Name: 使用的跟踪经典条件反射，评估胎儿酒精谱系障碍大鼠模型海马功能障碍 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 57 s
Description: 学习使用痕迹眨眼经典条件反射技术评估胎儿酒精谱系障碍大鼠模型的海马功能障碍。该方法通过检测成年大鼠的联想学习能力，为早期酒精暴露导致的神经发育损伤提供可靠的诊断工具。

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本工作获得了酒精饮料医学研究基金会（ABMRF）向 TDT 提供的资助支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

在出生后第4至9天接受乙醇的新生大鼠，在成年后表现出痕迹性瞬目条件反射的损伤。这些结果支持乙醇是一种致畸物，对海马功能具有持久的有害影响。总体而言，与两个对照组大鼠相比，乙醇暴露组大鼠在痕迹性条件反射实验中的条件反应水平较低。乙醇暴露大鼠的联想学习缺陷不受动机或运动功能差异的影响（即，对电刺激无条件刺激强度的眨眼反应无差异）。
尽管痕迹型眨眼经典条件反射（ECC）是阐明由挑战诱发的海马神经病理学的有用诊断工具，但对该方法所得结果的解读必须置于恰当的背景中。首先，本实验中的关键操作步骤包括：在发育中大脑已知的易损窗口期（出生后第4-9天）靶向给予乙醇、制备可记录肌电活动并传递电刺激的电极装置、上述装置的外科植入，以及随后使用评估特定认知功能的学习范式对动物进行测试。在整个过程中，每个阶段都必须注意避免对实验大鼠造成不必要的或非预期的伤害，并定期监测其健康状况。动物的行为结果为认知功能提供了“窗口”，而认知是一种心理构念，只有在动物健康未因实验误差（如乙醇给药剂量不当、装置缺陷或手术植入问题）而受损的情况下，才能被准确描述。因此，研究过程中的每一个操作环节都必须严谨实施，以确保ECC结果能够合理外推至人类。其次，ECC范式可揭示联想学习的本质，但必须注意不可将由此获得的发现泛化并广泛归因于其他认知领域——例如工作记忆、短时/长时记忆以及意识——除非实验设计中已明确纳入了这些认知领域的某些方面。例如，本实验仅考察了痕迹型ECC学习的获得阶段，而未评估大鼠在完成训练后的记忆保持能力。因此，记忆是一个独立的心理过程，应与学习能力一同进行评估。通过实验设计，可引入记忆保持间隔，以评估短时或长时记忆能力。第三，必须认识到存在多个并行的记忆系统54，这些系统可能与动机、经验及激素因素共同作用影响行为。理解这一点对于明确“关联性”（在ECC过程中）仅仅是揭示学习“优劣”的众多过程之一至关重要。最后，痕迹型ECC并非完全依赖于海马的功能，因为其他脑区也可能介导条件反应（CR）的某些成分。因此，在基于离散结果进行推论时，必须考虑不同神经回路之间的相互作用，以及研究中所使用的刺激参数类型。例如，小脑也参与痕迹型ECC，影响CR的拓扑特征和反应时序，尤其是在刺激间间隔（ISI）较短的情况下。在人类中，若使用较长的痕迹间隔（1,000 ms）进行测试，小脑损伤患者的表现不受影响；但若使用较短的痕迹间隔（400 ms），则表现会受到影响34。此外，在小鼠中，针对前扣带回和内侧无颗粒皮层区域的双侧背内侧前额叶皮层（mPFC）损毁会阻碍痕迹型CR的获得55；而在兔中损毁尾部mPFC也会产生类似结果46。这些发现进一步强调了在评估如痕迹型ECC这类由小脑-脑干驱动的联想学习时，需考虑不同物种间前额叶贡献的差异性。尽管在本研究及其他研究中，出生后第4-9天的新生儿期乙醇暴露对成年大鼠获得500 ms痕迹型CR产生了不利影响47,56，但在经历300 ms痕迹间隔的新生儿期乙醇暴露大鼠中并未观察到相同情况，即使其接受相对高剂量的乙醇（5 g/kg）挑战时也是如此57，这表明乙醇暴露大鼠的痕迹型学习障碍依赖于痕迹间隔的持续时间。
本研究强调海马在介导痕迹性眨眼经典条件反射（trace ECC）中的关键作用；当受到新生期酒精暴露的挑战时，海马会表现出与神经损伤相关的功能障碍，反映为痕迹性条件反应（CR）习得能力的受损。然而必须指出，小脑-脑干神经回路，特别是中间位核（interpositus nucleus），对于包括痕迹性ECC在内的多种ECC任务的多个方面均至关重要，包括条件反应的习得、表达及其拓扑特征36,40,55,58,59。事实上，该神经回路会与海马相互作用，共同驱动高级形式ECC（如痕迹性ECC）中条件反应的表达60。目前尚不完全明确早期脑发育阶段的酒精暴露是否特异性影响痕迹性ECC中的海马功能。许多不同的脑区均易受早期酒精损伤的影响，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、小脑和海马18,19,23,47,61,62，酒精极有可能以不同程度干扰这些脑结构的功能，并在多种ECC程序中导致具有重要功能差异的表现。尽管在解释痕迹性ECC研究结果时存在诸多局限，但已有动物损毁研究证实，成功习得痕迹性条件反应至少依赖于结构完整的海马42,44,63,64,65。因此，该方法仍是展示发育期酒精暴露与痕迹性条件反应之间关联的极具价值的手段，因为相较于其他依赖海马的任务（如Morris水迷宫中的位置学习、新物体识别以及情境性和痕迹性恐惧条件反射），其背后的神经回路机制已被更为深入地阐明。
将眼动经典条件反射（ECC）作为一种行为学方法用于“检测”认知功能，在发育神经毒理学领域具有广泛的应用价值。事实上，我们实验室近期的研究结果支持这样一个观点：发育中的海马对酒精作用高度敏感，而这种敏感性可能通过不同的干预策略得以缓解18,47。本方法的关键优势在于，通过对酒精暴露引起的痕迹型ECC学习缺陷的深入理解，可预测关联学习之外的其他海马依赖性功能障碍——特别是那些已知由相同海马神经环路介导的功能异常。
将痕迹眼动经典条件反射（trace ECC）及其其他变体（例如，延迟型、逆转型、辨别型、复合型）应用于揭示与联想学习相关的神经生物学机制和神经系统，其应用范围可超越胎儿酒精研究领域。例如，该范式在精神疾病（如精神分裂症66,67）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病68,69）以及药物成瘾70,71,72 的人类病例和动物模型中已受到广泛关注。因此，作为一种评估神经认知功能与功能障碍的研究方法，其优势在包括神经科学在内的众多心理学和生物医学学科中均显而易见。

很难想象，在当今医疗保健水平提高、医疗服务可及性增强的时代，酒精滥用仍然是一个重大的全球公共卫生问题。不幸的是，已有研究表明，怀孕期间大量饮酒的孕妇可能生下患有严重脑损伤和终身性神经发育障碍的子女，这一点在胎儿酒精综合征（FAS）患者中尤为明显1,2,3。对于有明确孕期饮酒史的女性而言，其发育中的胎儿也容易受到少量酒精或不同饮酒模式的影响，这些因素会导致血液酒精浓度出现不同程度的变化。在这种情况下，尽管儿童可能不会表现出与FAS患者相同的严重形态学或神经行为异常，但仍可能出现从轻度到重度不等的终身认知障碍和情绪障碍3,4。总体而言，FAS以及较轻程度的产前酒精相关损害共同构成了一系列被称为胎儿酒精谱系障碍（FASDs）的疾病。尽管FASDs完全可预防，但令人震惊的是，在酒精滥用较为普遍的人群中，它们仍是非遗传性神经和认知障碍的首要原因，影响约2%至5%的美国及法国、瑞典等欧洲国家的儿童。仅就美国FAS的发病率而言，其患病率为每1,000例活产婴儿中有2至7例5，这意味着FASDs的整体发病率远高于FAS本身。
针对胎儿酒精谱系障碍（FASDs）儿童开展的神经影像学研究显示，这些儿童存在脑部异常，例如胼胝体变薄6、前部小脑蚓部体积减小7以及海马体积缩小8。这些脑部异常是FASDs儿童长期存在神经认知功能障碍的部分基础。目前，母体酒精暴露所导致的脑部变化与特定神经认知损害（即损害的类型和程度）之间的具体关联尚不明确。然而，作为研究起点，海马是探究其对产前酒精暴露易损性的理想脑区。事实上，FASDs儿童在依赖海马功能的行为方面表现出缺陷，例如位置学习能力9,10和延迟物体回忆能力11。
啮齿类动物FASD模型在阐明FASD患儿神经认知功能障碍的潜在机制方面已被证明具有重要价值。我们采用的一种成熟的暴饮暴露模型，是在出生后第4至9天向大鼠给予酒精。12,13，这一时期大脑会快速形成突触和树突接触，相当于人类胎儿第24周，并持续至第3阶段rd 孕早期/孕中期/孕晚期（根据上下文具体指代）14,15,16,17该模型可诱导海马神经元显著丢失18,19 以及小脑等多个其他脑区中的神经元12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23，伴随认知功能多个领域的严重损害21,24,25早期酒精暴露对大鼠认知功能的干扰可通过多种方法进行评估，尤其是通过 眨眼经典条件反射 （ECC）。ECC 是一种已被使用超过一个世纪的研究范式，用于科学地探究学习的基本机制26,27 因此，该方法为深入理解胎儿酒精暴露所导致的不良神经认知后果提供了一种有效途径。它是一种高度灵活的实验范式，允许研究者采用多种不同的经典条件反射（ECC）程序，并可在跨越系统发育梯度的多种哺乳动物物种（从小鼠到人类）以及不同脑发育阶段中进行研究。28,29,30,31此外，该范式中介导联想学习的基本神经回路得到了这些相同物种的实验和神经心理学研究报告的支持。26,32,33,34,35,36,37.
本文展示了一种经典条件反射（ECC）的形式——痕迹型ECC（图1）。为了提供背景信息，本文将其与更为传统的延迟型ECC进行比较。ECC范式模仿了由诺贝尔奖得主生理学家伊万·巴甫洛夫（Ivan Pavlov）首次开展的、以狗为对象的经典条件反射实验。巴甫洛夫发现，某些刺激（如声音）本身并不会自然引发唾液分泌，但当其先于食物出现并与其呈时序重叠时，若这种声音-食物的偶联关系得以维持，则经过多次重复呈现后，唾液分泌反应可被显著增强。这便是延迟型ECC的一个实例，其核心理念在于：两种刺激之间即时的时间邻近性（temporal contiguity）介导了联想强度，从而为动物提供了最优的学习条件。他还测试了其他形式的声音-食物偶联关系，例如在声音停止后留出一段“痕迹”间隔再给予食物。当这两种刺激的时间间隔足够长而不再连续时，狗在食物呈现前产生唾液分泌反应的能力显著下降。这种声音停止与食物给予之间的时间不连续性，即为痕迹型ECC的典型例子。由于啮齿类动物不会因食物的出现而自然分泌唾液，因此通常采用对该物种更具相关性的刺激（如轻度电击）来替代；它们也不会对声音自然产生防御性眨眼反应。在此背景下，啮齿类动物的ECC实验通常包括：以特定分贝水平呈现一个声音刺激，并以某种方式将其与施加于眼轮匝肌（orbicularis oculi）或颞肌（temporalis）的轻度电击配对，以诱发眨眼反应。其中，声音被视为条件刺激（CS），而电击则被视为非条件刺激（US）。在延迟型ECC中，首先呈现CS，该刺激持续一定时间；随后施加US。这两个刺激在时间上部分重叠，并最终同时终止；由US引发的眨眼反应被称为非条件反应（UR）。在此程序中，啮齿类动物学会在CS呈现之后、但在US到来之前产生眨眼反应，以预判这一厌恶刺激的到来。这种习得的眨眼反应被称为条件反应（CR）。而在痕迹型ECC中，CS与US之间被一段无任何刺激的时间间隔所分隔，这一间隔称为痕迹（trace）间隔；与延迟型ECC不同，两者在时间上并不重叠。在此间隔期间，动物需要完成对刺激之间关联性的整合。与延迟型ECC类似，当动物能够在CS终止后、但在US施加前稳定地产生眨眼反应时，即视为学习成功。经过一定阶段的习得训练（CS与US配对），学习曲线（即基于不同CR指标的测量结果）逐渐形成。损毁及神经影像学研究表明，成功完成延迟型ECC依赖于完整的 cerebellar-brain stem 神经回路38,39,40，而痕迹型ECC则是一种更高级的认知任务，需要海马41,42,43,44及其他皮层结构45,46的额外神经参与。由于成功获得痕迹型条件反应（trace CRs）对时间控制能力有更高要求，因此该任务的学习难度更大（即使对正常受试者而言亦如此）。
<img alt="经典条件反射图；电压 vs. 时间；显示音调、电击和适应性反应的时间间隔。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55350/55350fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：痕迹性眨眼经典条件反射。 图中显示了一个成年大鼠在非插管对照组（UC组）中的代表性实际波形。首先呈现条件刺激（CS）音调（85 dB，2.8 kHz），持续380 ms。随后是500 ms的痕迹间隔期，期间无任何刺激。之后施加持续100 ms的非条件刺激（US）电击（1.6 mA）。在此任务中，当训练多次后，在条件反应（CR）时间窗口（总CR期）内眨眼的频率（%）或幅度（伏特）增加时，即表明学习成功。特别是，海马体完整的啮齿类动物通常会在电击US出现前（在200 ms时间窗内）产生更多时间精准的CR（适应性CR）。同时也会测量音调CS开始后前80 ms内的惊跳反应（SRs）以及非条件反应（URs）。在训练良好的啮齿类动物中，非关联性SR通常较低或不存在，而UR则预期具有较高的频率和幅度。该任务要求啮齿类动物学会在CS结束与US开始之间（即痕迹间隔期）建立关联，因此与延迟型ECC相比，其习得难度更高。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55350/55350fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文展示了以类似酗酒方式在新生儿期暴露于酒精所导致的不良功能后果，通过一种痕迹条件化眨眼反射（trace ECC）程序进行评估。该程序提供一个85 dB的音调条件刺激（CS，2.8 kHz），持续380 ms，随后给予一个1.6 mA的电击非条件刺激（US），持续100 ms，两种刺激之间间隔500 ms的痕迹期。我们已在先前的研究中报道过该行为检测方法的应用价值，用于评估胆碱干预和铁补充在缓解新生儿期酒精暴露影响中的作用18,47。事实上，痕迹ECC可作为诊断工具，用于评估新生儿期酒精暴露引起的海马病理变化。与延迟ECC相比，其优势在于对海马功能障碍的检测更为敏感，而海马功能受损正是胎儿酒精谱系障碍（FASDs）患者中的典型特征。
ECC 的应用演示远远超出了胎儿酒精谱系障碍研究领域。ECC 的多种变体（例如、延迟、痕迹、复合、逆转）可用于阐明发育过程中学习能力的个体发生差异、正常哺乳动物联想学习的神经生物学基础，以及不同脑系统在面对多种挑战时的脆弱性，包括但不限于致畸物、环境毒素、创伤性脑损伤、神经退行性疾病和精神疾病。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;新生期酒精暴露&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>190 证明乙醇（USP）</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>225-36000 [ECU 医用储藏室]</td><td>可替换；应为 USP 级；避免使用 200 证明乙醇</td></tr><tr><td>幼鼠容器/篮子</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>任意</td><td></td><td>食品级</td></tr><tr><td>带垫片的加热水泵治疗仪</td><td>Gaymar</td><td>TP-500</td><td>用于保持幼鼠温暖；可替换</td></tr><tr><td>一次性无菌皮下注射针头 22G × 1 英寸</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌皮下注射针头 30G × 1/2 英寸</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1840-4 [Fisher Scientific]</td><td>可替换；试剂级&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Long-Evans 大鼠（雌性与雄性种鼠）</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A [ECU 比较医学部]</td><td>需明确年龄与体重；价格因这些因素而异&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.criver.com/">www.criver.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微型解剖剪刀，3.5 英寸，23 毫米刀片</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>11-2200</td><td>用于切割聚乙烯管&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚乙烯 10 型管（内径 0.011 英寸；外径 0.024 英寸）</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>22-204008 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚乙烯 50 型管（内径 0.023 英寸；外径 0.038 英寸）</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>22270835 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>温控水浴锅或婴儿奶瓶加热器</td><td>任意</td><td></td><td>可选；有助于加热冷却的乳液</td></tr><tr><td>无菌结核菌素注射器，1.0 ml</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌结核菌素注射器，10 ml</td><td>任意</td><td></td><td>可用于吸取乙醇，或使用合适量程的移液器</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>任意</td><td></td><td>应具备良好的分辨率（以克为单位）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EMG 头端制作与双极电极改装&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双通道不锈钢绞合双极电极</td><td>Plastics One, Inc.</td><td>MS303/2-B/SPC&amp;nbsp; ELECT SS&amp;nbsp; 2C TW .008&quot;</td><td>必须指定基座下方 20 mm 的定制长度&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Centi-Loc 条形插座绝缘子（又称 Micro Strip）</td><td>ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions</td><td>CTA4-IS-60* 或 CTA4-1S-60*</td><td>*取决于供应商；参见 www.onlinecomponents.com 或 www.avnetexpress.avnet.com</td></tr><tr><td>带齿牙科钳</td><td>CMF Medicon</td><td>390.20.05</td><td>可替换；用于将导线压接到雄性触针上&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.medicon.de/">www.medicon.de&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微型解剖剪刀，3.5 英寸，23 毫米刀片</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>11-2200</td><td>仅用于剪切 3T 导线；剪切 10T 导线会损坏刀片——应使用剥线钳的刀刃&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）涂层不锈钢导线，10T（裸线直径 0.010 英寸）</td><td>Sigmund Cohn-Medwire</td><td>316SS10T</td><td>&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.sigmundcohn.com/">www.sigmundcohn.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）涂层不锈钢导线，3T（裸线直径 0.003 英寸）</td><td>Sigmund Cohn-Medwire</td><td>316SS3T</td><td>&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.sigmundcohn.com/">www.sigmundcohn.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>任意</td><td></td><td>用于从双极电极插脚上剥离 1 mm 的绝缘层</td></tr><tr><td>Relia-Tac 插座雄性触针</td><td>Cooper Interconnect</td><td>220-P02-100</td><td>参见 Allied Electronics 目录号 70144761&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.alliedelec.com/">www.alliedelec.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>高精度带齿镊子，4 3/4 英寸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78314-00D</td><td>在用光滑镊子剥离 PTFE 时，用于牢固夹持 10T 导线&lt;br/&gt; www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>高精度光滑镊子，4 3/4 英寸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78313-00B</td><td>&lt;br/&gt; www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>超细尖端镊子，4 3/4 英寸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78510-0</td><td>用于从 3T 导线一端剥离 1 mm 的 PTFE；用光滑镊子夹持屏蔽部分&lt;br/&gt; www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>剥线钳，16-26 AWG</td><td>任意</td><td></td><td>使用刀片端切割微型条带</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;眼睑手术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科器械（高质量不锈钢）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 × 带齿敷料钳，4 英寸</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>30-1205</td><td>可替换；额外敷料钳用于手术托盘外夹持电极/螺丝&lt;br/&gt; brisurgical.com</td></tr><tr><td>带齿敷料钳，3 英寸</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>30-1200</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>器械托盘</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>24-1355</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>3 号刀柄，5 英寸</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>26-1000</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微型解剖镊，3.5 英寸，细尖</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>10-1630</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微型解剖镊，3.5 英寸，光滑平台（0.3 × 5 毫米）</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>10-1720</td><td>&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微型解剖剪刀，3.5 英寸，极精细，15 毫米刀片</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>11-2000</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>普通碎屑镊，3.5 英寸&amp;nbsp;</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>30-1600</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://brisurgical.com/">brisurgical.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>#10 不锈钢手术刀片（适配 #3 刀柄），无菌</td><td>任意</td><td></td><td>可替换</td></tr><tr><td>0-80 × 0.125 英寸不锈钢螺丝</td><td>Plastics One, Inc.</td><td>0-80 × 0.125</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>酒精消毒棉片，无菌</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750 [Fisher Scientific</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td>Purdue Frederick Co.</td><td>6761815101 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）消毒棉片</td><td>Moore Medical</td><td>19-898-946 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>灭菌棉签，可高压灭菌</td><td>任意</td><td></td><td>通常为 7.6 厘米或 15.2 厘米长</td></tr><tr><td>手摇钻钻头，#55（0.052 英寸）</td><td>任意</td><td></td><td>金属应耐锈蚀和腐蚀</td></tr><tr><td>纱布垫，2 英寸 × 2 英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-178 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>通用乳胶/丁腈/乙烯基手套</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>任意</td><td></td><td>用于手术间器械灭菌</td></tr><tr><td>带垫片的加热水泵治疗仪 × 2</td><td>Gaymar</td><td>TP-500</td><td>可替换；建议使用独立泵——1 个用于手术，1 个用于恢复</td></tr><tr><td>一次性无菌皮下注射针头 26G × 3/8 英寸</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-150-12</td><td>制造商可替换；可能需要兽医批准</td></tr><tr><td>桌面式非重复呼吸异氟烷蒸发器系统</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.parklandscientific.com/">www.parklandscientific.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>珠宝商螺丝刀，1.8-2 毫米刀头</td><td>任意</td><td></td><td>金属应耐锈蚀和腐蚀</td></tr><tr><td>Ortho-Jet BCA 套件（牙科水泥）</td><td>Lang Dental</td><td>B1334</td><td>包含粉末（1 磅）和液体&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.langdental.com/">www.langdental.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>大型带减压阀的氧气罐</td><td></td><td></td><td>本地供应商</td></tr><tr><td>高型釉面瓷坩埚，10 毫升</td><td>CoorsTek, Inc.</td><td>07-965C [Fisher Scientific]</td><td>可用 Fisher FB-965-I 宽型坩埚替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>无菌兽用眼膏 Puralube</td><td>Henry Schein Company</td><td>NC0144682 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Quatricide PV-15</td><td>Pharmacal</td><td>PV-15</td><td>抗菌消毒剂；可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.pharmacal.com/">www.pharmacal.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>用于立体定位手术的大鼠气体麻醉面罩&amp;nbsp;</td><td>Stoelting Company</td><td>51610</td><td>&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.stoeltingco.com/">www.stoeltingco.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>带耳杆的大鼠立体定位仪（45 度）</td><td>任意</td><td></td><td>建议使用 45 度耳杆，以防止损伤鼓膜</td></tr><tr><td>Roboz 外科器械润滑乳</td><td>Roboz Surgical</td><td>NC9358575 [Fisher Scientific]</td><td>可替换；用于高压灭菌时润滑器械&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>啮齿类动物毛发修剪器</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641-500 [Fisher Scientific]</td><td>用于配制 0.9% 生理盐水；试剂级；USP&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>不锈钢微型刮刀（刀片：0.75 英寸长 × 0.18 英寸宽）</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-15 [Fisher Scientific]</td><td>可替换&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Starrett 手摇钻，0.000–0.055 英寸</td><td>任意</td><td></td><td>建议使用镍镀层或等效材料，以抗锈蚀和腐蚀</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灭菌包裹布，20 英寸 × 20 英寸，可高压灭菌</td><td>Propper Manufacturing</td><td>11-890-8C [Fisher Scientific]</td><td>用于包裹可高压灭菌物品，以及手术中无菌区域覆盖&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>外科洞巾，无菌/可高压灭菌</td><td>任意</td><td></td><td>可能需要根据大鼠体型裁剪</td></tr><tr><td>外科手术服*</td><td>任意</td><td></td><td>*如 IACUC 要求</td></tr><tr><td>外科口罩</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌结核菌素注射器，1.0 ml</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>任意</td><td></td><td>应具备良好的分辨率（以克为单位）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;眼睑系统及组件（假设为 4 只大鼠系统）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 通道换向器 × 4</td><td>Plastics One, Inc.</td><td>SL2 + 3C</td><td>&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>双 305 型双极电极电缆 × 4</td><td>Plastics One, Inc.</td><td>305-305 80CM TT2 (C)</td><td>提供大鼠双极电极与换向器的插头端；必须改装&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>5 通道屏蔽电缆，26 AWG × 4</td><td>任意</td><td></td><td>用于制作换向器电缆；需从零开始制作</td></tr><tr><td>操作箱室（内部尺寸：24 英寸高 × 23 英寸宽 × 14 英寸深）× 4</td><td>Med-Associates</td><td></td><td>可替换；内部尺寸应能舒适容纳操作箱，留有吸音泡沫空间；配备风扇——55–60 分贝&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.med-associates.com/">www.med-associates.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>眼睑系统与软件</td><td>JSA Designs</td><td>N/A</td><td>专有且为研究实验室定制</td></tr><tr><td>热缩管（直径 3/16 英寸、1/4 英寸、3/8 英寸、1/2 英寸）</td><td>任意</td><td></td><td>用于保护改装后换向器电缆的焊接端与接头</td></tr><tr><td>三峰密胺吸音泡沫（带黑色氯丁橡胶涂层，24 × 48 英寸）</td><td>McMaster-Carr</td><td>9162T5</td><td>可替换；裁剪以适配 4 个饲养箱&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.mcmaster.com/">www.mcmaster.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>完整操作测试箱（外部尺寸 12.5 英寸长 × 10 英寸宽 × 13.5 英寸高）× 4</td><td>Med-Associates</td><td>ENV-007 定制套装</td><td>含不锈钢网格地板与定制顶盖（中心有 3 英寸孔用于换向器电缆）&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.med-associates.com/">www.med-associates.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>示波器（可选）</td><td>任意</td><td></td><td>建议最低规格：200 MHz 模拟带宽，1 GS/s 实时采样率，4 通道；参见 www.picotech.com&lt;br/&gt; /td&gt;</td></tr><tr><td>压电高音扬声器 × 4（7 × 3 英寸）</td><td>MCM Electronics</td><td>53-805</td><td>必须符合眼睑系统频率范围要求（2500 Hz – 25 kHz）&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.mcmelectronics.com/">www.mcmelectronics.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>焊台、焊料、助焊剂、镀锡剂</td><td>任意</td><td></td><td>用于将 26 AWG 电缆焊接到雌性插座（适配雄性 Relia-Tac 触针）和双极插头</td></tr><tr><td>刺激隔离器 × 4</td><td>WPI International</td><td>A365</td><td>该设备使用 16–9V 碱性电池；亦有合适的可充电版本（A365R）&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>用于 SL3C 换向器的三极电极电缆 × 4</td><td>Plastics One, Inc.</td><td>335-335 80cm TT3 C</td><td>提供大鼠 EMG 头端与换向器的插头端；必须改装&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>USB LED 灯 × 4</td><td>任意</td><td></td><td>基于 USB 的灯不会对大鼠 EMG 信号造成电“噪声”&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.plastics1.com/">www.plastics1.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>网络摄像头 × 4，监控软件</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>运行 MS Windows 操作系统的 PC 计算机</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

采用痕迹性眼睑经典条件反射评估胎儿酒精谱系障碍大鼠模型中的海马功能障碍

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

在出生后第4至9天，对新生大鼠施用相对高浓度的乙醇（11.9% v/v），这一时期胎儿大脑经历快速的组织结构变化，类似于人类妊娠晚期大脑加速发育的阶段。这种胎儿酒精谱系障碍（FASDs）模型可导致严重的大脑损伤，模拟某些孕期酗酒母亲所表现出的暴饮行为的剂量和模式。我们描述了采用痕迹性眼睑经典条件反射（ECC）——一种高级形式的联想学习——来评估酒精暴露后成年子代中常见的长期海马功能障碍。在90日龄时，对啮齿动物进行手术，植入记录电极和刺激电极，分别用于测量左侧眼睑肌肉的肌电图（EMG）眨眼活动，并在左眼后方施加轻微电刺激。经过5天的恢复期后，动物接受了6次痕迹性ECC训练，以确定酒精暴露组与对照组大鼠在联想学习能力上的差异。痕迹性ECC是多种可能的ECC实验程序之一，可利用相同的设备和软件轻松调整，从而评估不同的神经系统。总体而言，ECC程序可作为诊断工具，用于检测不同脑系统及不同脑损伤条件下存在的神经病理变化。

眼睑闭合分析软件能够为多种测量类型提供大量且全面的数据。为简洁起见，本研究报告了学习和表现指标的代表性结果，包括适应性条件反应（CR）百分比、适应性CR幅度、非条件反应（UR）百分比和UR幅度。选择适应性CR时相是因为它反映了在重复训练过程中精确时间控制的眼睑闭合反应的获得，这是海马突触可塑性增强的结果，见于痕迹式眼睑条件反射（trace ECC）50,51,52。选择UR指标是为了阐明新生期酒精暴露导致的痕迹式ECC学习缺陷，是源于联想学习的障碍，还是对电击非条件刺激（US）反应能力的受损——后者可能提示动机或运动功能差异，而非各处理组间的学习能力差异。每项指标的数据均采用2（性别）×3（新生期分组）×6（训练阶段）的混合因素方差分析（ANOVA）进行分析，其中“训练阶段”为重复测量因子。对新生期处理的显著主效应采用Tukey事后检验，对显著交互作用则采用简单效应检验进行分析。所有统计分析均以α水平不低于0.05为显著性标准，图中结果以均值±标准误（SEM）表示。
从适应性条件反应（CR）百分比指标来看，方差分析结果显示新生儿分组的主效应显著，F(2,21) = 11.69，p &lt;0.001，但性别主效应不显著（p = 0.71），且两因素之间无显著交互作用（p = 0.20）。与预期一致，适应性条件反应百分比在六次训练会话中显著上升，F(5, 105) = 81.15，p &lt;0.001，且不同新生儿组之间的差异依赖于会话水平，F(10, 105) = 4.58，p &lt;0.001。其他涉及会话因素的交互作用均无统计学意义。同样，在适应性条件反应幅度方面，新生儿分组的主效应也显著，F(2,21) = 22.32，p &lt;0.001，但性别主效应不显著（p = 0.21），两因素之间亦无显著交互作用（p = 0.48）。条件反应幅度在六次训练会话中也显著增加，F(5, 105) = 59.27，p &lt;0.001，且不同新生儿组之间的差异随会话水平而变化，F(10, 105) = 4.31，p &lt;0.001。总体而言，两种条件反应指标在各组均值间均表现出显著差异，且这些均值在不同训练会话中显著分离。为确认具体哪些组间存在显著差异，Tukey 事后检验显示，经酒精插管处理的大鼠（AI）在两种条件反应指标上的表现均显著差于未插管对照组（UC）和假插管组（SI）大鼠（CR 百分比：p &lt;0.01；CR 幅度：p &lt;0.001），而 UC 与 SI 组之间无显著差异（p's &gt;0.05）。针对两种条件反应指标中显著的“新生儿分组 × 会话”交互作用进行的简单效应检验进一步证实，与 UC 和 SI 组大鼠相比，AI 组大鼠从第 2 次会话开始至第 6 次会话均在条件反应习得方面表现出更显著的损伤（所有 p's &lt;0.05），而 UC 与 SI 组在整个六次会话中始终无显著差异。唯一的例外是，SI 组大鼠的适应性条件反应幅度直到第 3 次会话才开始与 AI 组大鼠出现显著差异。这些结果如图 5A、5B所示。
性别、新生期分组或这些因素与实验阶段因素的交互作用对UR指标均无显著影响。这些阴性结果表明，各组对电击无条件刺激产生眨眼反应的能力相当，且AI大鼠中观察到的学习缺陷不受眨眼动机或运动差异的影响（图6A，6B）。
<img alt="自适应条件反应曲线；百分比和幅度数据；痕迹性眼睑条件反射获取情况与实验次数的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55350/55350fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：痕迹性条件反应获得情况（均值 ± 标准误）。 早期酒精暴露（AI组）显著影响了自适应条件反应（CR）百分比（A）和幅度（B）的获得。由于痕迹性眼睑条件反射（ECC）本身较难建立，因此各组的测量值相对较低——在FASD的啮齿类动物模型中，延迟性ECC的百分比可达80-85%21,53。然而，痕迹性ECC对海马的功能要求更高，而海马在早期脑发育阶段易受酒精影响。* = p &lt;0.05，** = p &lt;0.01，*** = p &lt;0.001（UC组与AI组大鼠之间）；样本量在括号中给出。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55350/55350fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="追踪ECC获取图；UR百分比、各次会话中的振幅趋势；教育图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55350/55350fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：非条件反应的获取情况（均值 ± 标准误）。眼睑反应表现（UR百分比和UR振幅）在各组之间无显著差异。该结果表明，在获取训练期间使用的电击强度并未对AI大鼠的动机或产生防御性眨眼反应的能力造成与对照组（UC和SI）不同的影响。样本量在括号中给出。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55350/55350fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

采用痕迹性瞬眼经典条件反射（ECC）来评估成年大鼠海马依赖性关联学习能力，这些大鼠在新生早期脑发育阶段曾接受高浓度（11.9% v/v）酒精处理。总体而言，ECC 方法是一种可靠的诊断工具，可用于多种心理和生物医学情境下脑功能障碍的检测。

新生大鼠在出生后第4至9天被给予相对高浓度的乙醇（11.9% v/v），这一时期正是胎儿大脑经历快速组织性变化的阶段，类似于人类妊娠第三 trimester 所发生的加速性脑部变化。该胎儿酒精谱系障碍（FASDs）模型可导致严重的脑损伤，模拟某些孕期酗酒母亲中出现的暴饮模式及其酒精暴露量。本文描述了采用痕迹性瞬目经典条件反射（trace eyeblink classical conditioning, ECC）——一种高级形式的联想学习——来评估酒精暴露后成年子代中常见的海马长期功能障碍。在出生后第90天，对啮齿动物实施手术，植入记录电极和刺激电极，分别用于测量左侧眼睑肌肉的肌电图（EMG）瞬目活动，并向左眼后方施加轻微电刺激。经过5天的恢复期后，动物接受6个会话的痕迹性ECC训练，以确定酒精暴露组与对照组大鼠在联想学习能力上的差异。痕迹性ECC是多种可选ECC范式之一，可利用相同的设备和软件进行简便修改，从而评估不同的神经系统。总体而言，ECC范式可作为诊断工具，用于检测不同脑系统及不同脑损伤条件下存在的神经病理变化。

关键词：胎儿酒精谱系障碍，FASDs，乙醇，痕迹性瞬目经典条件反射，ECC，海马功能障碍，联想学习，新生大鼠，脑发育，电生理学，EMG，神经病理学

本实验的总体目标是展示如何利用痕迹性眨眼经典条件反射——一种联想学习形式——来检测胎儿酒精谱系障碍大鼠模型中的海马功能障碍。在脑发育相当于人类妊娠晚期的阶段，对新生大鼠幼崽采用类似 binge 饮酒的方式给予高剂量酒精，酒精浓度为 11.9% 体积比体积。这种酒精暴露模式和剂量是导致整个生命过程中出现类似人类胎儿酒精谱系障碍（FASD）脑功能缺陷的关键因素。早期酒精暴露会损害的一个重要脑区是海马体。在大鼠成年后，通过痕迹性眨眼经典条件反射实验来检测其海马功能障碍。这是一种依赖海马体完整性的高级联合学习形式。在出生后第4至第9天，每天早晨称量大鼠幼崽的体重并记录其体重数值。随后根据体重从预先印制的表格中查得相应的喂养体积。将体积分数为11.9%的酒精溶液分两次喂食大鼠幼崽，两次喂食间隔2小时。酒精的总日剂量为每日每千克体重5.25克。该 binge 暴露范式在每次喂食时向每克体重提供0.278毫升酒精（以牛奶溶液形式）。用无菌的一毫升注射器抽取含有酒精的牛奶，然后推出多余的溶液以获得所需的准确体积。将PE-10管的管尖浸入新鲜的玉米油中。这有助于插入。测量PE-10管从幼鼠口腔至胃部的长度。如有必要，调整PE-50堵头作为停止点的视觉参考。小心地将PE-10导管插入幼鼠口中。当导管尖端到达咽喉时，通常会遇到一定阻力。调整导管方向，直至其尖端弯入食管入口。尽量避免让导管向后滑动，因其可能因油而变得湿滑。继续将导管沿食道推进，当管尖通过胃食管括约肌后，便会进入胃内。到达此处时停止推进，固定注射泵，然后注入溶液。应以缓慢的速度进行。小心移除PE-10导管，检查幼鼠是否有液体反流、出血或物理损伤。若幼鼠状态良好，将其放回同窝幼鼠中。请参阅书面方案和材料清单，了解眼睑手术过程中所用的具体仪器。使用经批准的消毒剂对手术区域进行消毒，并提前将所有手术器械和用品进行高压灭菌。用异氟烷对大鼠实施适当的麻醉后，使用毛发修剪器剃除其头部毛发，暴露足够面积的皮肤以供切口部位及左眼眼睑操作。用70%异丙醇和聚维酮碘进行三次交替擦拭，对皮肤进行消毒。按照标准操作程序，使用耳杆将大鼠固定在立体定位仪上。当大鼠达到适当的麻醉水平时，开始手术。使用手术刀片在中线处进行从前到后的切口。该切口应暴露眼睛前方足够的区域，并略微延伸至人字缝线后方。使用手术刀片小心刮除颅骨顶部的骨膜，注意避免引起过度出血。用棉签擦去多余的结缔组织和血液，每次刮取之间用无菌生理盐水冲洗区域。从一侧顶骨冠状缝正后方开始钻孔。用棉签清除任何血液和骨碎片。使用分体镊子夹取一颗 0 80 螺钉。使用钟表起子将螺钉固定到孔中，拧紧螺钉至刚好固定而不损伤大脑皮层组织，通常拧三到四整圈即可。按照相同步骤固定其余螺钉。应在冠状缝后方双侧各固定一个螺钉，并在右侧顶骨、人字缝前方固定一个螺钉。用4英寸敷料镊夹住其左眼切口处上方的皮肤，将3英寸敷料镊指向该眼角。取一根26号、3/8英寸的针头，从眼睑角落处刺入。将针头旋转，使斜面朝上。在眼睑中部插入第二根针头。用精细镊子夹住一根3T导线，并将其插入其中一根针头中。无需完全插入。对第二根3T导线采用相同的步骤。一只手握住两根针，另一只手握住头架。连续地将针头从眼睑处向外牵拉，同时朝相同方向引导头期装置。用一只手握住肌电图（EMG）头期装置，另一只手使用3英寸敷料镊子，将10T导线缠绕至右侧一个或两个螺钉上。将导线妥善收好，使其不从螺钉处突出。应在进入下一步之前将肌电图前置放大器头端居中。使用4英寸敷料镊，通过分离皮肤（即浅筋膜）与颞肌，创建一个小的皮下囊袋。形成囊袋后，使用虹膜剪进一步剪除结缔组织，向左眼内侧眼角方向分离。注意不要插入过深或切断任何血管。取一个双极电极，将导线引脚塑形，使其能够贴合颞肌的弧度。两个电极尖端将位于左眼后方，双极电极的底端将垂直置于颅骨顶部。将Ortho Jet粉末与液体成分混合，直至形成液态稠度。使用微型刮刀将糊状物涂抹于切口周围区域。注意避免将任何糊状物滴入大鼠眼睛，并确保其不外溢。让 Ortho Jet 达到半干状态，然后使用眼科镊子清除 EMG 头部固定装置上的多余丙烯酸材料以及双极电极的螺纹部分。剪去多余的 3T 导线，保留几厘米用于后续操作。使用显微解剖镊子小心地从每根3T导线上移除聚四氟乙烯（PTFE）屏蔽层。这将使导线能够与眼轮匝肌接触。使用显微解剖镊子在每根3T导线的两端弯成钩状。剪去多余的导线，注意不要剪得过多，以免剩余导线缩回眼睑内部。导线由本实验室自制。先连接白色双极插头，用于传递超声刺激信号。随后连接橙色的EMG头部插件。该插件可记录大鼠眨眼时的肌电活动。两个插件均连接至机械臂顶部的一个圆形换向器，当大鼠自由活动时，该换向器可保持信号的连续性。打开刺激隔离器并进行最终的硬件检查。这包括将肌电图（EMG）基线调整至计算机屏幕上可观察的水平。在第一次实验中，刺激电流强度首先设定为4毫安，并且每两次试验后以4毫安为单位逐步增加。这种逐步引入的程序使大鼠能够适应电击刺激。到第八次试验时，电击强度在本实验阶段及所有后续阶段均维持在 1.6 毫安。另一台计算机运行四通道数字示波器，使我们能够进行实时信号诊断。注意第一只箱子中大鼠发出的眼睑眨动。示波器还显示，基础肌电图（EMG）信号相对干净，噪声较低。网络摄像头也使我们能够同时监测每只大鼠。这是 blink 软件 4.0 版本的截图，显示一次持续 1400 毫秒的试验时段。在最初的 280 毫秒内，不呈现任何刺激，以获取基线 EMG 活动的测量值。黄色线表示阈值线，任何超过平均预条件刺激（pre-CS）基线值 4 伏特以上的 EMG 反应，将被判定为眨眼反应。85分贝的条件声音刺激在280毫秒时间点呈现。该声音持续380毫秒，至660毫秒时间点结束。声音结束后，有500毫秒的无刺激间隔期，此阶段称为痕迹期（trace period），在此期间，大鼠需将条件刺激（CS）声音的终止与尚未出现的非条件刺激（US）足底电击的起始（将在1160毫秒时间点施加）进行关联。 电击无条件刺激持续100毫秒。该电击无条件刺激会自然引发一种防御性眨眼反应，称为无条件反应（UR），其测量时间窗为140毫秒。一次训练包含100个试验。共有90次试验将条件刺激（CS）与非条件刺激（US）配对呈现，每第10次试验仅呈现条件刺激（CS）。每次实验包含10次仅呈现条件刺激（CS）的试验。这些试验使我们能够检测是否已习得条件刺激与非条件刺激之间的关联。条件反应（CR）表现为在未呈现电击非条件刺激（US）时出现的反应。两次试验之间的间隔时间平均为30秒，以确保每次试验的开始时间不可预测。在任一次试验中，大鼠可能在任意时间点眨眼，其肌电图（EMG）将由软件记录。任何超过阈值线的独立眨眼动作，将根据其发生的时间和试验阶段被归为四类反应之一。如果大鼠在条件刺激（CS）声音开始后的前80毫秒内眨眼，则该反应被视为惊吓反应（SR）。这是一种非关联性反应，反映的是感觉运动功能，而非对CS与US之间关联的学习本身。如果眨眼发生在惊吓反应期之后、但在电击非条件刺激（US）呈现之前，则被视为条件化反应。如前所述，条件反应（CR）是衡量联想学习的主要指标。在训练的早期阶段，预期不会出现条件反应（CR）；但随着训练的进行，经过多次试验和训练 session 后，这类反应会变得更加频繁、幅度更高，且可能出现更精确的时间控制。我们将条件反应（CR）分为两种类型：总条件反应（total CRs）和适应性条件反应（adaptive CRs）。总体条件反应（CRs）反映了一般的学习能力，而适应性条件反应（CRs）则反映了动物能够良好地定时眨眼的能力。作为一种自我保护的准备动作，适应性条件反应发生在刺激（US）出现前200毫秒。在海马体完整的哺乳动物中，适应性条件反应的表达反映了海马体在精确协调两种刺激呈现时间关系中的高级参与作用。从本质上讲，痕迹型眨眼经典条件反射比延迟型眨眼经典条件反射更难建立，因为在后者中，条件刺激（CS）声音与非条件刺激（US）电击在时间上是重叠的。尽管条件反应（CR）的表达可能因个体而异，并受到特定脑回路功能障碍的显著影响，但在每一次配对的CS-US试验中都应出现非条件反应（UR）。因此，这一指标反映的是感觉运动功能，与惊吓反应类似，本身并不能表明对CS-US关联的学习。 在接下来的系列视频片段中，您将看到软件的设置过程以及眨眼训练的开始。眨眼训练软件被激活后，将调用两个相关文件：一个包含受试对象数据的大鼠文件，以及一个用于时序性眨眼条件反射的文件。该程序在训练开始前已设置就绪。当训练开始时，请注意屏幕右下角有一个倒计时计时器，用于提示下一次试验的时间。以下为第一次实验第15次试验的实时视频记录，其中出现了非条件反应（UR），但尚未形成任何条件反应（CR）。以下是以三分之一速度播放的回放。在接下来的一系列片段中，您将看到同一只未插管的对照组大鼠在六次训练过程中逐步进展的截图。该大鼠最终产生了完整的条件反应（CRs）以及适应性条件反应（adaptive CRs）。这是第六次训练 session 第 96 次试验的实时视频片段，其中出现了两次眨眼，一次为适应性条件反应（CR），另一次为非条件反应（UR）。以下是以原速度三分之一回放的视频。在最后一个片段中，您将看到一只经酒精插管处理的大鼠在第六次训练 session 的最后一次试验中的实时视频，该次试验仅为条件刺激（CS）单独呈现的试验；即使经过 600 次训练，它仍未能稳定地产生适应性条件反应（CR）。数据采集完成后，会通过内置的异常值检测算法，筛选出包含高噪声伪迹以及条件刺激前异常基础肌电活动（EMG）的无效试验。保留的优质试验将进一步分析条件反应（SRs）、非条件反应（URs）、总条件反应（CRs）以及适应性条件反应（adaptive CRs）在反应百分比、幅度、潜伏期及其他关键指标方面的表现。本组结果展示了训练六次会话中适应性条件反应的平均值。从第二次到第六次会话，酒精插管组与两个对照组在反应百分比和幅度指标上的差异均具有统计学意义。这表明，在早期发育阶段接触酒精的大鼠，其适应性条件反应的频率和强度均受到损害。第二组结果展示了非条件反应的平均值。各组之间的频率和振幅测量值在统计学上均无显著差异。这些结果表明，早期酒精暴露并未损害大鼠对非条件刺激产生眨眼反应的能力，其表现出的缺陷源于在习得过程中无法正确建立条件刺激与非条件刺激之间的关联。在本实验中，我们通过检测发育期类似暴饮模式的酒精暴露是否会影响海马功能，进而导致痕迹型眨眼经典条件反射的缺陷，以此探讨脑功能与行为之间的关系。事实上，眨眼经典条件反射是评估脑发育期间酒精暴露所引发神经行为后果的有效工具。它具有很高的灵活性，通过改变刺激参数或联合学习要求，还可以评估海马体外不同脑系统的功能完整性。观看本视频后，您应能充分理解向新生大鼠幼崽给予酒精、植入电极以及实施眨眼测试过程中的各项复杂操作。感谢您观看本视频。

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