Name: 在直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解利用显微外科技术在小鼠盲肠壁注射结肠癌细胞以建立原位直肠癌模型的方法。该技术可分离循环肿瘤细胞，为研究肿瘤转移提供可重复的实验模型。

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本工作由德国研究基金会（WE 3548/4-1）和Roland-Ernst医疗基金会（1/14）资助。

此处所述的动物实验已分别通过机构和政府动物护理与使用委员会的独立审查并获得许可，并依照 国际实验动物科学协会联合会 （FELASA）指南。已采取一切可能的措施以减轻动物痛苦，包括使用麻醉和镇痛措施，或在必要时实施过早安乐死。
1. 细胞和类器官的制备
注意：每次注射使用 20 µL 体积，含 100,000 个细胞。使用基底膜基质（BMM）以防止泄漏并确保标准化注射。为确保结果可重复，应进行细胞系鉴定实验（例如, 通过 STR 分型）定期进行。
<ol>
	<li>从新鲜组织制备原代细胞悬液 
	注意：务必在无菌条件下操作。为确保细胞的高存活率，需将手术室中 freshly resected 组织立即置于冰上并转移至实验室。 
	患者的健康和最佳治疗必须始终是首要考虑。因此，用于研究的组织样本必须以不影响切除肿瘤后续病理检查和分期的方式获取。大多数情况下，由经过培训的病理学家来获取研究样本是合理的选择，以确保不影响病理诊断。
	<ol>
		<li>从切除标本中无菌取出后立即进行（理想情况下约1 cm）3），将组织样本放入已预装20-30 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的50 mL离心管中。将管子置于冰上，并立即转移至实验室。</li>
		<li>将组织放入培养皿中，用大量 PBS 清洗两次，以去除残留血液。</li>
		<li>用手术刀将组织切成小块（约 2-4 mm）。例如，使用#20或#36刀片）。</li>
		<li>根据制造商的说明使用解离仪，将肿瘤组织进一步解离为单细胞悬液。或者，采用其他酶消化肿瘤组织的方案。</li>
		<li>计数所得单细胞悬液中的细胞例如，使用库尔特计数器或血细胞计数板）。</li>
		<li>离心（1,500 × g，5 分钟）并用 PBS 将细胞悬液洗涤两次。</li>
		<li>以5 x 10⁶个细胞/mL的浓度将细胞重悬于BMM中6 细胞/mL，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞系注射前的制备
	<ol>
		<li>在标准培养条件下（37 °C，5% CO₂）培养所有结直肠癌细胞系。2）并在手术当天进行制备。</li>
		<li>根据标准细胞培养方案收集细胞，计数细胞（例如使用细胞计数器（如库尔特计数器或血细胞计数板）计数，并根据待注射动物数量计算所有注射所需的细胞量。</li>
		<li>准备实际所需体积的3-5倍，以弥补移液过程中的损耗以及进样注射器的死体积。</li>
		<li>离心（1,500 g，5 分钟）并用 PBS 将细胞悬液洗涤两次。</li>
		<li>以5 x 10⁶个细胞/mL的浓度将细胞重悬于BMM中6 细胞/mL，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官制备 
	注意：所有三维类器官培养均在标准培养条件下进行（37 °C，5% CO₂）。2）。有关类器官培养的详细方案此前已有发表。18,19,20 与传统细胞系类似，我们建议每次注射使用20 µL BMM，含100,000个细胞。类器官在手术当天按如下步骤制备：
	<ol>
		<li>配制以下培养基（下文简称DMEM/F12+++）：Advanced Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 + 1% HEPES（1 M）+ 1% 谷氨酰胺（200 mM）+ 1% 青霉素/链霉素。</li>
		<li>预先在15 mL离心管中加入1 mL DMEM/F12+++。</li>
		<li>小心地将类器官从培养板表面吸出，将3至5个孔的内容物转移至一个15 mL离心管中。</li>
		<li>用延长的玻璃移液管反复吹打类器官，将其小心地分散成更小的碎片。</li>
		<li>加入5 mL DMEM/F12+++至离心管中，随后以1,000 x g离心5分钟。</li>
		<li>离心后，弃去上清液，将沉淀重悬于600 µL酶解解离缓冲液中，并将悬液转移至6孔板的一个孔内。</li>
		<li>在37 °C下孵育1-5分钟，然后小心地用移液器将悬液上下吹打，以溶解类器官。 
		注意：通过显微镜验证消化效果；当所有细胞簇均已解离为单个细胞时，即为消化完全。</li>
		<li>消化成功后，加入1.4 mL DMEM/F12+++以终止消化反应。随后将所有已消化类器官转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>计数细胞并计算所有注射所需的细胞量。</li>
		<li>准备实际所需体积的3至5倍，以弥补移液过程中的损耗以及进样注射器的死体积</li>
		<li>离心（1,500 × g，5 分钟）并用 PBS 将细胞悬液洗涤两次。</li>
		<li>将细胞重悬于BMM中，浓度为5 x 106 细胞/mL，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原位小鼠模型
<ol>
	<li>手术受体动物的准备 
	注意：使用6-8周龄的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NOD scid gamma，NSG）小鼠作为受体。21 NSG小鼠是免疫缺陷程度最高的小鼠品系之一，缺乏成熟的B细胞、T细胞和NK细胞，并具有多种其他免疫缺陷。21 即使注射少量细胞，它们也能稳定地形成肿瘤，且极易发生远处转移。NSG小鼠繁殖性能良好，可在常规的无特定病原体（SPF）环境中饲养。
	<ol>
		<li>首次切口前，皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡。</li>
		<li>使用3-3.5 vol%的七氟烷进行全身麻醉。足趾夹捏反射消失表明麻醉已足够。</li>
		<li>用眼用软膏覆盖麻醉小鼠的眼睛，以防止角膜干燥。</li>
		<li>将小鼠仰卧位固定在小手术台上。</li>
		<li>使用电动剃须刀剃除腹部毛发（也可使用脱毛膏），并交替使用氯己定/碘液和70%酒精至少消毒三次。</li>
		<li>用无菌手术巾覆盖手术区域。 
		注意：围手术期使用抗生素为可选操作，应遵循机构指南。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹正中切口及盲肠暴露
	<ol>
		<li>使用剪刀（也可使用手术刀）在下腹部正中皮肤做一小切口（3 - 5 mm）。用镊子夹起腹壁肌层，并用剪刀小心剪开，从而打开腹腔。</li>
		<li>使用无创镊子识别并小心将盲肠拉出体外。将盲肠的盲端朝向头侧放置于腹部表面。</li>
		<li>盲肠一旦暴露，应始终使用温盐水纱布保持其湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原位注射、腹腔关闭及术后恢复
	<ol>
		<li>进行盲肠内注射时，使用标准的1 mL注射器配30 G套管针。将该注射器安装在微注射泵上，微注射泵则固定于显微操作仪上。</li>
		<li>用无创镊子小心夹住盲肠尖端，并用另一对浸有温盐水的镊子自上而下轻柔抚平盲肠表面。</li>
		<li>将套管针正对盲肠上方定位。</li>
		<li>在双目手术显微镜下进行以下操作，确保视觉控制。</li>
		<li>用两把无创镊子分别夹住盲肠外露部分的两端，轻轻拉伸，并缓慢将盲肠组织拉过位于其正上方且平行放置的套管针。操作中必须避免穿透整个肠壁（否则细胞将被注入肠腔），也应避免在初始穿刺点之外进一步穿透浆膜层，否则会导致细胞泄漏和腹膜播散。
		<ol>
			<li>应将肠管向套管针方向移动，而非将套管针推向肠管。用两把镊子夹持并拉伸肠管。操作者双手应置于稳定表面，以减少震颤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞注射至浆膜层（可见为肌层血管上方极薄且半透明的膜）与肌层之间。因此，套管针必须在视野中位于血管上方、薄而透明的膜下方。</li>
		<li>使用脚踏开关启动注射，以减少套管针位于肠壁内时的手部震颤。</li>
		<li>套管针到位后开始注射，持续时间为20秒，即泵控制单元设定为1 µL/s。 
		注意：若注射至受损血管内或附近，会导致细胞直接进入血管系统，引起远处转移，应避免此类情况。</li>
		<li>注射完成后，小心向后撤出套管针。</li>
		<li>在盲肠下方放置一块干燥纱布，然后用蒸馏水彻底冲洗盲肠，以裂解可能泄漏的细胞，从而防止人为的腹膜播散。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔关闭及术后恢复
	<ol>
		<li>冲洗后，轻柔地将盲肠复位至腹腔内。</li>
		<li>使用6-0快速吸收缝线连续缝合腹壁。</li>
		<li>使用外科伤口夹关闭皮肤。</li>
		<li>将小鼠置于设定为38 °C的加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
		<li>在术后48小时内密切观察小鼠状况。如出现痛苦表现，每12小时给予0.05 mg/kg丁丙诺啡治疗。</li>
		<li>至少每日一次监测小鼠因肿瘤生长导致的痛苦迹象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从全血样本中分离循环肿瘤细胞
注意：对麻醉小鼠进行经皮心脏穿刺采血，随后实施安乐死。理想情况下，将1,000 µL血液吸入预先加入100 µL抗凝剂（乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素）的注射器中。使用抗人EpCAM（上皮细胞黏附分子）抗体来识别循环肿瘤细胞（CTC）。当小鼠模型中使用人上皮细胞系时，该方法效果良好。对于其他应用，可能需要使用不同的抗体。
<ol>
	<li>CTC 富集：
	<ol>
		<li>在 15 mL 离心管中预先加入 5 mL 密度梯度介质，然后小心地将血液转移至该 15 mL 管中。</li>
		<li>离心（300 × g，30 分钟，无刹车），并小心移除上层上清液。</li>
		<li>将剩余液体倒入新的 15 mL 离心管中，再次离心（300 × g，15 分钟，有刹车）。</li>
		<li>收集含有单个核细胞的界面层（弃去其余部分），并用 PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL PBS/1% EDTA 中，加入 4 µL EpCAM 抗体，冰上避光孵育 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选与挑取
	<ol>
		<li>配制以下缓冲液（下文称为挑取缓冲液）：PBS + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素（1%）+ 0.8% EDTA。</li>
		<li>使用 PAP 笔在 6 cm 无菌培养皿内画一个约 1 cm 的圆圈（防止液体在培养皿中扩散），并在该圆圈内加入 700 µL 挑取缓冲液。</li>
		<li>在圆圈内的 700 µL 挑取缓冲液中加入 50 µL 细胞悬液。在显微镜下检查细胞密度。若密度过高，将样品分装至不同的培养皿中。</li>
		<li>静置约 5 分钟，使细胞沉降。</li>
		<li>在细胞悬液液滴中筛选染色阳性（即 EpCAM 阳性）的细胞。</li>
		<li>一旦发现目标细胞，使用显微操作仪挑取该细胞，并将其放入 50 µL 缓冲液中，缓冲液类型根据后续分析目的而定（例如，RNA 提取缓冲液或培养基）。</li>
		<li>根据后续分析需求，同时分离 EpCAM 阴性细胞和/或培养基作为阴性对照。</li>
		<li>进行后续分析（例如，细胞培养、PCR）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管新化合物在皮下小鼠模型中已显示出临床前活性，但绝大多数化合物在临床试验中失败，无法进入临床应用。11 皮下小鼠模型在准确模拟肿瘤生物学特性及生长模式方面的明显不足，促使研究人员开发了原位小鼠模型，该模型通过将肿瘤细胞直接注射到原始器官中建立。
原位小鼠模型在模拟实体瘤的生物学行为及播散过程方面，比皮下模型更为准确。15 然而，其主要缺点是可重复性较差，尤其是在空腔器官等技术要求较高的器官中，以及肿瘤生长监测过程技术难度较大。因此，在本模型中，我们选择在预设的时间点评估肿瘤大小，而非进行多次影像学检查，从而减少了技术操作复杂且对动物造成应激的检测次数。本研究所描述的模型可用于多种应用，如肿瘤细胞系的表征15、肿瘤生物学及播散机制的研究，以及治疗试验17。明显的终点指标包括原发肿瘤的大小和远处转移灶的数量，但也可采用更复杂的终点指标，如循环肿瘤细胞（CTC）数量<sup class="xref...

结直肠癌（CRC）是西方国家癌症死亡最常见的原因之一。1 尽管原发性肿瘤通常可以切除，但远处转移的发生会显著恶化预后，并常常导致死亡。2,3 转移的生物学对应物是循环肿瘤细胞（CTCs），这些细胞从肿瘤脱落，能在循环系统中存活，附着于靶器官的上皮组织，侵入器官并最终增殖形成新的病灶。4 尽管已知CTCs具有预后相关性，5,6,7,8,9 但由于其在结直肠癌中极为稀少，其生物学特性仍仅被部分阐明。10
小鼠模型是研究癌症生物学各个方面的有力工具。经典的皮下肿瘤模型是通过将肿瘤细胞接种到受体小鼠的皮下组织中建立的，受体小鼠可以是免疫功能健全的（若使用同源小鼠肿瘤细胞）或免疫缺陷的。皮下肿瘤模型成本较低，且能快速获得数据；其终点肿瘤的生长情况可方便地通过非侵入性方法进行测量。然而，在此类模型中显示出抗肿瘤活性的新化合物中，有88%在临床试验中失败11。这一现象部分归因于人与小鼠之间的种间差异；但更大程度上是由于皮下小鼠模型的预测价值较低所致。
因此，在癌症研究中，原位小鼠模型的应用日益增多，该模型将肿瘤细胞注射到其来源器官中，使其在原始微环境中生长。11,12,13,14 原位模型不仅能模拟局部肿瘤生长条件；由于肿瘤生长部位解剖位置正确，原位小鼠模型还可真实模拟转移过程，因此被用于研究循环肿瘤细胞（CTC）生物学8,15,16 或其在结直肠癌（CRC）中对不同治疗的反应。13,17
原位小鼠模型的一个主要缺点是其技术复杂性。根据需要注射细胞的器官不同，实验人员需要经历较长的学习过程，才能诱导出可重复的肿瘤。这一点在结直肠癌模型中尤为突出，因为肿瘤细胞需被注射至肠壁，而这一操作常导致肠穿孔、肿瘤细胞泄漏或腔内肿瘤细胞丢失。本文旨在介绍从原代组织样本、二维细胞系以及三维类器官培养物中制备细胞的方法，并将其注射至小鼠盲肠的技术。本文所述技术可产生高度均一的肿瘤，并且根据所用细胞系的肿瘤生物学特性，可在受体小鼠中实现远处转移和循环肿瘤细胞（CTCs）的可重复形成。15

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养基及组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/F12 +++ 培养基</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/F12 +++ 培养基</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I 补充剂（200 mM）</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/F12 +++ 培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PenStrep）</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/F12 +++ 培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>二维细胞系基础培养基（DMEM/10% FCS）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>2D细胞系基础培养基（DMEM/10% FCS）</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶解消化缓冲液</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质（BMM，无酚红）</td><td>康宁生命科学有限责任公司</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%，酚红）</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>带盖的6孔/48孔板</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶 75 cm&amp;sup2;，250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>150 cm 细胞培养瓶&amp;sup2;，600 mL</td><td>康宁生命科学有限公司</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL / 2 mL 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 mL、50 mL 离心管</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10计数板（适用于TC20细胞计数仪）</td><td>伯乐生命科学有限公司</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（玻璃，150 mm）</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>使用本生灯轻轻拉细</td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>用于原发肿瘤组织制备</td></tr><tr><td>MACSmix 试管旋转仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>用于原发肿瘤组织制备</td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>用于原发性肿瘤组织制备</td></tr><tr><td>人类肿瘤解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>用于原发性肿瘤组织制备</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m细胞筛</td><td>康宁生命科学有限公司</td><td>352350</td><td>用于原发肿瘤组织制备</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>AbbVie Germany GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>医用氧气</td><td>Air Liquide Medical GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>丁丙诺啡</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen - 眼科软膏</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水 (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>注射用水</td><td>布劳恩</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器（无死体积） - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G注射针头</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>纤维素拭子</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>显微Adson镊</td><td>FST - 精密科学工具</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪 - ToughCut</td><td>FST - 精密科学工具</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar持针器</td><td>FST - 精密科学工具</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip试剂盒</td><td>FST - 精密科学工具</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1（外科缝线）</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson 医疗有限公司</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>带氧气快速冲洗功能和七氟烷蒸发器的台式科研麻醉机</td><td>帕克兰科学</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro 泵配 Micro4 控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>高度可控的原位注射设备</td></tr><tr><td>SYS-Micro4 控制器脚踏开关</td><td>世界精密仪器公司</td><td>15867</td><td>高度可控的原位注射设备</td></tr><tr><td>三轴手动显微操作器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>M325</td><td>高度可控的原位注射设备</td></tr><tr><td>用于显微操作器的磁力架</td><td>世界精密仪器公司</td><td>M10</td><td>高度可控的原位注射设备</td></tr><tr><td>M10磁力搅拌器用钢制底板</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>高度可控的原位注射设备</td></tr><tr><td>加热板 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>伊西斯 - 脱毛剃刀</td><td>AESCULAP - 贝朗</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>双目手术显微镜</td><td>帕克兰科学</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;循环肿瘤细胞分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质 &amp;ndash; Ficoll</td><td>StemCell - 淋巴细胞分离液</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记抗人 CD326（EpCAM）抗体，克隆号 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的小鼠 CD326 (EpCAM) 抗体，克隆号 G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 &amp;oslash; 60 × 15 mm，21 cm&amp;sup2;，通风</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>荧光细胞培养显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r 显微操作仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>连接至显微操作仪的抽吸泵</td></tr><tr><td>Dmz 通用微电极拉制仪</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>用于制造单细胞吸取用微毛细管的必要条件</td></tr><tr><td>Prism 玻璃毛细管</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>挑选缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>挑选缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PenStrep）</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>挑选缓冲液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>挑选缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;免疫组织化学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗人 CD326（EpCAM）抗体克隆 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM 免疫组织化学（参见图 2C）</td></tr><tr><td>HRP标记的兔抗小鼠IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM 免疫组织化学（参见图 2C）</td></tr></tbody></table>

结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

尽管皮下小鼠模型具有操作简便和成本低廉的优势，但其存在严重局限性，无法准确模拟肿瘤生物学特性和肿瘤细胞的播散过程。为克服这些局限性，已引入原位小鼠模型；然而，这类模型技术要求较高，尤其是在大肠等空腔器官中更为困难。为了产生生长稳定且可重复转移的均一肿瘤，肿瘤细胞制备与注射的标准化技术至关重要。
我们建立了一种结直肠癌（CRC）的原位小鼠模型，该模型可形成高度均一的肿瘤，适用于肿瘤生物学研究以及治疗试验。来源于原发肿瘤、二维（2D）细胞系或三维（3D）类器官的肿瘤细胞被注射至盲肠，根据所注射肿瘤细胞的转移潜能，可形成高度转移性的肿瘤。此外，可常规检测到循环肿瘤细胞（CTCs）。本文详细描述了从二维细胞系、三维类器官以及原发肿瘤组织制备肿瘤细胞的技术，手术与注射方法，荷瘤小鼠中循环肿瘤细胞的分离方法，并提供了常见问题的解决建议。

在此模型中，结直肠肿瘤的成功且可重复地生成，关键取决于细胞注射的准确性，避免溢出或泄漏。若能做到这一点，该模型具有极高的可靠性，极少导致人为的腹膜播散。肿瘤的生长动力学及其播散模式取决于所用类器官和细胞的生物学特性。15 在此模型中，HCT116 细胞可稳定地向肝脏转移，而 SW620 细胞则形成原位肿瘤，但不发生转移。15
在此模型中使用 HCT116 细胞，通常在肿瘤细胞注射后 35 天内导致小鼠进入濒死状态。原发性肿瘤大小约为 10 mm（图 1A 和 图 2A），肝转移灶（图 1B 和 图 2B）、肺转移灶（<st...

我们描述了通过将肿瘤细胞或类器官注射到小鼠盲肠中建立原位结直肠肿瘤模型，并从此模型中后续分离循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。

尽管皮下小鼠模型具有易于应用和成本效益高的优点，但其存在严重局限性，无法准确模拟……

该显微外科技术的总体目标是将结直肠肿瘤细胞注射到盲肠壁内，以在小鼠体内诱导出可重复且具有转移性的结直肠肿瘤。该方法可解答循环肿瘤细胞生物学领域的关键问题，其主要优势在于所形成的肿瘤高度可重复且均一，从而能够可靠地预测肿瘤分期和循环肿瘤细胞情况。首先使用无创镊子小心地将一只6至8周龄免疫缺陷小鼠的盲肠拉出体外。将盲肠的盲端置于腹部，使盲肠袋朝向头侧。进行盲肠内注射时，将装有肿瘤细胞、配备30号针头的标准1毫升注射器安装在固定于显微操作仪的微量注射泵上。接着，用无创镊子小心夹住盲肠尖端，并用另一把蘸有温盐水的镊子轻轻向下抚平盲肠表面。现在将动物移至双目手术显微镜下，使套管针与盲肠平行并位于其上方，用两把无创镊子小心地拉伸盲肠外露端两端的组织。缓慢将盲肠拉过套管针，注意不要穿透肠壁全层或浆膜层（除初始穿刺点外），并将套管针置于血管上方、肠壁内层薄而半透明的膜下方。当套管针就位后，使用脚踏开关在20秒内注入20微升细胞悬液。位于浆膜下透明的浆膜层与肌层之间的血管上方。当所有细胞注射完毕后，小心拔出套管，并在盲肠下方放置一块干燥的棉片。为防止人为的腹膜播散，用大量蒸馏水冲洗以裂解任何外漏的细胞，并轻柔地将盲肠复位至腹腔内。使用快速吸收的连续缝线缝合腹壁，皮肤则使用外科伤口夹闭合。随后将小鼠置于设定为38摄氏度的加热垫上，并持续监测直至完全恢复卧姿。为分离循环肿瘤细胞，在适当的实验终点，向每支15毫升锥形管中加入5毫升密度梯度介质，并小心地将从荷瘤动物采集的全血样本转移至密度梯度层上。通过离心分离细胞，并小心收集含有单个核细胞的界面层。用移液器将单个核细胞转移至新的15毫升离心管中，进行第二次离心。随后用PBS洗涤离心管。第二次洗涤后，将沉淀重悬于200 µL含EDTA的PBS中，并向每个样品中加入4 µL抗amp cAMP抗体，置于冰上避光孵育20分钟。接着，使用疏水屏障笔在每个样品对应的无菌6 cm培养皿中画一个直径约1 cm的圆圈，向每个圆圈中加入700 µL挑取缓冲液，随后加入50 µL细胞悬液。使用显微镜检查细胞密度，并让样品静置约5分钟使其沉降。然后对细胞液滴进行amp camp阳性筛选，并使用显微操作仪将感兴趣的细胞转移至15 µL适当缓冲液中，用于后续预定的下游分析。在此模型中使用结直肠细胞，可在肿瘤细胞注射后35天内稳定地获得更多的小鼠成瘤，原发肿瘤大小约为10 mm，并几乎必然出现肝转移、肺转移及循环肿瘤细胞。此外，循环肿瘤细胞可轻松分离，用于下游分析。一旦掌握并正确操作，该技术可在10分钟内完成，有助于形成均一且具有转移性的肿瘤，可用于治疗学和分子学研究。该模型的局限性包括其对细胞裂解的依赖性（细胞裂解本身存在局限性）以及小鼠的免疫缺陷，但这些问题可通过使用突变型结直肠癌细胞加以克服。由于该模型操作简便，可能成为现有结直肠癌模型的有益补充。

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Research

科研

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Cancer Research

癌症研究

在直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。...

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