Name: 界定和由人多能干细胞的肝细胞样细胞的可扩展代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 了解利用重组层粘连蛋白基质从人多能干细胞生成肝细胞样细胞的方法。该技术可实现功能性肝细胞的大规模生产，为肝脏生物学和疾病建模研究提供可扩展且高度可重复的实验系统。

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本工作获得了英国再生医学平台（MRC MR/L022974/1 和 MR/K026666/1）以及中国国家留学基金委奖学金的资助。

注意：本实验方案中使用的所有试剂的供应商信息均已列在表1中。当细胞需直接接触培养基/培养板时，所有培养基/培养板应为无菌状态，且温度至少达到室温。
1. 将人多能干细胞（hPSCs）传代至层粘连蛋白521上
注意：下述细胞传代操作基于单细胞，适用于从人多能干细胞（hPSCs）诱导获得同质性的肝细胞样细胞群体。集落接种法同样适用，此前已有相关描述24。
<ol>
	<li>根据需要制备层粘连蛋白包被的培养板。
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻重组层粘连蛋白 521（LN-521）的 100 µg/mL 储存液。</li>
		<li>将解冻的LN-521用预冷的1x DPBS（含Ca）稀释2+/毫克2+) 配制成 5 µg/mL 的溶液。</li>
		<li>向6孔板的1个孔中加入1 mL浓度为5 µg/mL的LN-521溶液，轻轻摇动使溶液在孔内均匀覆盖。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 细胞培养箱中孵育2-4小时用于紧急使用，或在4 °C冰箱中过夜。</li>
		<li>根据需要将包被有层粘连蛋白的培养板存放于4 °C冰箱中。将培养板置于水平面上，并密封以防止蒸发和污染。 
		注意：切勿让包被的孔干燥；用额外的1x DPBS（含Ca）补充至满2+/毫克2+如有需要，可在2周内使用这些平板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前将所需数量的预包被板置于室温平衡，或在37 °C孵育0.5至1小时。</li>
	<li>小心吸去包被液LN-521，避免损伤包被表面。注意：在接种细胞前，切勿损伤包被表面。</li>
	<li>立即向6孔板的一个孔中加入1 mL预热的mTeSR1培养基，培养基中添加10 µM Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y27632。将该培养板置于细胞培养箱中备用。 
	注意：切勿让包被有层粘连蛋白的孔干燥。</li>
	<li>从培养至约75%至85%融合度的hPSCs中吸除培养基。用1 mL室温1x DPBS（不含Ca2+/毫克2+).</li>
	<li>向细胞中加入0.5 mL 1x Accutase，于37 °C孵育6 - 8分钟以解离细胞。 
	注意：为判断消化时间是否足够，可轻轻敲击培养板，观察细胞是否易于脱落。若细胞可轻易脱落，则应立即终止酶反应；若不能，则延长消化时间1至2分钟。</li>
	<li>加入2 mL新鲜mTeSR1培养基（补充10 µM Y27632）终止消化。使用P1000枪头反复吹打数次，制成单细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板对活细胞进行计数。用台盼蓝染色以标记并排除死细胞。14</li>
	<li>计算所需细胞的总数。对于常规的hPSC传代，接种4 x 105 至 5 × 105 每孔细胞数，6孔板（即， 4.21 × 104 至 5.26 × 104 每厘米2）。将人多能干细胞（hPSCs）传代用于肝细胞分化时，接种 6.5 × 105 至 7.5 × 105 (即， 6.84 × 104 至 7.89 × 104 每厘米2每孔接种于6孔板中的细胞数。 
	注意：每种细胞系的接种密度可能需要根据此处提供的肝脏分化经验密度进行微调。</li>
	<li>将所需细胞悬液转移至无菌的15 mL或50 mL离心管中，在室温下以115 × g离心3分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，然后用新鲜的温热mTeSR1培养基重悬细胞沉淀，培养基中需添加10 µM Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y27632，并使用适量培养基调整至所需细胞密度。 
	注意：为了提高细胞贴壁率和存活率，强烈建议使用ROCK抑制剂。</li>
	<li>将细胞接种至预先准备好的培养板中，轻轻前后左右摇晃，使细胞均匀分布。 
	注意：无论培养板用于常规细胞培养还是肝细胞分化实验，确保细胞在孔中均匀分布至关重要。</li>
	<li>将培养板放入细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育24小时，以使细胞贴壁并恢复。</li>
	<li>第二天观察细胞，若已形成细胞间接触，则撤去ROCK抑制剂。细胞可继续在mTeSR1培养基中进行常规培养，或根据需要更换为分化培养基。 
	注意：如果细胞以所述密度接种，其融合度应适合常规培养或肝细胞分化。</li>
</ol>
2. 在重组层粘连蛋白上将人多能干细胞分化为肝细胞样细胞
<ol>
	<li>配制分化培养基。
	<ol>
		<li>制备人 Activin A 储存液：将人 Activin A 粉末溶解于无菌的 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）/DPBS 中，配制成 100 µg/mL 的储存液。分装成小份，于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。</li>
		<li>制备小鼠 Wnt 3a 储存液：将小鼠 Wnt 3a 粉末溶解于无菌的 0.2% BSA/DPBS 中，配制成 10 µg/mL 的储存液。分装成小份，于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:200。</li>
		<li>制备人肝细胞生长因子（HGF）储存液：将人 HGF 粉末溶解于无菌的 0.2% BSA/DPBS 中，配制成 10 µg/mL 的储存液。分装成小份，于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。</li>
		<li>制备 Oncostatin M（OSM）储存液：将 Oncostatin M（OSM）粉末溶解于无菌的 0.2% BSA/DPBS 中，配制成 20 µg/mL 的储存液。分装成小份，于 -20 °C 保存。使用时稀释 1:1,000。</li>
		<li>配制 500 mL 内胚层诱导储存培养基：加入 2% B27 补充剂（50 倍，不含维生素 A）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 µg/mL）；用 Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）基础培养基定容至 500 mL。注：将储存液于 4 °C 保存，并在两周内使用。每次换液时，从储存液中分装培养基，并新鲜添加 Activin A 和 Wnt 3a（终浓度分别为 100 ng/mL 和 50 ng/mL）。</li>
		<li>配制 500 mL KSR/DMSO 分化培养基：80% 去除血清 DMEM（KO-DMEM）、20% 去除血清替代物（KSR）、0.5% GlutaMAX、1% 非必需氨基酸（NEAA）、0.1 mM β-巯基乙醇、1% DMSO 和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 µg/mL）。真空过滤。于 4 °C 保存，并在两周内使用。</li>
		<li>配制 500 mL HepatoZYME 成熟培养基：加入 1% GlutaMAX、10 µM 氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐（HCC）和 1% 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 IU/mL 和 100 µg/mL）；用 HepatoZYME 基础培养基定容至 500 mL。注：将储存液于 4 °C 保存，并在两周内使用。每次换液时，从储存液中分装培养基，并新鲜添加 HGF 和 OSM（终浓度分别为 10 ng/mL 和 20 ng/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第 1 节所述方法，将 hPSCs 接种于 LN-521 上以进行肝细胞分化。若使用 LN-521/LN-111 作为基质，则以 1:3 的比例将 LN-521 与 LN-111 混合，包被培养板，最终层粘连蛋白浓度为 5 µg/mL；其余操作与纯 LN-521 包被的培养板相同。 
	注：LN-521/LN-111 不适用于 hPSCs 的常规培养，仅用于分化实验。</li>
	<li>接种后 24 小时检查细胞汇合度。当细胞汇合度达到约 40% 时，开始细胞分化。弃去用过的 mTeSR1 培养基，加入含有 100 ng/mL Activin A 和 50 ng/mL Wnt 3a 的新鲜内胚层诱导培养基。此日记为分化第 1 天。 
	注：强烈建议在接种细胞的次日开始分化。</li>
	<li>对于人胚胎干细胞（hESCs），每 24 小时更换一次内胚层诱导培养基，持续 3 天。对于人诱导多能干细胞（hiPSCs），将此阶段延长 2 天，以诱导细胞向定型内胚层样细胞转化，但在这两天中仅使用添加了 100 ng/mL Activin A 的内胚层诱导培养基12。 
	注：为确保内胚层分化的成功，可检测内胚层标志物（如 FOXA2 和 SOX17）的表达水平。根据本实验室的免疫荧光染色结果，超过 80% 的分化细胞对这两种标志物呈阳性。</li>
	<li>在第 4 天（hESCs）或第 6 天（hiPSCs）切换至 KSR/DMSO 分化培养基。在该分化阶段的前 3 天每天换液一次，然后在第 5 天换液一次。 
	注：该分化阶段的第 4 天无需换液。若存在大量死细胞，换液前可用未添加试剂的 KO-DMEM 洗涤细胞一次。为判断该阶段分化是否成功，可检测肝祖细胞标志物（如 AFP、CK19 和 HNF4A）的表达。根据本实验室经验，约 90% 的细胞对这些标志物呈阳性。</li>
	<li>完成 KSR/DMSO 分化阶段 5 天后，切换至 HepatoZYME 成熟阶段。去除 KSR/DMSO 培养基后，用普通 HepatoZYME 基础培养基洗涤细胞一次。加入含有 10 ng/mL HGF 和 20 ng/mL OSM 的 HepatoZYME 成熟培养基。</li>
	<li>每 48 小时换液一次，持续 7 至 10 天，此时细胞即可用于标准表征或进一步使用。 
	注：肝细胞标志物表达检测、代谢功能检测（如细胞色素 P450 活性）、尿素和白蛋白分泌检测、糖原储存检测以及吲哚菁绿（ICG）摄取检测是典型的表征方法。 
	注：分化方案的时间线见图 5。在本实验室，我们常规检测所获得肝样细胞（HLCs）的肝细胞特异性标志物表达水平、白蛋白分泌量以及细胞色素 P450（CYP）3A 和 1A2 的活性。</li>
</ol>

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</ol>

David C. Hay 博士是 Stemnovate Limited 的联合创始人兼董事。

为了推动人类多能干细胞研究和转化医学的发展，需要符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的无异源成分体系。任何分化过程的关键在于细胞外基质（ECM）。细胞外基质不仅支持细胞附着，还提供获取关键信号因子的途径，从而影响细胞命运决定和表型25,26。
层粘连蛋白是在体内的多功能细胞外基质蛋白。in vivo 中，肝脏中层粘连蛋白的分泌对于部分肝切除后的肝再生至关重要27，并且是肝前体细胞维持所必需的28。层粘连蛋白在肝脏维持和再生中的重要性成为我们在肝细胞分化系统中测试市售重组人层粘连蛋白的基础。
与Matrigel相比，在LN-521和LN-521/LN-111基质上实现了更优的肝细胞分化。所获得的肝样细胞（HLCs）在培养皿中明显呈现极性化并有序排列，其细胞功能相较于胶状蛋白混合物组显著改善。这些改善的基础是在层粘连蛋白上污染性结肠相关基因、成纤维细胞相关基因及干细胞相关基因的表达下调，同时细胞增殖和迁移相关基因的表达也有所降低10。
综上所述，本文所述方案所生成的肝细胞样细胞在特性上更接近成人人类肝细胞。该过程具有可重复性，适用于自动化操作，并可经济高效地扩大规模用于实际应用。尤为重要的是，与使用Matrigel的技术相比，批次间的变异显著降低，从而为该领域的研究人员提供了一个更为优化的分化系统。

原代人体组织及其衍生的细胞类型经常被用于基于细胞的筛选研究以及临床应用。然而，由于器官捐献不足以及细胞分离后表型的丧失，这些细胞的获取受到严重限制1。人多能干细胞（hPSCs）为原代组织提供了有前景的替代来源，并可促进产生基因定义明确且可再生的人体体细胞。由hPSCs衍生的肝细胞样细胞（HLCs）在此领域已展现出巨大潜力。HLCs在多个方面与原代人肝细胞相似，包括细胞形态、肝细胞相关基因表达、代谢功能以及对药物和病毒的敏感性2,3,4,5,6,7,8。此外，科研级和符合GMP标准的hPSCs均具有无限增殖和自我更新能力，有利于其广泛应用9,10。
十余年的研究已开发出多种高效的肝细胞分化方案2,3,5,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。然而，这些系统大多使用成分未明确定义的物质和/或病毒转导来驱动肝细胞特化。为了提高该技术在规模化应用中的可靠性，开发一种真正成分明确、无异源物质且符合GMP要求的稳健肝细胞分化系统至关重要。
层粘连蛋白（LNs）是重要的细胞外基质蛋白，能够影响细胞的黏附、增殖、迁移和分化。层粘连蛋白是由一条α链、一条β链和一条γ链组成的异源三聚体糖蛋白。近年来，已成功制备出重组人源层粘连蛋白，并被应用于细胞生物学研究。LN-511已被证实可支持hPSCs的维持21，而LN-521与E-钙黏蛋白的组合则可用于实现人胚胎干细胞的克隆化分离与扩增22。另一方面，LN-111可支持由hPSCs衍生的肝母细胞样细胞的维持23。然而，在我们此前的报道之前，尚未有研究利用层粘连蛋白521和111从hPSCs诱导生成具有成熟特征的肝样细胞（HLCs）10。
本文详细介绍了在LN-521上培养人多能干细胞（hPSCs），并在LN-521或LN-521与LN-111混合基质（LN-521/LN-111）上进行分化的实验步骤。我们通过单细胞接种优化了分化方案，可在多种培养体系中稳定、均一地生成肝样细胞（HLCs）单层14。我们认为，该明确的分化体系为制备具有功能活性的HLCs提供了一种简便且经济高效的方法，在该领域具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>人重组层粘连蛋白521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>人重组层粘连蛋白111</td><td>BioLamina</td><td>LN111-02</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠Wnt3a</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>人激活素A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>人肝细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>人抑瘤素M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y27632&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松21-半琥珀酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>无血清DMEM培养基（Knockout DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME培养基</td><td>Life Technologies</td><td>17705</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（Knockout Serum Replacement）</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>含钙镁的DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr></tbody></table>

由人多能干细胞定义明确且可扩展地生成肝细胞样细胞

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

人类多能干细胞（hPSCs）在生物医学研究中具有重要价值。hPSCs 可以大量扩增并分化为人体内所有类型的细胞。hPSCs 向人类肝细胞样细胞（HLCs）的分化已得到广泛研究，并已建立高效的分化方案。通过结合细胞外基质与生物学刺激（包括生长因子、细胞因子和小分子），已能够生成类似于原代人肝细胞的 HLCs。然而，大多数现有方案仍使用未明确组分，导致批次间差异显著，这成为该技术应用的主要障碍。为解决这一问题，我们开发了一种定义明确的肝细胞分化系统，该系统采用人重组层粘连蛋白作为细胞外基质，并结合无血清分化过程。该系统实现了高效肝细胞定向分化，并在 HLC 的功能和表型方面均表现出显著改善。重要的是，该系统可轻松实现放大，适用于科研及符合 GMP 标准的 hPSC 细胞系&#160;，为基于细胞的疾病模型构建和治疗策略的发展提供了有力支持。

人多能干细胞向肝细胞的分化
一条人类胚胎干细胞系H9和一条人类诱导性多能干细胞系33D6被用于肝细胞分化。结果在 图1-3 来自H9细胞，而那些在 图4 来自33D6细胞。将单个细胞接种到层粘连蛋白上，24小时后形成细胞间接触。当细胞达到约40%汇合度时，启动分化过程（图1A 和 图 4A）。在层粘连蛋白（LN-521 以及 LN-521/LN-111）上，这些细胞经历了连续的形态学变化，并分化为具有极性的肝样细胞（HLCs）图1 和 图4A).
肝样细胞鉴定
第18天收集HLCs，并检测代表性肝细胞标志物HNF4A和ALB的表达情况（图2A）。第18天HLCs的免疫染色显示，近90%的细胞表达HNF4α（图2B）。这些细胞在层粘连蛋白上发生极化，呈现多边形形态，E-钙黏蛋白和F-肌动蛋白的表达可作为标志（图2B）。
还评估了细胞色素P450（CYP）的活性。CYP450在肝细胞中具有重要的代谢功能。在明胶样蛋白混合物（如Matrigel、LN-521或LN-521/LN-111）上分化的第18天肝样细胞（HLCs）被检测了CYP3A活性。结果显示，与Matrigel相比，HLCs在层粘连蛋白基质上的CYP3A活性显著更高（图3）。重要的是，与在这些基质上重新铺板的商用人原代肝细胞（HU1339）相比，HLCs的CYP3A活性水平几乎高出10倍10。
hiPSCs 的分化过程与 hESCs 相似，细胞在形态上表现出依次的变化（图 4A）。所获得的肝样细胞（HLCs）表达关键的肝细胞转录因子 HNF4α（图 4B），并具有 CYP3A 活性且能够分泌白蛋白（图 4C 和 D）。值得注意的是，33D6 细胞系来源的 HLCs 其 CYP3A 活性较 H9 细胞系来源的 HLCs 有所降低（图 3），但仍与人原代肝细胞水平相当10。然而，这些 HLCs 的白蛋白分泌水平明显低于原代肝细胞10。
<img alt="显示细胞形态的 A-D 细胞培养物在 200µm 尺度下的组织学显微图像。" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：肝向分化过程中的连续形态学变化。(A) 单细胞接种的未分化 hESCs 在接种后 24 小时达到约 40% 的融合度。(B) 诱导后，细胞在第 4 天表现出典型的内胚层形态。(C) 达到肝前体样阶段时，细胞在第 9 天呈现明显的多边形形态。(D) 经过成熟阶段后，极化的肝样细胞（HLCs）已准备好进行进一步表征，图中显示为第 18 天。比例尺 = 200 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析；柱状图，荧光显微镜图像；HNF4α，ALB比较，统计学显著性。" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：肝样细胞（HLCs）的表征。（A） 肝细胞特异性标志物 HNF4A（左）和 ALB（右）的基因表达。利用在LN-521和LN-521/LN-111基质上由hESCs分化而来的第18天HLCs分析表达水平，并以看家基因 GAPDH 进行归一化，相对hESCs表达。结果代表三次生物学重复，误差线表示标准差（SD）。* p &lt; 0.05，** p &lt; 0.01；非配对t检验。（B） 关键肝细胞标志物HNF4α以及极性标志物E-钙黏蛋白和F-肌动蛋白的蛋白表达。在LN-521和LN-521/LN-111基质上的第18天HLCs经上述标志物染色，并用Hoechst 33342复染。以相应的免疫球蛋白G（IgG）作为阴性对照。图中显示HNF4α阳性细胞的百分比及其标准差，该数值由四个随机视野计算得出。图像放大倍数为20倍。比例尺 = 100 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CYP3A酶活性比较柱状图；RLU/ml/mg中统计学显著性 *p&lt;0.01*。" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：肝样细胞（HLCs）的代谢功能表征。检测了在Matrigel（MG）、LN-521或LN-521/LN-111上培养的细胞中CYP3A的细胞色素P450活性。数据代表三次生物学重复实验，误差线表示标准差（SD）。** p &lt; 0.01；采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析（one-way ANOVA）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养的组织学显微图像、免疫荧光检测结果、基因表达柱状图。" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：HLCs 的标准表征。 在 LN-521 上培养的 hiPSCs 被分化为 HLCs。对第 17 天的 HLCs 进行了标准表征检测。(A) 肝细胞分化过程中细胞的连续形态变化；所示时间点分别为第 1、4、9 和 17 天的细胞。(B) HNF4α 表达的免疫染色。基于四个随机视野，显示阳性细胞百分比及其标准差（SD）。图像拍摄放大倍数为 20 倍。比例尺 = 100 µm。(C) 第 17 天 HLCs 的 CYP3A 活性。数据来自六次生物学重复实验，误差线表示标准差（SD）。(D) 分化所得 HLCs 在培养中 24 小时内的白蛋白分泌量。数据来自四次生物学重复实验，误差线表示标准差（SD）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝细胞分化示意图，hESCs 和 hiPSCs 时间线；从内胚层到肝细胞的各个阶段。" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：分化方案的示意图时间线。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种可扩展且符合优良生产规范（GMP）的人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的体系。该体系为开展基础和应用型人类肝脏研究提供了成本效益高且标准化的人肝细胞样细胞制备方法。

人类多能干细胞（hPSCs）在生物医学研究中具有重要价值。hPSCs 可被扩增并分化为人体内所有类型的细胞……

本方案的总体目标是在定义明确的条件下，利用重组层粘连蛋白基质将多能干细胞诱导分化为类人肝细胞。该方法使研究者能够在体外定制功能性人肝细胞，用于研究肝脏生物学特性。该技术的主要优势在于其成分明确，可实现肝细胞的大规模生产，并具有高度的实验可重复性。开始实验时，将重组层粘连蛋白-521（即LN-521）储存液在4°C条件下解冻，其浓度为100微克/毫升。将解冻后的LN-521用预冷的含钙镁的1×DPBS稀释，配制成5微克/毫升的工作液。取1毫升5微克/毫升的LN-521工作液加入6孔板的一个孔中，轻轻摇动孔板使溶液均匀覆盖孔底。随后，将孔板置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中孵育至少2小时，以供紧急使用。将包被好的孔板从培养箱转移至组织培养超净台中，小心吸除包被用的LN-521溶液，避免损伤包被表面。随后立即加入1毫升预热的mTeSR培养基

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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