Name: 在中短肛解剖，显微扫描和分析形态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 了解小鼠阴茎骨的解剖与显微CT扫描方法，利用半地标点进行三维形态测量分析。该技术可量化复杂生物结构的大小与形状变异，为缺乏明确地标点的结构提供可重复的测量方案。

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在早期阶段，Tim Daley 和 Andrew Smith 提供了许多有益的计算讨论；Tim Daley 编写了协议 5 所需的程序 rotate_translate_cylindrical。计算资源由南加州大学高性能计算集群提供。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目 #GM098536（MDD）支持。

所有实验操作和相关人员均经南加州大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，方案编号 #11394。
1. 阴茎骨解剖与制备
<ol>
	<li>根据相关机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的规程，通过过量二氧化碳处死一只性成熟的雄性小鼠。</li>
	<li>将动物仰卧放置，并用拇指在包皮开口两侧施加压力，使阴茎外伸。</li>
	<li>阴茎外伸后，尽可能将组织从包皮中拉出并伸展。</li>
	<li>使用剪刀在阴茎体靠近阴茎头的部位剪断，该位置为阴茎骨所在处。</li>
	<li>将解剖出的阴茎转移至一个1.7 mL离心管中，并加入200 µL自来水。确保阴茎完全浸没于液体中。</li>
	<li>将组织在约50 °C的水中孵育3至5天。</li>
	<li>适当孵育后，在解剖显微镜下用镊子去除阴茎骨周围的组织。轻轻喷射70%乙醇以清除残留组织并清洁骨骼。</li>
	<li>将解剖好的阴茎骨放入一个新的微量离心管中，并保持管盖打开。过夜敞开放置以使骨骼完全干燥。</li>
</ol>
2. 显微CT扫描
<ol>
	<li>将微型CT扫描圆柱形样品架压入花艺泡沫块中，形成一个花艺泡沫圆柱体。</li>
	<li>取出花艺泡沫圆柱体，并切割成约2–5 cm厚的切片。</li>
	<li>将干燥的阴茎骨插入花艺泡沫切片的周边位置，以尽量减少扫描过程中的相互干扰。应记录骨骼的精确朝向，以便在方案4中正确识别各个样本。</li>
	<li>轻柔地将嵌有骨骼的切片放入微型CT样品架中。</li>
	<li>进行微型CT扫描。以小鼠阴茎骨为例14，我们在南加州大学分子影像中心使用uCT50扫描仪（Scanco Medical AG，Bruttisellen，瑞士），扫描参数如下：90 kVp，155 µA，0.5 mm铝滤片，每180°采集750个投影（共360°扫描），曝光时间为500 ms，体素大小为15.5 mm。</li>
</ol>
3. MicroCT 数据处理：将 .DCM 图像序列转换为单个 .xyz 文件
注意：每次微计算机断层扫描（microCT）都会生成一组 .DCM 文件，即 &#34;dicom&#34; 文件，这些文件代表穿过样品所获得的图像切片。所有后续的计算几何处理均需要平面的 .xyz 文件，该文件是一种纯文本文件，包含四列数据——每个像素的 x、y、z 坐标及其像素强度，强度范围从 -5,000（黑色）到 +5,000（白色）。通常，将像素阈值设为高于 3,000 可有效用于定义骨骼结构。
<ol>
	<li>安装 Python（www.python.org）以及 PYTHON 模块 COMMANDS、DICOM、PYLAB、SYS 和 NUMPY。</li>
	<li>使用任意文本编辑器打开 &#34;01_process_dicom.py&#34;{Figshare}。在变量部分，根据需要修改路径、像素阈值和目录名称。</li>
	<li>运行 &#34;python 01_process_dicom.py&#34;。进度信息将输出到屏幕。在步骤 3.2 中命名的每个目录内，将生成一个新文件，例如：directory_name.PT3000.xyz，其中 PT3000 表示步骤 3.2 中设定的像素阈值。</li>
</ol>
4. MicroCT 数据处理：分割出单个样本的 .xyz 文件
<ol>
	<li>安装带有 RGL 库的 R 软件（https://www.r-project.org/）。</li>
	<li>使用任意文本编辑器打开文件“02_segment_dicoms.r”{Figshare}。在“变量”部分，修改路径名称，使其指向上述方案 3 中创建的 .xyz 文件。</li>
	<li>在 R 环境中运行命令 &#34;source('02_segment_dicoms.r')&#34;（不包含双引号）。</li>
	<li>当方案 3 中生成的 .xyz 文件的三维图像出现后，输入该 .xyz 文件中包含的样本总数。然后使用滚动和缩放功能，为每个样本标记并选择相应的点。 
	注意：后台将为每个样本生成独立的 .xyz 文件。这些文件将保存在一个目录中，例如 XYZ_FILES_PT3000，其中 PT3000 表示所使用的像素阈值。</li>
</ol>
5. &#34;将&#34;样本 .xyz 文件配准至公共坐标系。
<ol>
	<li>打开 Python 脚本 &#34;03_transform.py&#34;{Figshare}，该脚本需要额外的模块 mattdean_modules.py{Figshare}，以及两个独立的应用程序：&#34;rotate_translate_cylindrical&#34;（https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform）和“qconvex”（www.qhull.org/html/qconvex.htm），这些程序将被此脚本调用。</li>
	<li>在“变量”部分，确定 mattdean_modules.py、rotate_path 和 qconvex_dir 的完整路径名。此外，确定包含在步骤 4 中生成的各个 .xyz 文件的目录的完整路径。</li>
	<li>运行 03_transform.py，该脚本将为每个样本创建一个带有 .TRANSFORMED.xyz 后缀的新文件。</li>
</ol>
6. &#34;Slicing&#34; 对齐的样本 .xyz 文件以识别半地标点。
<ol>
	<li>打开并运行 Python 脚本 &#34;04_identify_landmarks.py&#34;{Figshare}。在变量部分，确定包含 .TRANSFORMED.xyz 文件的目录的完整路径名称。该脚本可识别 802 个半标志点，可用于量化结构的大小和形状。</li>
</ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2992207">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.italian-journal-of-mammalogy.it/article/view/6292">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li>
<li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered%2C+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li>
<li>Mitteroecker, P., Gunz, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11692-009-9055-x">Advances in geometric morphometrics.</a> Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).</li>
<li>Bookstein, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landmark+methods+for+forms+without+landmarks%3A+morphometrics+of+group+differences+in+outline+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Im.+Anal%22%5BJournal%5D)">Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape.</a> Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGunz%2C+P+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).</li>
<li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1162/biot.2009.4.1.84">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li>
<li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li>
<li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li>
<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案中的关键步骤包括：1）解剖阴茎骨，2）采集显微CT图像，3）将显微CT输出结果转换为包含x-y-z坐标的平面文件，4）分割出每个样本的点云数据，5）将每个样本转换至标准化的坐标系，以及6）定义半标志点。这些步骤可根据不同研究对象进行灵活调整。
这些方法可能适用于任何基本上呈&#34;杆状&#34;或至少弯曲程度不大的物体。目前尚无法分析那些自身弯曲形成&#34;U形&#34;的物体，因为切片（图1G）会返回来自物体不同部位的点。未来可通过在切片前对物体进行计算上的拉直处理，以适应此类物体的分析。
我们提出了一种通用方法，用于从缺乏明确解剖标志点的形态中通过数学方式定义半标志点。这些通用方法已被改进，用于研究鲸类骨盆和肋骨的演化，这些骨骼具有截然不同的形态16。我们用于定义标志点的计算方法应适用于任何一组x-y-z坐标数据。由于鼠类阴茎骨尺寸较小，本研究采用了显微CT扫描14；而对于鲸类骨盆和...

形态测量学领域包含多种量化生物体大小和形状的方法，这是科学探究中的一个基本步骤1,2,3,4,5,6。传统上，对大小和形状的统计分析始于在生物结构上确定标志点，然后测量线性距离、角度和比值，这些数据可在多变量框架下进行分析。基于标志点的几何形态测量法是一种在从数据采集到分析和可视化的整个过程中保留标志点空间位置、从而保持几何信息的方法5。广义普鲁克斯特分析（Generalized Procrustes Analysis, GPA）可用于消除标志点在位置、尺度和旋转方面的变异，从而实现样本间的最佳对齐，使它们的平方差异最小化——剩余部分即为形状差异7。
任何形态测量分析的一个重要概念是同源性，即能够可靠地识别出代表生物学上有意义且离散特征的标志点，这些标志点可在不同标本或结构之间相互对应。例如，人类头骨具有同源的突起、孔洞、缝线和导管，从而能够进行形态测量分析。然而，在许多生物结构之间识别对应的标志点十分困难，尤其是那些表面光滑或呈曲面的结构8,9,10。
我们将在下文使用计算几何方法来解决这一问题。总体工作流程是：首先生成物体的三维扫描数据，将其表示为点云形式，然后对点云进行旋转和变换，使所有样本均处于同一坐标系中。接着，我们从物体的特定区域在数学上定义半标志点。在这些区域上设置的离散半标志点在生物学上是任意的11。由于任意设置的标志点可能不具备生物学同源性，因此进行广义普氏分析（GPA）及后续统计分析时可能产生不理想的伪影8,12。为此，我们允许这些半标志点在数学上&#34;滑动&#34;。该过程可最小化结构之间的潜在差异。已有研究指出，此处使用的滑动算法适用于量化那些缺乏明确对应标志点的相似解剖区域3,6,8,10,11,12。这些方法虽有其局限性13，但应可适用于不同大小和形状的物体。
本文以近期一项关于小鼠阴茎骨（baculum）的研究为例14，说明该方法的应用。阴茎骨是一种在哺乳动物进化过程中多次独立获得和丢失的骨骼结构15。我们将介绍特定骨骼——阴茎骨的解剖与制备（方案1）、显微CT图像的获取（方案2），以及将这些图像转换为可用于后续计算几何分析格式的步骤（方案3和方案4）。完成上述步骤后，每个样本将以约10万个x-y-z坐标点表示。随后，我们逐步展示一系列变换操作，有效将所有样本对齐至统一的空间方向（方案5），并从对齐后的样本中定义半标志点（semi-landmarks）（方案6）。无论分析对象为何，方案1至方案4均具有通用性。方案5和方案6虽专为阴茎骨设计，但我们希望通过对这些步骤的详细描述，研究者能够设想适用于其研究对象的相应改进方法。例如，这些方法的改进版本已被用于研究鲸类的骨盆骨和肋骨16。

<table><tbody><tr><td>解剖剪</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>大多数尺寸均可使用</td></tr><tr><td>精细尖头弯头解剖镊</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>需稀释至70%用于解剖</td></tr><tr><td> floral foam（插花泡沫）</td><td>Wholesale Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 扫描仪&amp;nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

阴茎骨的解剖、显微ct扫描及形态测量分析

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

现代形态测量学提供了强大的方法来量化大小和形状的变异。其基本要求是一组定义标志点的坐标；然而，这些坐标必须在不同样本之间代表同源结构。尽管许多生物结构包含易于识别的标志点以满足同源性假设，但仍有大量结构缺乏此类特征。一种可能的解决方案是通过数学方法在物体上放置半标志点，以代表不同样本间相同的形态区域。本文展示了一种近期开发的流程，用于从小鼠阴茎骨（baculum）上数学定义半标志点。我们的方法应适用于多种类型的物体。

在方案6中生成的半标志点的x-y-z坐标可直接导入任何基于标志点的几何形态测量学分析17。上述计算流程已应用于小鼠阴茎骨14以及鲸类骨盆和肋骨16的研究。本文进一步提供了关于半标志点计算定义的更多细节，旨在帮助研究人员直观理解可能需要调整以适应其特定研究对象的操作步骤。阴茎骨具有多个独特特征，我们利用这些特征实现了某些变换的自动化。例如，在计算机中沿近端-远端轴将骨骼切割为两半后，我们仅通过比较两部分的总点数即可确定近端部分（近端点数更多）。只要研究对象存在类似的独特特征，我们的方法就应具有良好的适应性。此外，需要强调的是，我们通过实验确定了某些阈值参数（例如“近端10%”），这些参数在我们的阴茎骨研究中表现良好，但对于其他研究对象则必须重新评估。
从第5个实验方案开始，第一个计算步骤是计算凸包（即包含样本中所...

许多生物结构缺乏易于定义的解剖标志点，使得现代形态测量学方法难以应用。本文以小鼠阴茎骨（baculum）为例，介绍其研究方法，包括解剖与显微CT扫描，随后采用计算方法定义半标志点，用于量化其大小与形状的变异。

阴茎骨的解剖、显微CT扫描及形态测量分析

现代形态测量学提供了量化大小和形状变异的有力方法。基本要求是一组定义解剖标志点的坐标；

本解剖与形态测量分析的总体目标是展示我们所采用的形态测量方法在研究复杂形状结构（如小鼠阴茎骨）时的稳健性。当我们意识到现有的阴茎骨变异测量方法（例如测量长度和宽度）会完全丢失关于弯曲度和形状复杂性的信息时，便萌生了本研究的构想。因此，我们设计了此方法，以在三维空间中量化任意目标骨骼或结构的大小和形态变异。该技术的主要优势在于，它能够将现代形态测量学方法应用于缺乏明确解剖标志点的结构。这将通过提供对复杂结构的改进且可重复的测量来推动该领域的发展。将一只已处死的性成熟雄性小鼠仰卧放置，通过在包皮开口外侧施加拇指压力使阴茎外展。一旦阴茎露出，尽可能将组织从包皮中完全拉出。接下来，使用剪刀在阴茎龟头近端、阴茎骨所在的位置剪断阴茎体，取下阴茎。然后将阴茎完全浸入含有约 200 µL 自来水的微量离心管中。为软化组织，于约 50 °C 条件下孵育 3 至 5 天。组织软化可降低提取过程中骨骼断裂的风险。孵育后，使用解剖显微镜和镊子去除阴茎骨周围大部分组织。初步解剖完成后，用70%乙醇轻轻冲洗，以去除残留组织并清洁骨骼。然后将解剖出的阴茎骨放入新的微量离心管中，管盖保持打开状态，让骨骼在室温下自然干燥。首先，准备用于放置骨骼的材料，将CT扫描用的圆柱形样品 holder 压入花艺泡沫块中。然后取出形成的圆柱形泡沫，并切割成厚度在两到五厘米之间的泡沫片。现在将10至15根干燥的bacula插入单个切片边缘的花艺泡沫中，以尽量减少扫描过程中的干扰。记录骨骼的精确方向，以便后续识别。接下来，小心地将骨骼放入泡沫中，置于微型 CT 样品架内，并将样品架装入微型 CT 50 扫描仪。设置微型 CT 50 扫描仪参数如下：使用 90 千伏帕斯卡，体素尺寸为 155 埃，5 毫米铝滤光片，每 180 度采集 750 张投影图像，曝光时间为 500 毫秒。然后进行样本扫描。按照所述方案对阴茎骨进行解剖、制备并扫描。一次CT扫描中可容纳多个骨骼样本。然后使用计算几何方法对图像进行处理，具体步骤如文本方案中所述。该成像方法可适用于多种骨骼及其他感兴趣对象的研究。该分析可提供物体解剖标志点的详细信息，并具有高度自动化的特点。在分析369根阴茎骨时，该过程仅需要约10次手动调整。令人振奋的是，我们的方法可应用于多种复杂的结构。这些方法使我们能够以三维方式量化阴茎骨的大小和形状。

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