一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成 微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

本微流控实验的总体目标是利用实时视频显微镜，在流动条件下同时测量反应表面上血小板沉积与纤维蛋白形成的动态过程。该方法有助于解答输血医学领域中的关键问题，例如血小板浓缩物制备对输注血液促凝特性的影响。该技术的主要优势在于能够实现在流动状态下对血小板功能和凝血过程的同步分析，从而便于研究这两个过程之间的相互作用。

尽管该方法可用于研究接触途径诱导的血小板促凝作用，但通过包被脂化组织因子，也可将其应用于外源性途径的研究。本实验操作将由来自实验室的技术员 Rosalie Devloo 演示。开始微流控流动室的设置时，用移液器将 0.8 微升 freshly reconstituted 胶原蛋白加入一条全新的、具有八条平行直通道的一次性微流控生物芯片每个通道长度的前六分之五的一端，并将该端标记为出口端。

将生物芯片置于加湿并密封的容器中，在 4 摄氏度下孵育至少 4 小时。孵育结束后，向混合生物芯片中等量的 Y 形通道的编码通道内加入封闭缓冲液。将芯片放回容器中，在室温下继续孵育 1 小时。

然后，在每个使用通道中，将一根针插入两段8厘米长和一段2厘米长的管路的一端，并插入一段46厘米长管路的两端。接下来，使用Nanopump软件通过连接的管路用蒸馏水冲洗所有泵流路，并使用连接在注射器接头针上的注射器将封闭缓冲液注入其余所有管路中。然后，使用实验室千斤顶将编码生物芯片固定在自动显微镜载物台上，同时将混样生物芯片调节至与显微镜载物台相同的高度并加以固定。

使用八厘米长的管子上的插针将这些管路固定到混合生物芯片的入口，并将每根管子的自由端放入盛有HEPES缓冲盐水的小瓶中。现在，用一段46厘米长的管路以灵活但平直的方式将编码生物芯片连接到混合生物芯片。将一个注射器连接针固定在清洗泵的鲁尔接头兼容管路上。

然后，将针头连接到一段两厘米长的管路的自由端，并将管路的另一端固定到编码生物芯片的出口。接着，用一毫升 HBS 冲洗所有管路和通道。准备灌注泵时，打开微流控灌注泵驱动软件，双击注射器图标以初始化泵。

选择将要使用的注射器类型，断开冲洗泵及其连接的两厘米管路。将断开的两厘米管路及其注射器连接针与一段厚壁废液管的鲁尔锁接头相连，并用注射器将标准胃蛋白酶溶液注入厚壁管路中。然后，使用科赫钳夹紧厚壁管路的开口端。

将管路固定至编码生物芯片的出口。同时断开混合流动室上的两根管路，并丢弃HBS容器。采集真空枸橼酸钠抗凝管中的血液样本后，离心处理管内样本，将富血小板血浆转移至新的离心管中。

再次离心含有富血小板血浆的容器。然后，将上清液——乏血小板血浆——转移至另一离心管中。接着，使用21号针头穿刺枸橼酸钠容器底部，使压积红细胞滴入新的锥形管中。

当收集完所有浓缩红细胞后，轻柔地将分离的浓缩红细胞与乏血小板血浆混合，以重新构建血液，并加入为输注准备的血库血小板，使样本最终达到40%的血细胞比容和每微升2.5 × 10⁵个血小板的浓度，总体积为2.5毫升，并进行全血细胞计数。接着，向一个聚苯乙烯圆锥形试管中加入13微升荧光标记的纤维蛋白原，随后加入1毫升重新构建的血液。

将另一毫升血液与两微升荧光血小板染料混合，并将标记后的血液样本合并。然后轻轻倒置混合的血液样本，在37摄氏度下孵育10分钟。在开始灌注实验前，将显微镜光学系统聚焦于第一条通道底部附着的胶原纤维上。

使用采集软件，在选定的通道中定义一个感兴趣区域。将一毫升预热的凝血缓冲液吸入一毫升注射器中，并将该注射器安装到灌注泵上。再次轻柔颠倒混匀后，将血液吸入一个两毫升注射器中，并将该注射器安装到灌注泵上。

然后，使用注射器连接针将两个注射器连接到一段8厘米长的管路上，并以每分钟400微升的速度对连接头和管路进行预灌注。当所有管路均充满凝血缓冲液或血液后，将两根管路的另一端固定在混合生物芯片Y形通道的分叉处。随后，松开废液管出口处的科赫钳，以每分钟4.4微升的速度对凝血缓冲液进行灌注，同时以每分钟44微升的速度对重建血液进行灌注。

实时每10秒记录一次图像，持续30分钟，在30分钟后或信号达到饱和时终止泵送和图像采集。随后，将所有管路和注射器作为生物危害废物丢弃。本视频很好地展示了血小板血栓的形成以及纤维蛋白的沉积过程。

灌注开始时，血小板黏附于反应表面，导致记录的绿色荧光持续增加。在此黏附阶段，紫色荧光较弱，表明纤维蛋白仅少量形成。当凝血启动后，纤维蛋白迅速沉积并强烈发出荧光，同时血小板的绿色荧光以大致相同的速度积累。

因此，凝血起始的时间点可被推断为血小板促凝潜能的一个决定因素。在重组血液中加入玉米胰蛋白酶抑制剂不会影响血小板的黏附，但在整个灌注实验过程中可阻止凝血的启动。通过增加重组样本中的血小板数量，黏附、聚集和凝血的速率呈线性增加。

通过提高血小板浓度可显著缩短凝血启动时间，表明需要一定数量的活化并沉积的血小板才能触发凝血过程。此外，在成对分析中，与仅涂覆胶原的通道相比，同时涂覆胶原和重组脂化组织因子的通道凝血启动显著加快，尽管两种条件下凝血的整体速率以及血小板的聚集量并无差异。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用双标记重建血液进行微流控流动腔实验，以同时分析血小板功能和凝血过程。

该技术问世后，为输血医学领域的研究人员探索血小板与凝血在流动条件下的相互作用奠定了基础。在本视频中，我们重点演示了一种标准化的实验方法。但可通过改变表面包被、剪切应力或钙离子浓度，以回答特定的研究问题。