用于研究肿瘤细胞神经保护作用及侵袭性的海马组织切片器官型培养模型

使用振动切片机制备和切片。在切片过程中需要三个琼脂块以稳定脑组织。为避免污染，请使用经过高压灭菌的器械套装。

移除琼脂。应先在滤纸上晾干，再使用医用氰基丙烯酸酯胶将其粘贴到金属板上。用刮铲小心取出脑组织，并将其轻轻放入盛有制备液的培养皿中。

接下来，用滤纸将脑组织短暂吸干。在金属板上涂布医用氰基丙烯酸酯胶水。使用镊子和刮勺将脑组织放置在样品托上。

使用先前准备好的两块琼脂，从两侧确保机械稳定性。此时，应将脑组织放置在琼脂块旁边，并用另外两块琼脂固定，以防止切片过程中受损。将金属板放入振动切片机中，并用冷的制备液覆盖组织。

随后，使用滑动式振动切片机将组织水平切成350微米厚的离体海马脑片（OHSC）。用折断的巴斯德移液管背面收集切片，并将其转移至培养皿中。将脑片保存在冷的制备液中。

使用双目显微镜对切片进行光学评估。用带有15号圆形刀片的解剖刀分离海马区并进入内层皮层。重要的是，仅取位于海马背侧与腹侧之间中段区域、且细胞结构完整的切片。

低质量的OHSC应立即弃去。将2到3个获得的脑片转移至孔径为0.4微米的细胞培养插入物中。使用巴斯德吸管从细胞培养插入物顶部吸出培养基。

将组织块放入六孔培养板中，每孔加入一毫升培养基。将六孔板置于35°C、5% CO2的完全湿化环境中孵育，每隔两天更换一次细胞培养基。大鼠组织培养六天后，或小鼠组织培养十四天后，与切片操作本身相关的炎症反应已消失。

现在可以开展实验。神经保护研究的代表性结果。图A部分显示了未损伤的离体海马脑片，在体外培养9天且未经任何处理的培养基中保存，作为对照组脑片。

共聚焦激光扫描显微镜证实，对照组 OHSC 显示出良好的神经元保存状态。Isolectin B4 阳性的小胶质细胞主要定位于分子层和 Plexiform 层，并呈现分枝状表型。在齿状回颗粒细胞层中，仅发现极少数 Isolectin B4 阳性的小胶质细胞，几乎未见 Propidium Iodide 阳性的细胞核。

另一组OHSC（如图像B部分所示）在培养基中培养六天，随后用50 µM NMDA处理四小时以造成损伤，之后再在培养基中继续培养三天。NMDA损伤后，在齿状回所有层内，大量活化的Isolectin B4阳性小胶质细胞在神经元损伤部位聚集并黏附于该处。

定量分析显示，在齿状回颗粒细胞层中，损伤组OHSC中Isolectin B4阳性的小胶质细胞数量高于对照组。类似地，在NMDA损伤切片的颗粒细胞层中，碘化丙啶阳性变性神经元的数量显著增加。肿瘤侵袭研究的示例结果。

所有图像均展示了使用OHSC进行肿瘤侵袭SS实验的结果，图像通过共聚焦激光扫描显微镜获得。红色标记OHSC的细胞结构，绿色标记肿瘤细胞。图像A显示了U138胶质母细胞瘤细胞在允许侵袭四天后典型的侵袭模式。

可以观察到清晰、呈球形且边界分明的肿瘤，OHSC结构似乎保持完整，齿状回和海马角清晰可见。图B显示了LN229胶质母细胞瘤细胞在培养四天后形成的另一种侵袭模式。在此情况下，由于形成的网络覆盖了大部分OHSC，单个肿瘤无法被明确区分，尽管细胞结构仍保持完整，齿状回和海马角未发生变形。

此外可以得出结论，LN229 细胞比 U138 细胞更具侵袭性。图像 C 和 D 显示了 LN229 细胞在侵袭四天后的相同肿瘤侵袭结果。在左侧可见，肿瘤组织几乎覆盖了整个视野。

图D显示了相应的碘化丙啶染色结果。在此切片中，细胞结构已不再完整，海马区（Cornu Ammonis）已不可见，齿状回也出现扭曲变形。造成该结果的可能原因包括：实验开始时离体海马脑片（OHSC）本身未完全完整、接种的肿瘤细胞数量过多，或侵袭时间过长，导致观察到的组织结构丧失。

因此，此类侵入性实验结果应予以舍弃。器官型海马脑片培养是一种优良的体外模型，能够反映具有完整神经元连接的脑组织生理状态。由于单个动物可获得多个脑片培养样本，该模型允许在来自同一动物的组织中测试多种条件，且实验结果具有高度可重复性。

由于具有高度的可及性，海马区器官型脑片培养非常适合多种实验类型，包括电生理学和神经发生研究，也适用于神经保护、肿瘤侵袭以及肿瘤细胞与健康脑组织相互作用的实验。