Name: 重组αβ-γ-Synucleins 刺激蛋白磷酸酶2A 催化亚基活性在细胞自由测定中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解如何使用比色法测定重组α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白对蛋白磷酸酶2A催化亚基活性的刺激作用。该方法有助于研究神经退行性疾病中的蛋白质相互作用机制。

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作者感谢此前实验室成员Kendra Mackett、Sandra Slusher和Jie Chen为优化该方法所付出的努力。作者还感谢美国国立卫生研究院、迈克尔·J·福克斯基金会、德克萨斯理工大学健康科学中心埃尔帕索分校学术研究项目（SARP）、Lizanell和Colbert Coldwell基金会、多系统萎缩联盟、Hoy家族研究以及Anna Mae Doyle捐赠基金对本研究提供的经费支持。

1. 缓冲液和试剂的配制
<ol>
	<li>对硝基苯磷酸盐（pNPP）缓冲液的制备
	<ol>
		<li>按以下步骤制备 50 mL 的 pNPP 缓冲液。</li>
		<li>称取 0.30285 g Tris 碱（见材料表），溶于 25 mL 超纯去离子水中。
		<ol>
			<li>加入 41.6 µL 的 120 mM CaCl2，用 1 M HCl 调节 pH 至 7.0，再用超纯去离子水定容至 50 mL。</li>
			<li>确保最终浓度为 50 mM Tris-HCl、100 mM CaCl2，pH 7.0。</li>
			<li>将 pNPP 缓冲液于 4 oC 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备孔雀绿溶液，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>通过将 32.8 mL 浓 HCl 加入 67.2 mL 超纯去离子水中，制备溶液 A，以配制 4 M HCl 溶液。 
		注意：孔雀绿溶液应在通风橱中操作，佩戴一次性手套、口罩和护目镜。</li>
		<li>称取 4.2 g 钼酸铵，加入 95.8 mL 的溶液 A 中，制备溶液 B。</li>
		<li>称取 0.045 g 孔雀绿草酸盐，加入超纯去离子水至终体积为 100 mL，制备溶液 C。</li>
		<li>按 1:3（v/v）比例混合溶液 B 和溶液 C，制备溶液 D，室温下搅拌 1 小时。</li>
		<li>使用 50 mL 注射器，通过孔径为 0.22 µm 的硝酸纤维素膜滤器过滤溶液 D。</li>
		<li>将配制好的孔雀绿溶液避光保存于 4 oC。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活化剂的制备
	<ol>
		<li>为配制 1% Tween 20 溶液，用移液器将 10 µL Tween 20 加入 990 µL 超纯去离子水中（v/v），涡旋混匀直至 Tween 20 完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孔雀绿 Tween 20（MGT）工作液的制备
	<ol>
		<li>将活化剂（步骤 1.3）与孔雀绿溶液（溶液 D，步骤 1.2.5）按 1:100（例如，1 µL 活化剂加 99 µL 孔雀绿溶液）的比例混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苏氨酸磷酸肽（KRpTIRR）（pT）底物的制备
	<ol>
		<li>为配制 2 mM 储存液，将 1 mg 磷酸肽小瓶置于冰上，加入 550 µL 超纯去离子水，轻轻涡旋溶解。
		<ol>
			<li>分装约 10 份，于 -20oC 保存 pT。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>突触核蛋白的制备
	<ol>
		<li>在通风橱中操作，佩戴一次性手套、口罩和护目镜，制备突触核蛋白。</li>
		<li>将 1 mg 重组突触核蛋白溶于 1 mL 超纯去离子水中，终浓度为 1 mg/mL。</li>
		<li>轻轻涡旋溶解后置于冰上。</li>
		<li>分装为 50 µL 每份，于 -80 oC 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷酸盐标准品的制备
	<ol>
		<li>按以下步骤配制 0.1 mM 磷酸盐储存液。
		<ol>
			<li>称取 0.1361 g KH2PO4，置于烧杯中，加入 80 mL 超纯去离子水，放入磁力搅拌子搅拌溶解。将全部溶液转移至量筒中，用超纯去离子水定容至 100 mL。</li>
			<li>使用 50 mL 注射器，通过孔径为 0.22 µm 的硝酸纤维素膜滤器过滤全部溶液；终浓度为 10 mM。</li>
			<li>将该溶液（10 mM）按 1:100 稀释；终浓度为 0.1 mM 磷酸盐（PO4），用于检测标准品。</li>
			<li>将磷酸盐储存液于 4 oC 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>参见表 1，通过梯度稀释法配制终体积均为 1250 µL 的 PO4 标准品。根据表 1，向 1.5 mL 离心管中加入相应量的磷酸盐溶液和超纯去离子水。
		<ol>
			<li>将配制好的 PO4 标准品于 -20 oC 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="7">磷酸盐标准溶液&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mM PO4 溶液 (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1,200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>超纯去离子水 (mL)</td>
			<td>1,250</td>
			<td>1,175</td>
			<td>1,100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO4 的终浓度 [pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1,200</td>
			<td>2,400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：磷酸盐标准品。
2. 重组突触核蛋白处理下的PP2A活性检测
注意：每个反应的最终总体积为 60 µL，因此实验人员必须根据每个样品所用的突触核蛋白体积，适当调整 pNPP 缓冲液的初始体积。在大多数情况下，pNPP 缓冲液的体积应在 40 至 44 µL 之间。
<ol>
	<li>按如下方法配制每个PP2Ac反应体系。
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中加入39 µL pNPP缓冲液，置于冰上。</li>
		<li>加入1 µL人重组PP2Ac（rPP2Ac）（105 ng/µL或0.0007 U/µL）。</li>
		<li>将4 µL浓度为0、1.5、7.5、15或30 µM的突触核蛋白分别加入含pNPP缓冲液的rPP2Ac中，使终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0和2.0 µM，在旋转仪上4 °C孵育30分钟；终体积为60 µL。</li>
		<li>孵育30分钟后，将样品置于冰上，加入16 µL的2 mM pT底物。</li>
		<li>将每份PP2A检测混合物在30 °C水浴中孵育10分钟，期间间歇性振荡。</li>
		<li>向平底96孔板中，每孔加入25 µL的每种PO4 标准品（0、150、300、600、1,200 和 2,400 pmol）按从低到高的顺序设复孔。</li>
		<li>接着将按步骤 2.1.1 至 2.1.6 制备的各实验样品（PP2A 检测体系 ± synuclein）各 25 µL，分别加入同一块 96 孔板的复孔中。</li>
		<li>接下来，向含有标准品和样品的每个孔中加入 75 µL MGT 工作液。</li>
		<li>将培养板在室温下放置10分钟。</li>
		<li>观察磷酸盐水平存在可测差异的样品中的颜色变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 光度分析
<ol>
	<li>使用分光光度酶标仪，在波长630 nm处测定含有标准品和样品的96孔板29。</li>
	<li>绘制所得吸光度曲线（在630 nm处读取的样品），并注意该曲线在PO4浓度达2,400 pmol时仍保持线性。</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
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</ol>

Perez 博士于1999年至2011年期间担任匹兹堡大学医学院神经病学系教职人员。&#160;

本实验采用对硝基苯磷酸盐（pT）的孔雀绿法测定PP2Ac活性，因为该方法比使用32P标记底物的传统方法更易于操作。与放射性测定法相比，该方法的另一优势在于放射性同位素具有一定风险且成本较高，尤其是半衰期较短的32P标记分子，这限制了试剂过期前可进行的实验次数。使用孔雀绿法而非放射性检测，还可避免产生32P废弃物的处理问题。与另一种使用底物对硝基苯基磷酸盐（pNPP）的比色法相比，孔雀绿法在测定丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性时具有较高的灵敏度；而pNPP法选择性较差，因其可被多种酶去磷酸化32。
用于检测PP2A活性的市售孔雀绿试剂盒已问世一段时间，并曾在实验室中使用过。然而，在进行大量孔雀绿检测时，这些试剂盒的成本变得过高。此外，市售的PP2A活性检测试剂盒仅在一年内保持稳定，而将试剂以粉末形式保存并妥善储存，则可长期保持其结构稳定性，随时提供可用的检测组分。
在测试 bSyn 和 gSyn 之前，先使用 aSyn 作为阳性对照，以刺激 PP2Ac 活性，确定实验所需的 PP2Ac 用量，并确认所得数据处于标准曲线（150 - 2400 pmol PO4）的检测范围内。值得注意的是，如果 aSyn 对 PP2Ac 的刺激过强，尽管反应通常呈线性，数据仍可能超出检测范围，同时 MGT 溶液中的化学物质会发生沉淀，导致无法使用酶标仪准确测定释放的游离 PO4 量。
鉴于aSyn在体内和体外均能影响PP2Ac的活性in vivo和in vitro12,19,21,23,25，且所有突触核蛋白具有较高的同源性，因此曾有假说认为，所有突触核蛋白家族成员均可能在无细胞体系中刺激PP2Ac活性。利用本文所述的比色法检测发现，三种重组突触核蛋白（aSyn、bSyn、gSyn）确实均可刺激PP2Ac活性，提示这三种突触核蛋白可能在神经系统中发挥类似功能。然而，帕金森病或路易体痴呆患者脑组织中，含有高度聚集aSyn的区域其PP2Ac活性降低23。具有类似路易体病理特征的小鼠组织也表现出PP2Ac活性下降25。这些发现，结合图3中的新数据以及aSyn基因敲除小鼠的既往研究结果12，强烈提示在脑内，bSyn和gSyn通常无法补偿可溶性aSyn的缺失；或者，这些突触核蛋白同源物与PP2Ac的结合能力可能不如aSyn强（如图3所示）。艾伦脑图谱（Allen Brain Atlas）显示，三种突触核蛋白的mRNA在许多脑区存在共定位现象，尽管已有三重突触核蛋白基因敲除小鼠模型的报道9,33，但该模型中尚未检测PP2Ac活性。有趣的是，被Polo样激酶2在Ser129位点磷酸化的aSyn激活PP2Ac的能力减弱12，但本文关于bSyn的证据表明，bSyn的磷酸化可能不会显著影响PP2Ac活性，因为在小鼠脑组织中与PP2Ac共沉淀的bSyn极少（图3）。综上所述，这些数据表明，内源性PP2Ac活性调节因子（如aSyn）可能在健康与疾病过程中发挥重要作用。
本文所述方案是一种简单而有效的技术，用于测定PP2Ac在不同处理条件下对磷酸化肽底物去磷酸化能力。例如，相同的方法可用于检测其他PP2Ac激活剂（如神经酰胺以及潜在的新治疗药物34）的作用，或用于评估PP2Ac抑制剂在体外的效应。in vitro。还需指出的是，类似检测方法可用于测定通过1D6免疫沉淀法从细胞提取物或机体组织中分离得到的PP2Ac活性，作者此前已对此有所描述12,19,25。此外，亮绿比色法的应用前景不仅限于PP2Ac活性的测定，还可用于测定ATP活性。
注意，每次独立进行PP2Ac检测时都必须生成标准曲线。必须确保所使用的所有试剂均不含磷酸盐，因为游离磷酸盐会人为增加背景信号并导致结果错误。在检测当天，必须为所有待测样品配制足量的新鲜MGT溶液。此外，MGT仅在配制当天有效，数小时后易发生沉淀。从供应商处购买的PP2Ac在收到后必须立即分装并冷冻保存，以避免反复冻融导致其活性降低。由于其他磷酸酶也可能去磷酸化pT底物，例如 PP1 和 PP535在分析未通过免疫沉淀法分离PP2Ac的细胞或组织提取物时，必须将样品通过层析柱以去除游离磷酸盐，并需使用磷酸酶特异性抑制剂来确认磷酸酶的特异性，具体方法如前所述。18.

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Brian S. Marcus

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Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

研究显示，突触核蛋白家族成员在脑和脊髓中的分布表明，这三种突触核蛋白均富集于神经组织中，但其定位模式存在差异1。例如，α-突触核蛋白（aSyn）在大脑皮层和基底神经节的突触前部位含量最为丰富2,3，β-突触核蛋白（bSyn）在脑和脊髓中的分布较为均匀4,5，而γ-突触核蛋白（gSyn）在脊髓和外周神经节中含量更高6。尽管这三种突触核蛋白可能在胚胎期已有一定表达，但它们在新生期表达量显著增加4,5,6,7,8。值得注意的是，突触核蛋白三重敲除小鼠的研究数据显示，三种突触核蛋白的缺失会导致随年龄增长而出现的神经元功能障碍9，这支持了突触核蛋白在中枢神经系统（CNS）中具有重要功能的观点10,11。目前尚不清楚突触核蛋白三重敲除小鼠是否表现出PP2Ac分布或活性的改变。单个突触核蛋白敲除小鼠的研究数据表明，仅缺失aSyn即可显著降低脑内PP2Ac的活性12。除了中枢神经系统外，所有突触核蛋白也在全身其他组织中存在定位13,14,15。
由于其与神经退行性变之间明确的遗传关联16,17，aSyn 是这三种突触核蛋白中研究最为深入的一种。Perez 实验室长期致力于阐明 aSyn 的正常功能活性，尤其是在中枢神经系统（CNS）中的作用11,12,18,19,20,21,22,23 以及最近在外周组织中24,25其中一项发现是，aSyn 在刺激 PP2Ac 活性方面发挥关键的调控作用19PP2A 活性广泛参与正常脑功能，包括多巴胺生成的调控26PP2A全酶由三个独立的亚基组成：催化性C亚基（PP2Ac）、支架A亚基以及多种不同的调节/靶向B亚基之一。这些B亚基有助于将PP2A定位于特定的亚细胞微区，从而赋予PP2A功能多样性。27有证据表明，aSyn与PP2Ac的相互作用显著影响其磷酸酶活性。 体外 和 体内12,19,21,23,25当α-突触核蛋白（aSyn）在蛋白质聚集体中累积时（如在帕金森病和路易体痴呆（DLB）患者神经元内形成路易小体时），含有聚集性aSyn的组织中PP2Ac活性降低。23,25，当可溶性 aSyn 水平降低时。鉴于这三种突触核蛋白具有显著的同源性28 （aSyn与bSyn有66%的同源性，与gSyn有56%的同源性），并且已知aSyn有助于激活PP2Ac，因此推测突触核蛋白家族的所有成员均可能至少在一定程度上增强PP2Ac活性 体外为了评估这一点，采用基于Fathi方法的简单比色法检测了重组aSyn、bSyn和gSyn处理下PP2Ac的活性。 等29该方法及新发现在此详述。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;（氯化钙）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>浓盐酸（Concentrated HCl）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>孔雀绿草酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>苏氨酸磷酸肽（KRpTIRR）</td><td>New England Peptide LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（磷酸二氢钾）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>重组人PP2A C亚基</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10011237</td><td></td></tr><tr><td>重组人&amp;alpha;-突触核蛋白</td><td>rPeptide</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>重组人&amp;beta;-突触核蛋白</td><td>rPeptide</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>重组人&amp;gamma;-突触核蛋白</td><td>rPeptide</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 抗体</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>aSyn 抗体 C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>bSyn 抗体 EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>gSyn 抗体 E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin 脱盐柱，7K MWCO，0.5 mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备/软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Spectrum 酶标仪</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>51118650</td><td></td></tr><tr><td>pH计&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

重组α-、β-和γ-突触核蛋白在无细胞实验中激活蛋白磷酸酶2a催化亚基活性

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

α-突触核蛋白（aSyn）、β-突触核蛋白（bSyn）和γ-突触核蛋白（gSyn）属于一类保守的类分子伴侣蛋白家族，在脊椎动物神经组织中高表达。在三种突触核蛋白中，仅有aSyn被明确证实与神经退行性疾病相关，例如帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩。在研究aSyn正常功能的过程中，已有数据表明，aSyn可增强一种广泛表达的去磷酸化酶催化亚基PP2Ac的活性。 体外 和 体内先前的研究数据显示，在出现路易小体病理的脑区，人脑中α-突触核蛋白（aSyn）的聚集会导致PP2Ac活性降低，这些区域中的可溶性aSyn已转变为不可溶形式。然而，由于三种突触核蛋白（synucleins）的氨基酸序列具有较高的同源性，因此设计实验以检验它们是否均能调节PP2Ac活性。通过使用重组的突触核蛋白和重组PP2Ac蛋白，采用孔雀绿比色法检测酶活性。结果表明，在无细胞体系中，三种重组突触核蛋白均能刺激PP2Ac的活性，提示突触核蛋白之间保守的序列同源性可能赋予这三种同源蛋白结合并激活PP2Ac的能力。然而，共免疫沉淀实验数据表明，PP2Ac的调节可能主要通过aSyn与PP2Ac之间的内源性相互作用实现。 体内.

蛋白质的功能和活性可受到翻译后修饰（如磷酸化）的影响。许多蛋白质可由激酶催化发生磷酸化，或由磷酸酶催化发生去磷酸化。以蛋白磷酸酶2A（PP2A）为例，这种多亚基磷酸酶能够介导多种磷蛋白上丝氨酸和苏氨酸残基的去磷酸化。PP2A活性异常可导致蛋白质功能失调，这种现象见于多种疾病，例如帕金森病中α-突触核蛋白（aSyn）可能发生过度磷酸化，以及阿尔茨海默病中tau蛋白可能发生过度磷酸化。上述发现为优化实验室内部方法以快速评估PP2Ac活性提供了依据，并有助于判断PP2Ac活性异常是否可能导致细胞功能障碍。
利用这种无细胞比色法，通过定量测定pT底物释放的无机磷酸盐（PO4）量来检测PP2Ac的活性（图1A），并与标准曲线中已知的皮摩尔（picomolar）浓度的PO4进行比较（图1B）。同时检测了在0.0、0.1、0.5、1.0和2.0 µM不同浓度突触核蛋白（synucleins）存在下PP2Ac的活性变化（图1A），并与未添加突触核蛋白时的PP2Ac基础活性（即图1A中大箭头所示位置）进行比较。
<img alt="ELISA 微孔板及显示突触核蛋白磷酸化水平与吸光度数据分析的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：通过重组突触核蛋白激活 PP2A，其活性相对于标准品中已知的磷酸盐水平进行测量。 在（A）中，评估了 aSyn、bSyn 和 gSyn 在 0 - 2 µM 蛋白浓度范围内的活性，并与 0 - 2400 pmol PO4 标准品进行比较。（B）生成了孔雀绿 PP2Ac 检测试剂的标准曲线，以提供已知量的磷酸盐，用于计算实验条件下获得的数值。在所有情况下，当 PP2Ac 活性增加时，从 pT 底物中裂解出的游离 PO4 量增加，从而产生更深的绿色。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
结果表明，在初始孵育步骤中向 PP2Ac 加入突触核蛋白可增加游离 PO 的量4 测量，从而表明PP2Ac活性增加。经过多次重复实验的统计分析显示，三种重组突触核蛋白（aSyn、bSyn、gSyn）均显著增强PP2Ac活性（图2这些结果表明，可溶性细胞内突触核蛋白含量的变化能够改变PP2Ac的活性，从而可能影响细胞稳态。然而，目前尚不清楚这三种突触核蛋白是否均参与PP2Ac的激活。 体内，尽管数据在 图3 表明aSyn可能参与调控PP2Ac活性 体内.
<img alt="PP2A活性柱状图；突触核蛋白浓度；统计分析；蛋白质相互作用结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：三种突触核蛋白均能刺激PP2Ac活性。图中显示了在不同浓度的重组aSyn、bSyn或gSyn作用下PP2Ac活性的激活情况。三种重组突触核蛋白均能刺激PP2Ac活性。在大多数实验中，aSyn的作用略强，但通过统计学软件进行的方差分析（ANOVA）结果显示，三者总体差异极小。数据代表4–9次独立实验的平均值±标准误（SEM）。ns，无显著性差异；* p &lt;0.05；** p &lt;0.01；**** p &lt;0.0001。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了评估哪些突触核蛋白（synuclein）能够在脑内与PP2Ac相互作用，使用野生型小鼠脑组织及PP2Ac特异性抗体1D6进行了免疫共沉淀（Co-IP）实验。随后通过SDS-PAGE分离蛋白质，并利用已建立的方法对印迹膜进行检测，分别使用针对PP2Ac、aSyn、bSyn和gSyn的抗体进行探查19。重组突触核蛋白对照显示aSyn、bSyn和gSyn抗体具有特异性（图3A）。Co-IP结果表明，在脑内与PP2Ac主要结合的突触核蛋白是aSyn，因为仅有少量bSyn被共沉淀下来（图3B），而未检测到gSyn的共沉淀（数据未显示）。这提示内源性aSyn在脑内调控PP2Ac方面具有独特作用。此外，该结果也提示基于bSyn的治疗策略在调节PP2Ac活性方面具有潜在应用价值，可用于突触核蛋白病患者的PP2A活性恢复，因为bSyn本身不形成淀粉样聚集，但如本研究所示，仍可激活PP2Ac30,31。
<img alt="显示用于蛋白质相互作用研究的蛋白质样品（raSyn、rbSyn、rgSyn）的蛋白质印迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：PP2Ac 与小鼠脑内源性突触核蛋白的相互作用。（A）如文下所述，使用特异性抗突触核蛋白抗体检测重组 aSyn、bSyn 和 gSyn。（B）利用小鼠脑匀浆进行免疫共沉淀（Co-IP），使用抗体 1D6，随后在免疫印迹上分析样品。数据显示了 PP2Ac、aSyn 和 bSyn 的结果，而 gSyn 未与 PP2Ac 发生共沉淀，故未显示。起始样品显示初始匀浆中 PP2Ac（第 1 泳道）、aSyn（第 4 泳道）和 bSyn（第 7 泳道）的相对水平。终末样品显示 1D6 抗体介导的 PP2Ac 免疫共沉淀后匀浆中残留的 PP2Ac（第 2 泳道）、aSyn（第 5 泳道）和 bSyn（第 8 泳道）水平。使用 1D6 抗体可有效免疫沉淀出大量 PP2Ac（第 3 泳道），同时共沉淀出较多 aSyn（第 6 泳道，箭头处），而 bSyn 沉淀量极少（第 9 泳道，为显示微弱信号已大幅过度曝光，箭头处）。\*星号和方括号标记印迹上的非特异性信号。有关所用抗体的详细信息，请参见材料表。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种实验方案，通过简单的比色法检测重组α-突触核蛋白、β-突触核蛋白或γ-突触核蛋白存在条件下，重组蛋白磷酸酶2A催化亚基（PP2Ac）活性的变化。我们展示了在小鼠脑组织中α-突触核蛋白对PP2Ac特异性的相关研究结果。

重组α-、β-和γ-突触核蛋白在无细胞实验中激活蛋白磷酸酶2A催化亚基活性

α-突触核蛋白（aSyn）、β-突触核蛋白（bSyn）和γ-突触核蛋白（gSyn）是进化保守的类分子伴侣蛋白家族的成员，其在神经系统中高度表达……

重组α、β和γ突触核蛋白在无细胞实验中可刺激蛋白磷酸酶2A催化亚基的活性。您好，我叫Sovanarak Lek。我是德克萨斯理工大学健康科学中心埃尔帕索保罗·L·福斯特医学院的医学专业学生。在本视频中，我将演示一种使用重组突触核蛋白的蛋白磷酸酶双色比色测定法。缓冲液与试剂的配制。p-硝基苯磷酸盐缓冲液的配制。配制 50 mL pNPP 缓冲液：将 Trizma 碱溶解于烧杯中的 25 mL 超纯去离子水中。加入一根干净的搅拌子，并置于磁力搅拌器上。待 Trizma 溶解后，在持续搅拌下加入氯化钙。调节pH至7.0。将溶液转移至量筒中，用超纯去离子水定容至终体积50 mils。配制孔雀石绿溶液。孔雀石绿溶液需要三种组分，分别为A液、B液和C液。A液为4摩尔盐酸。B液由钼酸铵与A液混合而成。C液为0.045%的孔雀石绿草酸盐。配制溶液D时，将1份溶液B与3份溶液C混合，即1:3的比例。室温下搅拌1小时。最后，将溶液D通过22 µm滤膜过滤，并在4 °C下保存。避光。活化剂的制备。活化剂为1% Tween 20溶液。将10微升Tween 20加入990微升超纯去离子水中，用移液器混匀。涡旋振荡直至Tween 20完全溶解。配制含Tween 20的孔雀绿工作液。将激活剂按1:100的比例加入溶液D中。制备苏氨酸磷酸肽。配制2 mM pT储备液时，将550微升超纯去离子水加入1毫克pT中。涡旋至磷酸化肽完全溶解。置于冰上立即使用。将多余的pT分装样品储存在-20摄氏度。α-突触核蛋白的制备。将一毫克α-突触核蛋白溶于一毫升超纯去离子水中，终浓度为一毫克每毫升。轻轻涡旋振荡以溶解。立即使用，并将未使用的等分试样储存在负80摄氏度。制备磷酸盐标准溶液。磷酸盐标准溶液制备步骤一。配制 1 mM 磷酸盐储备液：将磷酸钾溶解于含磁力搅拌子的烧杯中的超纯去离子水中。转移至量筒，并定容至 100 mils。此为 10 mM 溶液。使用大号注射器将整个溶液通过22微米滤器过滤。将滤液稀释至1比100，制备成用于检测标准品的1 mM磷酸盐溶液。磷酸盐标准品步骤二。根据表格，向1.5 ml离心管中加入适量磷酸盐和超纯去离子水。这将得到含150、300、600、1,200和2,400 pmol磷酸盐的溶液。分装后于-20 °C保存。PP2A 活性检测。在冰上用 1.5 毫升离心管配制 PP2A 检测体系。加入 43 微升 pNPP 缓冲液。加入1微升人重组PP2Ac。加入突触核蛋白，并在4摄氏度下于旋转混合仪中孵育PP2A与突触核蛋白30分钟。随后，加入16微升2 mM pT。在30摄氏度水浴中孵育10分钟。在平底96孔板中，从低到高浓度每个磷酸盐标准品重复加入25微升。用移液器将每个PP2A检测样品各24微升，重复加样至同一96孔板中的标准品孔内。向每个样品和标准品中加入含有 Tween 20 的 75 微升溶液 D。加入 MGT 后，当存在游离磷酸盐时，您将观察到孔中出现颜色变化。进行光度分析。在分光光度计上设置为 630 纳米进行分析。代表性结果。此处展示了一次典型的 PP2A 检测实验及标准曲线图。左侧为磷酸盐标准品。孔中所含磷酸盐越多，绿色越深。右侧为PP2A，分别与不同摩尔浓度的α、β或γ突触核蛋白共同孵育。较高浓度在刺激PP2A催化亚基活性方面效果更显著。此处显示的是α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白在不同浓度下对PP2A活性影响的图示结果。在1至2微摩尔浓度下，α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白均能显著促进PP2A的活性。在0.5微摩尔浓度下，仅有α-突触核蛋白和β-突触核蛋白显著促进PP2A活性。图三显示了PP2Ac与小鼠脑内源性突触核蛋白的相互作用。在A中，重组的α、β和γ突触核蛋白作为阳性对照显示。在B中，使用PP2Ac特异性抗体1D6进行共免疫沉淀，结果沉淀出PP2Ac，同时也沉淀出大量相互作用的α-突触核蛋白，但几乎未沉淀出β-突触核蛋白。共免疫沉淀实验中未检测到γ-突触核蛋白与PP2Ac结合。该共免疫沉淀数据表明，α-突触核蛋白是体内PP2Ac的内源性调节因子。我们要感谢所有帮助我们完成本视频制作的人员。最后，这是露丝·佩雷斯（Ruth Perez）和索纳瓦拉克·莱克（Sonavarak Lek）。Javier Vargas。祝您取得巨大成功。再见，祝您好运。

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研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

利什曼原虫翻译提取物（LTE）是一种源自单细胞寄生虫Leishmania...

LTE的制备与优化 Leishmania tarentolae 衍生的无细胞蛋白表达系统用于重组蛋白生产

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

了解如何使用比色法测定重组α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白对蛋白磷酸酶2A催化亚基活性的刺激作用。该方法有助于研究神经退行性疾病中的蛋白质相互作用机制。

重组α-、β-和γ-突触核蛋白在无细胞实验中激活蛋白磷酸酶2A催化亚基活性

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