采用痕迹性眼睑经典条件反射评估胎儿酒精谱系障碍大鼠模型中的海马功能障碍

本实验的总体目标是展示如何利用痕迹性眨眼经典条件反射——一种联想学习形式——来检测胎儿酒精谱系障碍大鼠模型中的海马功能障碍。在脑发育相当于人类妊娠晚期的阶段，对新生大鼠幼崽采用类似 binge 饮酒的方式给予高剂量酒精，酒精浓度为 11.9% 体积比体积。

这种酒精暴露模式和剂量是导致整个生命过程中出现类似人类胎儿酒精谱系障碍（FASD）脑功能缺陷的关键因素。早期酒精暴露会损害的一个重要脑区是海马体。在大鼠成年后，通过痕迹性眨眼经典条件反射实验来检测其海马功能障碍。

这是一种依赖海马体完整性的高级联合学习形式。在出生后第4至第9天，每天早晨称量大鼠幼崽的体重并记录其体重数值。随后根据体重从预先印制的表格中查得相应的喂养体积。

将体积分数为11.9%的酒精溶液分两次喂食大鼠幼崽，两次喂食间隔2小时。酒精的总日剂量为每日每千克体重5.25克。该 binge 暴露范式在每次喂食时向每克体重提供0.278毫升酒精（以牛奶溶液形式）。

用无菌的一毫升注射器抽取含有酒精的牛奶，然后推出多余的溶液以获得所需的准确体积。将PE-10管的管尖浸入新鲜的玉米油中。

这有助于插入。测量PE-10管从幼鼠口腔至胃部的长度。如有必要，调整PE-50堵头作为停止点的视觉参考。

小心地将PE-10导管插入幼鼠口中。当导管尖端到达咽喉时，通常会遇到一定阻力。调整导管方向，直至其尖端弯入食管入口。

尽量避免让导管向后滑动，因其可能因油而变得湿滑。继续将导管沿食道推进，当管尖通过胃食管括约肌后，便会进入胃内。到达此处时停止推进，固定注射泵，然后注入溶液。

应以缓慢的速度进行。小心移除PE-10导管，检查幼鼠是否有液体反流、出血或物理损伤。若幼鼠状态良好，将其放回同窝幼鼠中。

请参阅书面方案和材料清单，了解眼睑手术过程中所用的具体仪器。使用经批准的消毒剂对手术区域进行消毒，并提前将所有手术器械和用品进行高压灭菌。用异氟烷对大鼠实施适当的麻醉后，使用毛发修剪器剃除其头部毛发，暴露足够面积的皮肤以供切口部位及左眼眼睑操作。

用70%异丙醇和聚维酮碘进行三次交替擦拭，对皮肤进行消毒。按照标准操作程序，使用耳杆将大鼠固定在立体定位仪上。当大鼠达到适当的麻醉水平时，开始手术。

使用手术刀片在中线处进行从前到后的切口。该切口应暴露眼睛前方足够的区域，并略微延伸至人字缝线后方。使用手术刀片小心刮除颅骨顶部的骨膜，注意避免引起过度出血。

用棉签擦去多余的结缔组织和血液，每次刮取之间用无菌生理盐水冲洗区域。从一侧顶骨冠状缝正后方开始钻孔。用棉签清除任何血液和骨碎片。

使用分体镊子夹取一颗 0 80 螺钉。使用钟表起子将螺钉固定到孔中，拧紧螺钉至刚好固定而不损伤大脑皮层组织，通常拧三到四整圈即可。按照相同步骤固定其余螺钉。

应在冠状缝后方双侧各固定一个螺钉，并在右侧顶骨、人字缝前方固定一个螺钉。用4英寸敷料镊夹住其左眼切口处上方的皮肤，将3英寸敷料镊指向该眼角。取一根26号、3/8英寸的针头，从眼睑角落处刺入。

将针头旋转，使斜面朝上。在眼睑中部插入第二根针头。用精细镊子夹住一根3T导线，并将其插入其中一根针头中。

无需完全插入。对第二根3T导线采用相同的步骤。一只手握住两根针，另一只手握住头架。

连续地将针头从眼睑处向外牵拉，同时朝相同方向引导头期装置。用一只手握住肌电图（EMG）头期装置，另一只手使用3英寸敷料镊子，将10T导线缠绕至右侧一个或两个螺钉上。将导线妥善收好，使其不从螺钉处突出。

应在进入下一步之前将肌电图前置放大器头端居中。使用4英寸敷料镊，通过分离皮肤（即浅筋膜）与颞肌，创建一个小的皮下囊袋。形成囊袋后，使用虹膜剪进一步剪除结缔组织，向左眼内侧眼角方向分离。

注意不要插入过深或切断任何血管。取一个双极电极，将导线引脚塑形，使其能够贴合颞肌的弧度。两个电极尖端将位于左眼后方，双极电极的底端将垂直置于颅骨顶部。

将Ortho Jet粉末与液体成分混合，直至形成液态稠度。使用微型刮刀将糊状物涂抹于切口周围区域。注意避免将任何糊状物滴入大鼠眼睛，并确保其不外溢。

让 Ortho Jet 达到半干状态，然后使用眼科镊子清除 EMG 头部固定装置上的多余丙烯酸材料以及双极电极的螺纹部分。剪去多余的 3T 导线，保留几厘米用于后续操作。

使用显微解剖镊子小心地从每根3T导线上移除聚四氟乙烯（PTFE）屏蔽层。这将使导线能够与眼轮匝肌接触。使用显微解剖镊子在每根3T导线的两端弯成钩状。

剪去多余的导线，注意不要剪得过多，以免剩余导线缩回眼睑内部。导线由本实验室自制。先连接白色双极插头，用于传递超声刺激信号。

随后连接橙色的EMG头部插件。该插件可记录大鼠眨眼时的肌电活动。两个插件均连接至机械臂顶部的一个圆形换向器，当大鼠自由活动时，该换向器可保持信号的连续性。

打开刺激隔离器并进行最终的硬件检查。这包括将肌电图（EMG）基线调整至计算机屏幕上可观察的水平。在第一次实验中，刺激电流强度首先设定为4毫安，并且每两次试验后以4毫安为单位逐步增加。

这种逐步引入的程序使大鼠能够适应电击刺激。到第八次试验时，电击强度在本实验阶段及所有后续阶段均维持在 1.6 毫安。另一台计算机运行四通道数字示波器，使我们能够进行实时信号诊断。

注意第一只箱子中大鼠发出的眼睑眨动。示波器还显示，基础肌电图（EMG）信号相对干净，噪声较低。网络摄像头也使我们能够同时监测每只大鼠。

这是 blink 软件 4.0 版本的截图，显示一次持续 1400 毫秒的试验时段。在最初的 280 毫秒内，不呈现任何刺激，以获取基线 EMG 活动的测量值。黄色线表示阈值线，任何超过平均预条件刺激（pre-CS）基线值 4 伏特以上的 EMG 反应，将被判定为眨眼反应。

85分贝的条件声音刺激在280毫秒时间点呈现。该声音持续380毫秒，至660毫秒时间点结束。声音结束后，有500毫秒的无刺激间隔期，此阶段称为痕迹期（trace period），在此期间，大鼠需将条件刺激（CS）声音的终止与尚未出现的非条件刺激（US）足底电击的起始（将在1160毫秒时间点施加）进行关联。

电击无条件刺激持续100毫秒。该电击无条件刺激会自然引发一种防御性眨眼反应，称为无条件反应（UR），其测量时间窗为140毫秒。一次训练包含100个试验。

共有90次试验将条件刺激（CS）与非条件刺激（US）配对呈现，每第10次试验仅呈现条件刺激（CS）。每次实验包含10次仅呈现条件刺激（CS）的试验。这些试验使我们能够检测是否已习得条件刺激与非条件刺激之间的关联。

条件反应（CR）表现为在未呈现电击非条件刺激（US）时出现的反应。两次试验之间的间隔时间平均为30秒，以确保每次试验的开始时间不可预测。在任一次试验中，大鼠可能在任意时间点眨眼，其肌电图（EMG）将由软件记录。

任何超过阈值线的独立眨眼动作，将根据其发生的时间和试验阶段被归为四类反应之一。如果大鼠在条件刺激（CS）声音开始后的前80毫秒内眨眼，则该反应被视为惊吓反应（SR）。这是一种非关联性反应，反映的是感觉运动功能，而非对CS与US之间关联的学习本身。如果眨眼发生在惊吓反应期之后、但在电击非条件刺激（US）呈现之前，则被视为条件化反应。

如前所述，条件反应（CR）是衡量联想学习的主要指标。在训练的早期阶段，预期不会出现条件反应（CR）；但随着训练的进行，经过多次试验和训练 session 后，这类反应会变得更加频繁、幅度更高，且可能出现更精确的时间控制。我们将条件反应（CR）分为两种类型：总条件反应（total CRs）和适应性条件反应（adaptive CRs）。

总体条件反应（CRs）反映了一般的学习能力，而适应性条件反应（CRs）则反映了动物能够良好地定时眨眼的能力。作为一种自我保护的准备动作，适应性条件反应发生在刺激（US）出现前200毫秒。在海马体完整的哺乳动物中，适应性条件反应的表达反映了海马体在精确协调两种刺激呈现时间关系中的高级参与作用。

从本质上讲，痕迹型眨眼经典条件反射比延迟型眨眼经典条件反射更难建立，因为在后者中，条件刺激（CS）声音与非条件刺激（US）电击在时间上是重叠的。尽管条件反应（CR）的表达可能因个体而异，并受到特定脑回路功能障碍的显著影响，但在每一次配对的CS-US试验中都应出现非条件反应（UR）。因此，这一指标反映的是感觉运动功能，与惊吓反应类似，本身并不能表明对CS-US关联的学习。

在接下来的系列视频片段中，您将看到软件的设置过程以及眨眼训练的开始。眨眼训练软件被激活后，将调用两个相关文件：一个包含受试对象数据的大鼠文件，以及一个用于时序性眨眼条件反射的文件。

该程序在训练开始前已设置就绪。当训练开始时，请注意屏幕右下角有一个倒计时计时器，用于提示下一次试验的时间。以下为第一次实验第15次试验的实时视频记录，其中出现了非条件反应（UR），但尚未形成任何条件反应（CR）。

以下是以三分之一速度播放的回放。在接下来的一系列片段中，您将看到同一只未插管的对照组大鼠在六次训练过程中逐步进展的截图。该大鼠最终产生了完整的条件反应（CRs）以及适应性条件反应（adaptive CRs）。

这是第六次训练 session 第 96 次试验的实时视频片段，其中出现了两次眨眼，一次为适应性条件反应（CR），另一次为非条件反应（UR）。以下是以原速度三分之一回放的视频。在最后一个片段中，您将看到一只经酒精插管处理的大鼠在第六次训练 session 的最后一次试验中的实时视频，该次试验仅为条件刺激（CS）单独呈现的试验；即使经过 600 次训练，它仍未能稳定地产生适应性条件反应（CR）。数据采集完成后，会通过内置的异常值检测算法，筛选出包含高噪声伪迹以及条件刺激前异常基础肌电活动（EMG）的无效试验。

保留的优质试验将进一步分析条件反应（SRs）、非条件反应（URs）、总条件反应（CRs）以及适应性条件反应（adaptive CRs）在反应百分比、幅度、潜伏期及其他关键指标方面的表现。本组结果展示了训练六次会话中适应性条件反应的平均值。从第二次到第六次会话，酒精插管组与两个对照组在反应百分比和幅度指标上的差异均具有统计学意义。

这表明，在早期发育阶段接触酒精的大鼠，其适应性条件反应的频率和强度均受到损害。第二组结果展示了非条件反应的平均值。各组之间的频率和振幅测量值在统计学上均无显著差异。

这些结果表明，早期酒精暴露并未损害大鼠对非条件刺激产生眨眼反应的能力，其表现出的缺陷源于在习得过程中无法正确建立条件刺激与非条件刺激之间的关联。在本实验中，我们通过检测发育期类似暴饮模式的酒精暴露是否会影响海马功能，进而导致痕迹型眨眼经典条件反射的缺陷，以此探讨脑功能与行为之间的关系。事实上，眨眼经典条件反射是评估脑发育期间酒精暴露所引发神经行为后果的有效工具。

它具有很高的灵活性，通过改变刺激参数或联合学习要求，还可以评估海马体外不同脑系统的功能完整性。观看本视频后，您应能充分理解向新生大鼠幼崽给予酒精、植入电极以及实施眨眼测试过程中的各项复杂操作。感谢您观看本视频。