Name: 一种内在的弥漫性脑胶质瘤脑桥快速验尸细胞培养协议（DIPG） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习快速验尸细胞培养技术，用于建立弥漫性脑桥胶质瘤患者来源的细胞模型。该方法通过机械和酶解分离组织，结合蔗糖梯度离心技术，为研究肿瘤生物学和开发治疗策略提供可靠平台。

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作者们衷心感谢 McKenna Claire 基金会、国家神经疾病与中风研究所（NINDS K08NS070926 和 R01NS092597）、美国国防部（NF140075）、加州再生医学研究所（CIRM RB4-06093 和 RN3-06510）、Alex's Lemonade Stand 基金会、The Cure Starts Now 基金会与 DIPG 协作组织、Lyla Nsouli 基金会、Unravel Pediatric Cancer、儿童脑肿瘤基金会、Matthew Larson 基金会、V 基金会、Godfrey 家族基金（纪念 Fiona Penelope）、Wayland Villars DIPG 基金会、Dylan Jewett、Connor Johnson、Zoey Ganesh、Dylan Frick、Abigail Jensen 和 Jennifer Kranz 纪念基金、N8 基金会、Virginia 和 D.K. Ludwig 癌症研究基金、斯坦福大学儿童健康研究所 Anne T. 与 Robert M. Bass 儿科癌症与血液疾病讲席教职奖学金的支持。

本方案已获得本机构审查委员会的批准，所有患者数据均已进行适当的去标识化处理，并符合所有机构、国家和国际关于人类福利的指南。在使用本方案前，须获得机构审查委员会的全部必要批准，并取得患者家属的知情同意。
1. 获取组织样本
注意：本方案的一个关键步骤是在尸体解剖后立即正确处理组织捐献。整体样本的存活能力在很大程度上取决于尽量缩短死后间隔时间（PMI），立即将组织转移至含有抗生素/抗真菌剂的适当低温保存液中，在运输过程中始终将样本置于湿冰上，并在整个操作过程中保持无菌技术。
<ol>
	<li>收到即将进行捐献的通知后，准备样本采集包。使用带有隔热容器的运输箱（该容器可直接用于组织样本的返程运输），并放入以下材料：
	<ol>
		<li>包括无菌制备所需的材料，如无菌手套、无菌巾和手术刀。</li>
		<li>在保温容器中放入8至10个无菌50 mL锥形管，每管含30 mL运输培养基，并加入冰块或冷袋。 
		注意：虽然任何标准细胞培养基均可使用，但使用添加了抗生素/抗真菌剂的Hibernate-A可获得最佳的样本活力。</li>
		<li>包括用于其他分析的额外样本管（例如， 固定剂）</li>
		<li>如果尸体解剖不在研究者所在机构进行，应提供一份明确说明如何采集肿瘤样本的文件。内容应包括保持无菌、将样本管置于湿冰上保存，以及采集中脑和延髓组织样本，因为肿瘤细胞常侵入这些区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尸检过程中须保持无菌操作。颅腔内的脑组织视为无菌，因此打开颅腔后应遵循无菌技术（包括更换手套）。避免皮肤和毛发污染至关重要。</li>
	<li>从腹侧分离肿瘤（ &#34;腹部&#34; 脑桥的，参见 补充图1用无菌手术刀将肿瘤切成约1 cm³的小块，立即转移至预冷的运输培养基中（见步骤1.1.2中的注释），并置于湿冰上。每管中加入10 mL组织，使每管中组织与培养基的最终总体积为40 mL。 
	注意：在弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）的情况下，肿瘤会弥漫性浸润脑桥，并经常累及脑干的其他部分。因此，应尽可能多地采集样本，通常包括来自脑桥的3–4管（30–40 mL组织），以及来自中脑和延髓的各1–2管（每管10–20 mL组织）。</li>
	<li>从紧邻脑桥的中脑和延髓部位采集样本，这些区域通常含有大量肿瘤细胞。</li>
	<li>样本采集后，将样本在过夜（O/N）条件下运输 湿润 将样本置于保温容器中的冰上运输。切勿使用干冰运输，因为冷冻会杀死细胞。</li>
</ol>
2. 样本处理的准备工作
<ol>
	<li>在开始样品制备之前，将组织培养罩、剃刀片、弯止血钳及所有其他非无菌工具置于紫外线下灭菌1小时。后续所有步骤均须在无菌条件下操作，以防止培养物污染。</li>
	<li>配制并过滤除菌溶液。
	<ol>
		<li>配制1.8 M蔗糖溶液：将308.07 g蔗糖溶解于300 mL蒸馏水中，加入50 mL不含钙和镁的10×Hank's平衡盐溶液（HBSS），再用蒸馏水定容至500 mL。4 °C保存。</li>
		<li>配制酶消化液时，取 50 mL HBSS 与 每10 mL绞碎的组织中加入钙和镁，再加入500 μL 5 mg/mL脱氧核糖核酸酶I（终浓度50 μg/mL）、500 μL 2.5 mg/mL胶原酶I/II和分散酶溶液（终浓度25 μg/mL）以及500 μL 1 M HEPES缓冲液。将消化液在37 °C水浴中预热。</li>
		<li>准备肿瘤干细胞培养基（TSM）基础液：混合250 mL Neurobasal-A、250 mL DMEM/F12、5 mL 100x 抗生素-抗真菌剂、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（GlutaMAX-A）、5 mL HEPES缓冲液、5 mL 100 mM丙酮酸钠和5 mL 100x MEM非必需氨基酸。</li>
		<li>为制备含生长因子的完全TSM，将以下补充剂加入TSM基础培养基：50倍浓度的B27补充剂（不含维生素A）（1:50稀释）、人表皮生长因子（H-EGF，20 ng/mL）、人成纤维细胞生长因子（H-FGF，20 ng/mL）、人血小板源性生长因子AA（H-PDGF-AA，10 ng/mL）、人血小板源性生长因子BB（H-PDGF-BB，10 ng/mL）以及肝素溶液（2 μg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将配备摆动桶转子的实验室离心机预冷至 4 °C。</li>
</ol>
3. 机械解离
<ol>
	<li>将组织转移至一个高壁的 100 mm × 20 mm 细胞培养皿中。去除运输过程中残留的培养基，并更换为 10–15 mL 冷培养基。</li>
	<li>使用弯头止血钳夹住剃须刀片，将组织充分切碎，同时去除明显的血管或脑膜组织。 
	注意：最终的组织碎片应小于 1 mm（见图 1B）。</li>
	<li>将组织转移至一个洁净的 50 mL 圆锥形离心管中。用额外的 5 mL 冷培养基冲洗细胞培养皿，并将冲洗液转移至离心管中。根据需要重复此洗涤步骤，以转移残留的组织。</li>
	<li>使用 10 mL 刻度吸管轻轻吹打 4–5 次。让较大的组织碎片沉降至管底。如有必要，将样品短暂离心 1 分钟&#160;（350 × g，4 °C）。</li>
	<li>收集机械解离组分。
	<ol>
		<li>移去上清液，并通过 100 μm 滤膜过滤至一个新的、标记为&#34;机械解离&#34;的 50 mL 圆锥形离心管中。将滤膜倒置在原始离心管上方，用培养基冲洗以回收残留的组织碎片。</li>
		<li>将&#34;机械解离&#34;组分在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>移去&#34;机械解离&#34;组分沉淀的上清液，并将组织重悬于冷培养基中。若&#34;机械解离&#34;离心管中的组织体积超过 5 mL，应将其分装至其他 50 mL 离心管中，确保每管组织体积不超过 5 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将机械解离组分置于冰上保存，直至进行蔗糖梯度离心步骤（第 5 步）。或者，可在酶解解离孵育期间（第 4.4 步）直接进行第 5 步操作。</li>
</ol>
4. 酶解离
<ol>
	<li>如果含有剩余较大组织碎片的离心管中组织体积超过 5 mL，请将组织分装至其他新的 50 mL 圆锥形离心管中，确保每管组织不超过 5 mL。</li>
	<li>将含有剩余组织碎片的圆锥形离心管在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入预热的酶消化液，使每 1 mL 组织加入 5 mL 消化液（例如，5 mL 组织加入 25 mL 消化液）。</li>
	<li>用实验室封口膜密封离心管盖，于 37 °C 在旋转仪上孵育反应 30 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，轻轻吹打样品（见 图 1C）。
	<ol>
		<li>使用 10 mL 血清移液管，将样品上下吹打 6–8 次。避免产生过多气泡。</li>
		<li>在移液管末端加装 1,000 μL 吸头，再额外吹打 6–8 次。</li>
		<li>让任何残留的组织块沉降到管底。将含有悬浮细胞的上清液通过 100 μm 滤膜过滤，收集至新标记为 &#34;Enzymatic Dissociation&#34; 的 50 mL 圆锥形离心管中，并置于冰上保存。</li>
		<li>若仍有大量组织碎片残留，向碎片中加入额外的 10 mL 含钙和镁的 HBSS，重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。将最终的消化液通过 100 μm 滤膜过滤至 &#34;Enzymatic Dissociation&#34; 管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 &#34;Enzymatic Dissociation&#34; 管在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，随后继续进行蔗糖梯度离心。</li>
</ol>
5. 蔗糖梯度离心
<ol>
	<li>若样品仍悬浮于溶液中，以 350 × g 离心 5 分钟（4 °C）。</li>
	<li>弃去上清液，将组织重悬于 20 mL 无钙镁的冷 HBSS 中，并用冷 HBSS 定容至总体积 25 mL。</li>
	<li>缓慢加入 25 mL 1.8 M 蔗糖溶液，并倒置离心管混匀。此操作可形成 0.9 M 蔗糖梯度。</li>
	<li>以无刹车条件离心 10 分钟（800 × g，4 °C）。使用离心机制动会破坏梯度并降低得率（参见图 1D，示例为离心前后样品状态）。</li>
	<li>小心吸除髓鞘碎片及尽可能多的蔗糖溶液。加入 30 mL 无钙镁的冷 HBSS 轻柔混匀以洗涤样品，随后以 350 × g 离心 5 分钟（4 °C）。</li>
</ol>
6. ACK 红细胞裂解
<ol>
	<li>移除洗涤上清液。加入 5 mL ACK 裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下轻轻摇动试管 1 分钟。</li>
	<li>加入 30 mL 不含钙和镁的冷 HBSS，终止裂解反应。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
7. 初始培养物的维持
<ol>
	<li>用 10 - 15 mL 含生长因子的预温全量 TSM 重悬最终的细胞沉淀，并使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上定量活细胞密度。 
	注意：活细胞数量范围因组织捐献的具体情况而异，在此早期阶段由于残留细胞碎片较多，定量可能较为困难。理想情况下，每个样本应获得一百万个活细胞。若存在大量残留碎片，可将细胞以较低密度接种至 T175 培养瓶中。</li>
	<li>将最终的细胞悬液转移至新的 T75 培养瓶中。每隔一天补充一次额外的生长因子，以维持总体生长因子水平，并监测肿瘤细胞神经球的形成（见 图 1E 和 图 2）。</li>
	<li>或者，可对酶解离后的细胞进行进一步分析处理，包括流式细胞术和荧光激活细胞分选。</li>
	<li>在神经球形成后（平均需要 3 - 4 周，但时间范围可从数天至长达 2 个月），使用 100 μm 尼龙筛网过滤器对样本进行反向过滤，以减少碎片含量。 
	注意：应继续培养滤过液，以防其中存在可存活的单个细胞或小型神经球。</li>
	<li>在传代过程中通过 DNA 指纹图谱分析确保培养物的完整性和纯度，并与初始患者样本进行比对。</li>
</ol>

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<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种快速处理死后捐献的肿瘤组织以建立患者来源细胞培养物的方法，该细胞培养物可用于多种研究 体外 或 体内 实验。由于尸检样本的特性，维持样本的活性是一个重大挑战。诸多影响因素，包括死亡至解剖的时间间隔（post-mortem interval）或组织运输所需时间，应尽可能缩短，但通常难以控制。根据我们的经验，死亡至将组织置于冰冻运输介质中的时间间隔少于6–8小时，最有利于成功建立稳定的细胞培养。组织最好在24小时内送达实验室，并在收到后立即进行培养处理。
由于这些罕见病例的发生位置差异较大，且组织获取步骤的质量会显著影响成功概率，因此开展尸检的后勤工作可能具有挑战性。在许多情况下，为了实现在6-8小时内完成操作，很难在学术中心进行组织采集。相反，安排一个处于待命状态的组织回收服务机构，依据经机构审查委员会（IRB）批准的方案在殡仪馆内获取肿瘤组织，通常更有利于快速完成组织回收。建议在患者死亡前预先获得知情同意，以促进后勤工作的规划。强烈建议准备包含清晰详尽操作说明以及无菌采样用品（如手套、手术单、手术刀）的独立尸检工具包。此外，建立研究者、病理学家与殡仪馆之间明确的沟通机制至关重要。例如，研究者应在尸检前与病理学家讨论操作方案，并指出常见的错误。这些错误包括组织采集过程中发生微生物污染（通常为酵母菌）、未使用隔夜或加急运输方式，以及未将样本置于足量湿冰中并使用隔热容器运输。最后，我们建议采用门对门的快递服务运送样本，以最大限度缩短运输时间。
在组织解离过程中也应注意保持细胞活力。例如，使用专为维持神经组织健康而设计的运输培养基（如添加抗生素/抗真菌剂的 Hibernate-A），可提高成功建立培养物的几率。在整个实验流程中，还应始终保持样本处于低温环境，所有样本转移均需在冰上进行。同时收集机械解离和酶解解离的组分，并尽量减少吹打次数，有助于提高实验成功率，因为这两个步骤均会对细胞造成损伤。根据我们的经验，尽管大多数成功的培养物来自两种解离组分，但也曾出现仅其中一种组分成功建立稳定培养物的情况，这可能反映了此类样本的脆弱特性。吹打是本实验流程中另一项对细胞具有损伤性的操作；为减少所需吹打程度，可在制备初期将组织充分剪碎，这是一种有效的策略。其他旨在提高样本活力的实验设计还包括添加缓冲液（例如， 在整个方案中使用HEPES，这在酶解离过程中尤为重要。
为进一步提高细胞存活率，可对本方案进行一种可能的修改，即去除ACK红细胞裂解步骤。然而，在这种情况下，通常需要在培养的最初一周内进行ACK裂解步骤以去除红细胞。本方案中另一个可修改的方面是使用蔗糖密度梯度去除髓鞘和细胞碎片。具体而言，在此步骤中还可采用其他已被报道可提高小胶质细胞存活率的策略，例如不连续Percoll密度梯度18或磁性髓鞘去除微珠。
最后，从初始组织解离到神经球出现的时间在不同样本之间存在差异，可能需要一周至一个月甚至更长时间。由于初始培养物中通常含有大量死亡细胞和细胞碎片，因此很难判断是否仍有活细胞存在；建议将培养物维持至少4 - 8周（图2）。本文介绍了一种从残留碎片中分离出增殖细胞的策略（即通过反向过滤细胞团簇，并将其重新接种至新鲜培养基中）。是否继续维持某一培养物的决定，最终需根据具体情况而定，包括 autopsy 相关因素（例如较长的死后间隔时间、组织运输过程中的问题）、组织解离情况（例如过多的血液或碎片）以及样本在培养中的表现。一旦建立培养物，应通过短串联重复序列分析或其他类似方法进行DNA指纹图谱鉴定，将培养物与为该目的保留的原始肿瘤样本进行比对，以确认其身份。我们建议定期通过DNA指纹图谱对培养物进行验证，以确保未发生其他培养物的交叉污染，例如每3 - 6个月进行一次。
这些患者来源的弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG）细胞系的建立，是成功开发有效疗法的重要一步。扩大可用的患者来源DIPG细胞系和异种移植模型对于确定最有效的治疗策略，并最终战胜这一毁灭性疾病至关重要。

弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）是一种侵袭性的中枢神经系统恶性肿瘤，通常在儿童中期发生于腹侧脑桥1,2。尽管已有数十年的临床试验，目前的治疗手段仍仅限于放疗，该疗法仅能暂时改善或稳定症状，并使中位生存期平均延长3个月。即使接受放疗，患者的总体中位生存期也仅为9个月，且90%的患儿在初次诊断后2年内死于该疾病。由于肿瘤具有浸润性生长特性，且脑干承担着重要的生理功能，因此无法进行手术切除。此外，在美国，历史上通常不进行DIPG的手术活检3，因为组织病理学分析目前对指导临床治疗无实际作用，而诊断通常仅通过神经影像学即可完成。因此，可用于研究的肿瘤组织极为有限，严重制约了针对候选药物分子及肿瘤生物学机制的研究进展。值得注意的是，近年来神经影像技术和立体定向技术的进步使得DIPG安全活检成为可能4，结合分子生物学领域的进展，已显著加深了我们对该疾病的认识。目前，已有多个临床试验正在开展，通过前期活检和DIPG的分子谱分析来实现个体化治疗方案的制定（NCT01182350，NCT02274987）5。
弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）及其他儿童高级别胶质瘤与其成人型胶质母细胞瘤相比属于截然不同的疾病6,7，因此需要建立可靠的实验模型以深入理解其独特的病理生理机制，并发现有效的治疗策略。近年来，通过尸检或较少情况下的活检获取DIPG肿瘤组织用于研究的努力，极大地推动了我们对DIPG的认知和研究能力。全基因组测序研究发现，H3组蛋白家族3A（H3F3A）和组蛋白簇1 H3b（HIST1H3B）存在反复出现的突变，这是首次发现由组蛋白编码蛋白突变引起的人类疾病8,9,10,11。此外，部分DIPG病例携带ACVR1基因突变，这类突变此前未在癌症中报道过，但与先天性儿童发育障碍——进行性骨化性纤维发育不良（fibrodysplasia ossificans progressiva）中发现的突变完全相同8,9,10,11。同时，目前已成功建立首批来源于患者的DIPG细胞培养体系及原位异种移植模型1,2,12,13,14，以及通过将肿瘤细胞直接移植到免疫缺陷小鼠体内构建的可连续传代的异种移植小鼠模型3,14,15。利用这些患者来源的模型开展的初步药物筛选已识别出若干具有临床转化前景的新型药物4,14，并为至少一项临床试验（NCT02717455）奠定了基础。
这些迈向进展的初步工作仅仅是开端，仍需大量患者来源的组织样本和培养模型来定义该疾病的亚型，并开发最有效的治疗策略。DIPG 的基因工程小鼠模型也将有助于深入理解疾病基础机制的研究。构建 DIPG 遗传模型的努力将得益于上述基础基因组学研究，但目前可用的方法仍十分有限。其中一种模型利用病毒 RCAS/tv-a 系统，在新生小鼠后颅窝的 nestin 阳性细胞中驱动 PDGF-B 过表达并导致 Ink4a-ARF 缺失，从而产生组织学上相似的高级别脑干胶质瘤5,16。另一种方法是在源自人胚胎干细胞的神经前体细胞中重现多个主要的 DIPG 相关突变（组蛋白 H3.3 K27M 突变、p53 缺失和 PDGFRA 激活），足以使这些细胞获得致瘤性6,7,17。遗传学方法与患者来源模型的结合将能够实现临床前测试，并进一步推动有效疗法的开发。
为应对上述DIPG研究中的挑战，本快速尸检方案旨在获取患者来源的细胞培养物用于研究8,9,10,11,12,14该方案旨在保护组织的活性，并尽可能提高建立稳定培养物的可能性，尽管存在较长的死后间隔和运输时间等挑战。成功建立后，这些DIPG培养物可用于后续研究 体外 操作和 体内 异种移植实验，可用于评估潜在治疗分子对患者来源细胞的作用。

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>含钙/镁的HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH（胶原酶/分散酶）</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100倍)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>B27补充剂（不含维生素A）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸 (100倍)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>人PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>人PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>人EGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>人FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>弯止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>无菌手套</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>100微米孔径滤网</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 mL圆锥形离心管</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（dipg）死后细胞培养的方案

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

弥漫性内生型桥脑胶质瘤（Diffuse Intrinsic Pontine Glioma, DIPG）是一种儿童脑干肿瘤，预后极差， invariably fatal。由于手术切除不可行，且活检未被常规实施，可用于研究的患者样本极为有限。因此，该疾病的研究长期受限于缺乏可靠的疾病模型。为满足这一需求，本文介绍了一种快速处理死亡后尸检组织样本的实验方案，以建立稳定的患者来源细胞培养模型，可用于后续研究 体外 检测或 体内 原位异种移植实验。这些模型可用于筛选潜在的药物靶点，并研究弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG）中的基本病理生物学过程。本方案还可进一步扩展，通过荧光激活细胞分选技术（FACS）对肿瘤细胞及微环境细胞进行分析与分离，从而实现对大量细胞或单个细胞水平的基因表达、蛋白质表达或DNA表观遗传修饰的后续分析。最后，本方案也可经调整后用于建立其他中枢神经系统肿瘤的患者来源细胞培养模型。

所述方案总结为一个五步工作流程，并在图1中展示了组织在不同处理阶段的图像。首先通过快速无菌解剖获取样本。在机械解离过程中，将组织剪碎，同时去除样本中的血管和脑膜，并通过100 μm尼龙滤网过滤。残留的组织碎片在温控培养箱中进行酶解消化。接着，通过蔗糖梯度离心减少碎片，并从样本中分离出明显的髓鞘层。此外，ACK裂解可明显减少样本中红细胞的数量。最后，将细胞接种于添加了生长因子的无血清培养基中进行培养。
补充图1 是 autopsy 时肿瘤的一个示例。该肿瘤呈弥漫性浸润脑桥及脑干邻近区域。在样本制备过程中，应切割成约 1 cm × 1 cm 的小块，并立即置于冰上预冷的运输培养基中。
图2展示了样本从培养早期到建立稳定培养的不同阶段示例。最初接种及早期培养的样本（A，B）通常看起来存活细胞较少。此外，早期的细胞簇（C，D）往往缺乏神经球通常具有的明显对比度。值得注意的是，在细胞簇出现之前，培养所需时间可能长达数周至数月。然而，通过对这些细胞簇进行首次传代并结合反向过滤法，可分离出能够形成球状体的健康肿瘤细胞（F）。滤液（E）通常含有残留碎片；但我们建议将滤液接种并继续培养，同时监测是否有细胞簇形成。这些来源于患者的样本随后可在体外长期传代培养（G，H）。
图3展示了这些细胞异种移植到小鼠体内的能力。在每种情况下，DIPG细胞均被转染了GFP-荧光素酶报告基因，以通过生物发光监测肿瘤的发育情况（A）。肿瘤也可进行组织学检查，例如观察肿瘤的植入情况（B）或特定标志物的表达（C）。这些体内模型结合体外实验，可用于评估各种药物或基因操作的影响（例如8,9,10,11,14）。
<img alt="快速解剖工作流程：机械法与酶解法组织解离；蔗糖梯度离心。" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 组织样本在不同处理阶段的示意图。（A）通过无菌解剖程序获取样本，并在湿冰上过夜运输。（B）从左至右：（第1行）含有肿瘤组织的运输培养基管；置于100 mm × 20 mm细胞培养皿中的新鲜组织；组织的初步剪切；（第2行）部分剪切后的组织；去除软脑膜和血管；剪切后组织块的最终大小。（C）从左至右：（第1行）将组织置于37 °C培养箱中，在旋转台上孵育；（第2行）使用连接10 mL移液器的1000 μL吸头反复吹打组织；通过100 μm尼龙筛网过滤解离后的组织。（D）从左至右：离心前悬浮于0.9 M蔗糖溶液中的解离组织；离心后在蔗糖梯度中分离的组织；蔗糖梯度顶部可见的髓鞘碎片层；经ACK裂解和洗涤后的最终细胞沉淀。（E）最终样本可用于细胞培养或其他后续分析。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的细胞培养分化过程。通过八幅图像 A-H 展示多个阶段。" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 原代培养细胞与早期传代细胞的图像。 (A - B) 解离后立即接种的培养物（SU-DIPG-XXX， A），或尚未形成神经球的细胞系（SU-DIPG-XXIX， B). (C - DSU-DIPG-XXV 原代培养物中神经球的早期出现C）和 SU-DIPG-XXIX（D）。(E-F) 使用D中所述方法对原代培养物进行首次传代 100 μm 尼龙滤膜，收集滤液（E）和反向滤液（F) 接种。G - H) SU-DIPG-XXVII 第一次传代的成熟神经球（G）以及SU-DIPG-XXV的第三次传代（H) 在培养中生长。比例尺 = 200 μm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠肿瘤生长成像、荧光显微镜、癌症研究；活体生物发光检测。" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. 患者来源的细胞培养物可在小鼠体内植入并形成肿瘤。（A）四种转染了GFP-荧光素酶报告基因的不同患者来源细胞培养物的生物发光图像。（B）小鼠异种移植体的矢状切面，显示肿瘤细胞在小鼠脑桥中成功植入。绿色：GFP，红色：髓鞘碱性蛋白。比例尺 = 1 mm。（C）示例免疫荧光图像，显示GFP标记的肿瘤细胞在小鼠脑内成功植入。蓝色：DAPI，绿色：GFP，红色：IGF2R。比例尺 = 40 μm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充图1. 脑桥肿瘤的尸检样本。弥漫性内生性脑桥胶质瘤的死后即刻外观。该肿瘤表现为脑桥腹侧表面一个体积较大、富含髓鞘的肿块。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图像</a>

本方案描述了一种快速处理死后弥散性内生型桥脑胶质瘤样本的方法，用于建立患者来源的细胞培养模型，或直接对肿瘤细胞及微环境细胞进行表征。

一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）死后细胞培养的方案

弥漫性内生型桥脑胶质瘤（Diffuse Intrinsic Pontine Glioma, DIPG）是一种儿童脑干肿瘤，预后极差，具有普遍致命性。由于无法进行手术切除，该疾病……

本快速尸检后细胞培养方案的总体目标是建立稳定的弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患者来源细胞系，以促进开展理解该疾病并最终开发有效疗法所必需的实验。该方法有助于回答有关弥漫性内生型桥脑胶质瘤基本生物学特性及治疗策略的关键问题，例如特定药物是否在不同患者来源的细胞系中均具有疗效。该技术的主要优势在于能够直接研究患者来源细胞的生物学特性。该技术对弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）的治疗具有重要意义，因为它能够针对该疾病的多种遗传亚型测试不同的治疗策略。尽管该方法可为DIPG研究提供深入见解，但也可应用于其他疾病，例如其他儿童高级别胶质瘤、成人胶质母细胞瘤或其他中枢神经系统肿瘤。通常，初次接触该技术的研究人员会面临困难，因为高效获取并快速处理尸检样本具有较大挑战性。在样品制备前，将组织培养超净台、剃刀刀片、弯止血钳及其他非无菌工具置于紫外灯下灭菌一小时，并在后续所有步骤中保持无菌条件。接着，将组织转移至一个高壁的 100 毫米 × 20 毫米 细胞培养皿中。去除运输过程中残留的培养基，并加入 10 至 15 毫升冷培养基进行替换。然后，使用弯头止血钳夹住刀片，将组织切碎，同时去除血管或脑膜。最终的组织碎片应小于1毫米。随后，将组织转移至一个洁净的50毫升锥形管中。用额外的五毫升冷培养基清洗细胞培养皿，并将样品转移至锥形管中。根据需要重复此洗涤步骤，以转移剩余组织。使用10毫升血清移液管，轻轻吹打样品4到5次。让较大的组织碎片沉降到管底。如有必要，将样品短暂离心一分钟。为收集解离组分，将上清液通过100微米滤膜滤入新标记为“Mechanical Dissociation”的50毫升锥形管中。将滤膜翻转至原始的锥形管上，用培养基冲洗以回收组织碎片。随后，将机械解离组分离心五分钟。然后，弃去沉淀的机械解离组分中的上清液，并将组织重新悬浮于冷的培养基中。如果机械解离锥形管中的组织超过5毫升，则将组织分装到其他50毫升锥形管中，确保每管组织不超过5毫升。随后，将机械解离后的组织组分置于冰上保存，直至进行蔗糖梯度离心步骤。在此操作中，将含有剩余组织碎片的锥形管离心5分钟。之后，弃去上清液，加入预热的酶消化液，使每 1 毫升组织加入 5 毫升消化液。然后，用实验室封口膜密封锥形管管盖，并在 37 °C 下于旋转仪中孵育反应 30 分钟。孵育结束后，轻轻吹打样品。使用10毫升血清移液管将样品上下吹打6到8次，避免产生过多气泡。接着，在移液管末端安装1,000微升移液枪头，再将样品进一步吹打6到8次。让任何残留的组织块沉降到管底。然后，将上清液连同仍处于悬浮状态的细胞一起转移，并通过100微米滤膜过滤至新标记为“酶解离”的50毫升锥形管中，置于冰上保存。随后，将酶解离管离心5分钟，继续进行蔗糖梯度离心。如果样品仍悬浮在溶液中，则再次离心5分钟。接下来，弃去上清液，将组织重悬于 20 毫升不含钙和镁的冷 HBSS 中。然后用冷 HBSS 定容至 25 毫升。缓慢加入 25 毫升 1.8 摩尔蔗糖溶液，倒置离心管以混匀。这将形成一个0.9摩尔的蔗糖梯度。随后，将样品以无刹车方式离心10分钟。小心吸除髓鞘碎片及尽可能多的蔗糖溶液。然后，加入30毫升不含钙和镁的冷HBSS洗涤样品，并轻轻混匀。之后，以5分钟离心。在此步骤中，去除洗涤上清液。加入5 mL ACK裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下轻轻摇动离心管1分钟。然后加入30 mL不含钙和镁的冷HBSS终止裂解反应。随后，离心5分钟。将最终的细胞沉淀重悬于 10 至 15 毫升含生长因子的预温完全 TSM 培养基中，使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上定量活细胞密度。随后，将最终细胞悬液转移至新的 T75 培养瓶中。每隔一天补充一次生长因子以维持总体生长因子水平，并观察肿瘤细胞神经球的形成情况。以下是样本从培养早期阶段到形成稳定培养物时可能出现的各种情况。最初，接种后及早期培养物通常看起来存活的细胞数量较少。此外，早期的细胞簇通常不表现出神经球所特有的明显对比度。然而，通过这些细胞簇的初次传代，结合细胞簇的反向过滤，可分离出能够形成球状体的健康肿瘤细胞。滤液通常含有残留的碎片。这些来源于患者的样本随后可在体外培养中进行多次传代维持。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四小时内完成。在实施该步骤时，除酶解离步骤外，每个环节均需确保样本保持低温，并尽量减少对样本的机械损伤。完成该操作后，可进一步开展其他研究，例如体外药物筛选或原位异种移植，以探讨弥漫性内生性桥脑胶质瘤（DIPG）的病理生物学相关后续问题。该培养技术建立后，为儿童神经肿瘤学领域的研究人员探索弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患儿的新型治疗途径奠定了基础。观看本视频后，您应能够掌握如何对脑肿瘤组织样本进行快速尸后细胞培养操作。请务必注意，操作人体组织可能存在生物安全风险，因此必须始终采取相应预防措施，例如穿戴个人防护装备并采用无菌操作技术。

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