结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离
2017年7月18日
我们描述了通过将肿瘤细胞或类器官注射到小鼠盲肠中建立原位结直肠肿瘤模型，并从此模型中后续分离循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。
该显微外科技术的总体目标是将结直肠肿瘤细胞注射到盲肠壁内，以在小鼠体内诱导出可重复且具有转移性的结直肠肿瘤。该方法可解答循环肿瘤细胞生物学领域的关键问题，其主要优势在于所形成的肿瘤高度可重复且均一，从而能够可靠地预测肿瘤分期和循环肿瘤细胞情况。首先使用无创镊子小心地将一只6至8周龄免疫缺陷小鼠的盲肠拉出体外。
将盲肠的盲端置于腹部，使盲肠袋朝向头侧。进行盲肠内注射时，将配备30号针头的标准1毫升注射器连接到安装于显微操作仪上的微量注射泵，并装入肿瘤细胞。接着，用无创镊子小心夹住盲肠尖端，用另一把镊子蘸取温热的生理盐水，轻轻向下抚平盲肠表面。
现在将动物移至双目手术显微镜下，使套管针与盲肠平行并位于其上方，用两把无创镊子小心地拉伸盲肠外露末端两端的组织。缓慢将盲肠拉过套管针，注意不要穿透肠壁全层或浆膜层（除初始穿刺点外），并将套管针置于血管上方、肠壁内层薄而半透明的膜下方。当套管针就位后，使用脚踏开关在20秒内注入20 µL细胞悬液。
位于浆膜下透明的浆膜层与肌层之间的血管上方。当所有细胞注射完毕后，小心拔出套管，并在盲肠下方放置一块干燥的棉片。为防止人为的腹膜播散，用大量蒸馏水冲洗以裂解任何外漏的细胞，并轻柔地将盲肠复位至腹腔内。
使用快速吸收的连续缝合线缝合腹壁，皮肤则使用外科伤口夹闭合。随后将小鼠置于设定为38摄氏度的加热垫上，并持续监测直至完全恢复卧姿。为分离循环肿瘤细胞，在适当的实验终点，向每支15毫升锥形管中加入5毫升密度梯度介质，并小心地将从荷瘤动物采集的全血样本转移至密度梯度层上。
通过离心分离细胞，并小心收集含有单个核细胞的界面层。用移液器将单个核细胞转移至新的15毫升离心管中，进行第二次离心。随后用PBS洗涤离心管。
第二次洗涤后，将沉淀重悬于200 µL含EDTA的PBS中，并向每个样品中加入4 µL抗amp cAMP抗体，在冰上避光孵育20分钟。接着，使用疏水屏障笔在每个样品对应的无菌6 cm培养皿中画一个直径约1 cm的圆圈，向每个圆圈中加入700 µL挑取缓冲液，随后加入50 µL细胞悬液。用显微镜检查细胞密度，并让样品静置约5分钟。
然后对细胞液滴进行amp camp阳性的筛选，并使用显微操作仪将感兴趣的细胞转移至15 µL适当缓冲液中，用于后续预定的下游分析。在此模型中使用结直肠细胞，可在肿瘤细胞注射后35天内稳定地获得更多的小鼠成瘤，原发肿瘤大小约为10毫米，并几乎必然出现肝转移、肺转移及循环肿瘤细胞。此外，循环肿瘤细胞可被轻松分离，用于下游分析。
一旦掌握并正确操作，该技术可在10分钟内完成，有助于形成均一且具有转移性的肿瘤，可用于治疗学和分子学研究。该模型的局限性包括其对细胞裂解的依赖性，而细胞裂解本身存在局限性，以及小鼠的免疫缺陷，这些问题均可通过使用突变型结直肠癌细胞加以克服。由于该模型操作简便，可能成为目前可用的结直肠癌模型中有价值的补充。
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概述
本文介绍了一种通过将肿瘤细胞注射到小鼠盲肠以建立原位结直肠肿瘤的显微外科技术。该方法可用于分离循环肿瘤细胞（CTCs），并为研究转移性结直肠癌提供了一种可重复的模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 神经科学
- 细胞生物学
背景
- 循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中发挥着关键作用。
- 建立可靠的循环肿瘤细胞研究模型对癌症研究至关重要。
- 该技术旨在生成均一的肿瘤，以获得更理想的实验结果。
- 使用免疫缺陷小鼠可实现对人类肿瘤细胞的研究。
研究目的
- 建立一种可在小鼠中重复的结直肠癌模型。
- 促进循环肿瘤细胞及其生物学特性的研究。
- 加深对肿瘤进展和转移机制的理解。
使用的方法
- 将肿瘤细胞注射至小鼠盲肠壁。
- 使用无创镊子小心操作盲肠。
- 利用微量注射泵精确递送肿瘤细胞。
- 注射后监测肿瘤生长及循环肿瘤细胞（CTC）的分离。
主要结果
- 成功在小鼠体内建立原位结直肠肿瘤。
- 从已建立的肿瘤中分离循环肿瘤细胞。
- 验证该肿瘤模型的可重复性。
- 具备可靠预测肿瘤分期及循环肿瘤细胞行为的潜力。
结论
- 显微外科技术为结直肠癌研究提供了有价值的工具。
- 该模型可增进对循环肿瘤细胞（CTC）生物学的理解。
- 未来的研究可利用该方法推动治疗手段的开发。
常见问题
执行层面的行业相关性
建立可重复的原位肿瘤模型对于降低结直肠癌药物研发中靶点验证的风险、提高疗效预测的可信度至关重要。该显微外科技术可实现循环肿瘤细胞（CTCs）的可靠分离，支持对转移机制及治疗反应的机制性研究。该模型通过提供一种与疾病高度相关的体系，用于体内评估肿瘤生物学特性及治疗效果，弥补了关键的转化医学空白。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过均一的肿瘤形成和稳定的循环肿瘤细胞（CTC）释放，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供标准化系统，可利用原发性肿瘤、二维细胞系或三维类器官进行功能靶点验证。
- 预测价值：通过关联肿瘤生长与转移潜能及CTC检测，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪： 生成适用于下游循环肿瘤细胞（CTC）分离与分析工作流程的荷瘤模型。
- 可重复性： 产生均一的肿瘤并获得稳定的CTC产量，从而实现可靠的化合物筛选条件。
- 可扩展性： 有助于制备经过验证的生物系统，用于高通量CTC相关检测。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：在免疫功能低下的宿主中模拟人类结直肠癌的进展过程，包括肝转移和肺转移。
- 转化连续性：通过实现循环肿瘤细胞（CTC）的分离，连接发现阶段与临床前验证，支持生物标志物和药物动力学研究。
- 基于风险的决策：根据体内观察到的转移负荷和循环肿瘤细胞动态，支持做出继续或终止研究的决策。
流程与工作流整合
该方法可整合到从早期靶点验证、先导化合物鉴定到临床前药效测试的整个发现流程中，尤其适用于以转移为重点的研究项目。
- Discovery Biology：通过稳定的肿瘤成瘤和循环肿瘤细胞（CTC）生成，支持对转移驱动因子及通路调控的假设验证。
- Screening：通过可靠的CTC分离实现检测标准化，支持化合物评价的定量读数。
- Analytics：提供CTC得率和纯度指标，有助于比较不同治疗条件及作用机制。
- Translational Research：通过纵向监测CTC作为药效动力学生物标志物，连接临床前研究的连续性。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的原位移植平台，适用于结直肠癌不同靶点及治疗方式的拓展应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高转移模型的预测可信度，降低循环肿瘤细胞（CTC）生物学机制的不确定性。
- 操作价值：提供标准化、可重复的肿瘤模型，并产生可量化的CTC输出结果。
- 战略价值：通过将肿瘤负荷与CTC动态变化相关联，优化决策流程，降低后期研发失败风险。
- 项目组合影响：基于转移抑制能力和CTC清除效果，实现风险调整后的候选药物优先排序。
实施注意事项
- 需要具备原位注射和组织处理方面的显微外科专业技术。
- 依赖显微注射泵、显微操作器和手术显微镜以实现精确给药。
- 需要标准化的肿瘤细胞制备方案，适用于二维、三维或原代来源的细胞。
- 需要循环肿瘤细胞（CTC）分离基础设施，包括密度梯度离心和基于抗体的筛选方法。
- 受限于对免疫缺陷宿主的依赖，可能影响与免疫相关的治疗研究。
