一种内在的弥漫性脑胶质瘤脑桥快速验尸细胞培养协议（DIPG）
2017年3月7日
本协议描述为事后漫内在脑桥脑胶质瘤样品进行建立以病人来源的细胞培养模型或肿瘤微环境和细胞的直接表征的快速处理的方法。
这种快速死后细胞培养方案的总体目标是生成弥漫性脑桥脑胶质瘤的耐用患者来源细胞培养物，以促进了解并最终开发 DIPG 有效疗法所需的实验。这种方法可以帮助回答有关弥漫性脑桥脑胶质瘤的基础生物学和治疗策略的关键问题，例如某些药物是否在不同的患者来源的培养物中起作用。该技术的主要优点是允许直接研究患者来源细胞的生物学。
这项技术的影响延伸到 DIPG 的治疗，因为它允许跨疾病的不同遗传亚型测试不同的治疗策略。虽然这种方法可以提供对 DIPG 的见解，但它也可以应用于其他疾病，例如其他儿科高级别胶质瘤、成人胶质母细胞瘤或其他中枢神经系统肿瘤。一般来说，刚接触这项技术的人会很困难，因为很难以有效的方式获取和快速处理尸检样本。
样品制备前，在紫外线下对组织培养罩以及剃须刀片、弯曲止血钳和其他非无菌工具消毒一小时，并在无菌条件下执行以下步骤。接下来，将组织转移到 100 毫米 x 20 毫米的高壁细胞培养皿中。取出运输过程中剩余的培养基，并用 10 至 15 mL 的冷培养基替换。
然后，使用弯曲的止血钳抓住剃须刀片，在去除血管或脑膜的同时将组织切碎。最终的组织碎片应小于 1 毫米。然后，将组织转移到干净的 50 毫升锥形管中。
再加入 5 mL 冷培养基清洗细胞培养皿，并将样品转移到锥形管中。根据需要重复此洗涤步骤以转移剩余的组织。使用 10 mL血清移液管，轻轻研磨样品 4 至 5 次。
让较大的组织碎片沉降到试管底部。如有必要，将样品短暂离心 1 分钟。要收集解离的组分，请去除上清液，并通过 100 微米过滤器将滤液滤液放入标有"机械解离"的新 50 毫升锥形管中。
将过滤器倒置在原始锥形管上，并用培养基洗涤以回收组织碎片。然后，将机械解离馏分离心 5 分钟。然后，从沉淀的机械解离级分中去除上清液，并将组织重新悬浮在冷培养基中。
如果机械解离锥形管中的组织超过 5 毫升，请将组织分成其他 50 毫升锥形管，这样就不会有超过 5 毫升的组织管。然后，将机械解离的级分储存在冰上，直到蔗糖梯度离心步骤。在此过程中，将含有剩余组织碎片的锥形管离心 5 分钟。
之后，去除上清液并加入预热的酶消化液，使得每 1 毫升组织有 5 毫升消化液。然后，用实验室薄膜密封锥形管盖，并在 37 摄氏度下在旋转器上孵育反应 30 分钟。孵育后，轻轻研磨样品。
使用 10 毫升血清移液管，上下移液样品 6 至 8 次，避免产生过多气泡。接下来，在移液器末端添加 1， 000 微升移液器吸头，再研磨样品 6 到 8 次。让任何剩余的块沉降到试管底部。
然后，取出并过滤上清液，细胞仍通过 100 微米过滤器悬浮到标有 Enzymatic Dissociation 的新 50 毫升锥形管中，并将其储存在冰上。然后，将酶解离管离心 5 分钟，然后继续进行蔗糖梯度离心。如果样品仍悬浮在溶液中，请离心 5 分钟。
接下来，去除上清液并将组织重悬于 20 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 中。然后，用冷 HBSS 将体积调至 25 mL。缓慢加入 25 毫升 1.8 摩尔蔗糖溶液，倒置试管混合。
这导致 0.9 摩尔的蔗糖梯度。随后，将样品不间断地离心 10 分钟。小心地将髓鞘碎片吸出尽可能多的蔗糖蔗糖溶液中。
然后，加入 30 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 洗涤样品，并轻轻混合。之后，离心 5 分钟。在此过程中，去除洗涤上清液。
加入 5 mL ACK 裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下旋转试管 1 分钟。然后，加入 30 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 淬灭裂解。随后，将其离心 5 分钟。
将最终细胞沉淀重悬于 10 至 15 mL 含生长因子的温热完全 TSM 中，并使用台盼蓝排除法在血细胞计数器上定量活细胞密度。然后，将最终细胞悬液转移到新的 T75 培养瓶中。每隔一天添加额外的生长因子以维持整体生长因子水平，并监测肿瘤细胞神经球的发育。
以下是从培养的早期阶段到持久培养的样品如何出现的各种示例。最初，铺板和早期培养物通常似乎不包含许多存活细胞。此外，早期细胞簇通常没有表现出通常与神经球相关的对比程度。
然而，这些细胞簇的初始传代，结合细胞簇的反向过滤，可以分离出能够形成球体的健康肿瘤细胞。滤液通常包含残留的碎屑。然后，这些患者来源的样本可以在培养物中维持多次传代。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要确保样品在除酶解离之外的每个步骤中都保持在低温下，并尽量减少样品的创伤处理。在此程序之后，可以进行其他研究，例如体外药物筛选或原位异种移植，以回答有关 DIPG 病理生物学的后续问题。
经过开发，这种培养技术为儿科神经肿瘤学领域的研究人员探索 DIPG 患儿的新治疗途径铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何对脑肿瘤样本进行快速死后细胞培养方案有一个很好的了解。不要忘记，与人体组织一起工作可能很危险，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备和无菌技术。
概览
本协议描述了一种快速处理死后弥漫性桥脑胶质瘤样脑胚胎组织样本以建立患者来源的细胞培养模型的方法。该技术有助于研究肿瘤生物学和治疗策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 弥漫性桥脑胶质瘤（DIPG）是一种具有挑战性的儿童脑肿瘤。
- 了解DIPG生物学对于开发有效的治疗方法至关重要。
- 患者来源的细胞培养可以提供有关肿瘤行为的见解。
- 该方法也可以应用于其他高级别胶质瘤和中枢神经系统肿瘤。
研究目的
- 生成耐久的DIPG患者来源的细胞培养。
- 促进旨在理解DIPG生物学的实验。
- 在不同遗传亚型中测试治疗策略。
使用的方法
- 在无菌条件下处理死后样本。
- 机械和酶解离组织样本。
- 蔗糖梯度离心用于细胞分离。
- 用生长因子维持细胞培养。
主要结果
- 成功生成患者来源的细胞培养。
- 对DIPG生物学和潜在治疗反应的见解。
- 展示了对其他中枢神经系统肿瘤的适用性。
结论
- 该协议使得能够直接研究患者来源的DIPG细胞。
- 它为测试各种治疗策略提供了平台。
- 未来的应用可能扩展到其他儿童和成人脑肿瘤。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the critical need for physiologically relevant models in pediatric oncology by enabling rapid generation of patient-derived DIPG cultures from post-mortem tissue. It supports target validation and preclinical de-risking by providing a scalable system to evaluate therapeutic response across genetic subtypes. The method enhances translational continuity from discovery to lead identification by supplying durable cultures for mechanistic and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived cells that retain tumor-specific biology.
- Operational Value: Provides a renewable source of DIPG cells for functional target validation and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing drug response comparison across genetically distinct cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated cell suspensions suitable for FACS isolation and downstream molecular profiling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation to produce consistent inputs for high-throughput screening platforms.
- Scalability: Enables production of sufficient cell numbers for multi-well assay formats and dose-response testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains tumor-derived neurosphere-forming capacity, preserving key pathobiological features for preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates orthotopic xenograft establishment for in vivo efficacy and pharmacokinetic studies.
- Translational Alignment: Bridges discovery findings to preclinical validation through continuous culture passaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supplying validated biological systems for lead identification and preclinical evaluation. It enables hypothesis-driven screening and supports go/no-go decisions through quantitative, reproducible outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct testing of drug effects on patient-derived DIPG cells.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions ready for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables quantification of viable cell density and neurosphere formation as phenotypic readouts for compound screening.
- Translational Research: Provides a continuous culture system that maintains tumor properties for longitudinal preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating CNS tumor models applicable to multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on non-predictive cell lines and enhancing biological relevance.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and centrifugation steps under sterile conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of ineffective compounds using patient-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating efficacy data across multiple DIPG genetic subtypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to post-mortem tissue and rapid processing infrastructure to maintain sample viability.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure culture consistency and comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other CNS tumor types with differing tissue characteristics.
- Limited by the difficulty in procuring and rapidly processing autopsy samples, which affects throughput and accessibility.
