1,500 ×g离心10分钟。在无菌条件下，将血清转移至无菌管中用于培养基制备。在韧带构建体制备完成后，使用拉力测试仪在PBS溶液中进行拉伸测试，夹具采用与力传感器连接的反向模制夹头。在测试过程中，该装置用于固定磷酸氢钙水泥锚。使用数显卡尺测量韧带构建物的长度和宽度，并计算组织的横截面积。将韧带构建物从培养板上取下，将锚置入反向模制夹具中，确保构建物完全浸没在磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后调节夹具间的距离，使构建物的长度调整至其初始长度。开始测试，并以每秒0.4毫米或每秒3%的应变速率拉伸构建物直至破坏。测试完成后，按照文本方案处理组织，并对工程化韧带进行胶原定量。培养1至2天后，前交叉韧带成纤维细胞已附着于纤维蛋白凝胶，伸出细胞突起，并开始施加牵引力。在两个锚定点之间产生张力，细胞沿此轴线平行排列，并开始沉积胶原蛋白。图中显示的是韧带在拉伸至断裂时具有代表性的应力-应变曲线。在这些实验中，从运动前和运动后的血液样本中分离出人血清，并替代FBS用于制备富含运动诱导生化环境的培养基。如图所示，在经过14天的培养后，韧带构建物在运动后血清的刺激下，其最大抗张载荷和胶原含量均显著增加。一旦掌握该技术，韧带构建物可在两天内制备完成，并在两周后即可用于抗张强度测试、胶原含量定量以及其他生化分析。这种可转化的体外-体内模型，是更广泛研究目标的一部分，旨在阐明运动如何改善韧带、肌腱乃至体内几乎所有组织的功能。因此，这是一种非常可靠且有效的方法，可用于评估在运动、营养、负荷、各类生长因子以及其他各种针对人类或动物的干预措施处理后，胶原蛋白含量和结缔组织功能的变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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