重组α-、β-和γ-突触核蛋白在无细胞实验中激活蛋白磷酸酶2A催化亚基活性

重组α、β和γ突触核蛋白在无细胞实验中可刺激蛋白磷酸酶2A催化亚基的活性。您好，我叫Sovanarak Lek。我是德克萨斯理工大学健康科学中心埃尔帕索保罗·L·福斯特医学院的医学专业学生。

在本视频中，我将演示一种使用重组突触核蛋白的蛋白磷酸酶双色比色测定法。缓冲液与试剂的配制。p-硝基苯磷酸盐缓冲液的配制。

配制 50 mL pNPP 缓冲液：将 Trizma 碱溶解于烧杯中的 25 mL 超纯去离子水中。加入一根干净的搅拌子，并置于磁力搅拌器上。待 Trizma 溶解后，在持续搅拌下加入氯化钙。

调节pH至7.0。将溶液转移至量筒中，用超纯去离子水定容至终体积50 mils。

配制孔雀石绿溶液。孔雀石绿溶液需要三种组分，分别为A液、B液和C液。A液为4摩尔盐酸。B液由钼酸铵与A液混合而成。C液为0.045%的孔雀石绿草酸盐。

配制溶液D时，将1份溶液B与3份溶液C混合，即1:3的比例。室温下搅拌1小时。最后，将溶液D通过22 µm滤膜过滤，并在4 °C下保存。

避光。活化剂的制备。活化剂为1% Tween 20溶液。

将10微升Tween 20加入990微升超纯去离子水中，用移液器混匀。涡旋振荡直至Tween 20完全溶解。配制含Tween 20的孔雀绿工作液。

将激活剂按1:100的比例加入溶液D中。制备苏氨酸磷酸肽。配制2 mM pT储备液时，将550微升超纯去离子水加入1毫克pT中。

涡旋至磷酸化肽完全溶解。置于冰上立即使用。将多余的pT分装样品储存在-20摄氏度。

α-突触核蛋白的制备。将一毫克α-突触核蛋白溶于一毫升超纯去离子水中，终浓度为一毫克每毫升。轻轻涡旋振荡以溶解。

立即使用，并将未使用的等分试样储存在负80摄氏度。制备磷酸盐标准溶液。磷酸盐标准溶液制备步骤一。

配制 1 mM 磷酸盐储备液：将磷酸钾溶解于含磁力搅拌子的烧杯中的超纯去离子水中。转移至量筒，并定容至 100 mils。此为 10 mM 溶液。

使用大号注射器将整个溶液通过22微米滤器过滤。将滤液稀释至1比100，制备成用于检测标准品的1 mM磷酸盐溶液。磷酸盐标准品步骤二。

根据表格，向1.5 ml离心管中加入适量磷酸盐和超纯去离子水。这将得到含150、300、600、1,200和2,400 pmol磷酸盐的溶液。分装后于-20 °C保存。

PP2A 活性检测。在冰上用 1.5 毫升离心管配制 PP2A 检测体系。加入 43 微升 pNPP 缓冲液。

加入1微升人重组PP2Ac。加入突触核蛋白，并在4摄氏度下于旋转混合仪中孵育PP2A与突触核蛋白30分钟。随后，加入16微升2 mM pT。

在30摄氏度水浴中孵育10分钟。在平底96孔板中，从低到高浓度每个磷酸盐标准品重复加入25微升。用移液器将每个PP2A检测样品各24微升，重复加样至同一96孔板中的标准品孔内。

向每个样品和标准品中加入含有 Tween 20 的 75 微升溶液 D。加入 MGT 后，当存在游离磷酸盐时，您将观察到孔中出现颜色变化。进行光度分析。

在分光光度计上设置为 630 纳米进行分析。代表性结果。此处展示了一次典型的 PP2A 检测实验及标准曲线图。

左侧为磷酸盐标准品。孔中所含磷酸盐越多，绿色越深。右侧为PP2A，分别与不同摩尔浓度的α、β或γ突触核蛋白共同孵育。

较高浓度在刺激PP2A催化亚基活性方面效果更显著。此处显示的是α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白在不同浓度下对PP2A活性影响的图示结果。在1至2微摩尔浓度下，α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白均能显著促进PP2A的活性。

在0.5微摩尔浓度下，仅有α-突触核蛋白和β-突触核蛋白显著促进PP2A活性。图三显示了PP2Ac与小鼠脑内源性突触核蛋白的相互作用。在A中，重组的α、β和γ突触核蛋白作为阳性对照显示。

在B中，使用PP2Ac特异性抗体1D6进行共免疫沉淀，结果沉淀出PP2Ac，同时也沉淀出大量相互作用的α-突触核蛋白，但几乎未沉淀出β-突触核蛋白。共免疫沉淀实验中未检测到γ-突触核蛋白与PP2Ac结合。该共免疫沉淀数据表明，α-突触核蛋白是体内PP2Ac的内源性调节因子。

我们要感谢所有帮助我们完成本视频制作的人员。最后，这是露丝·佩雷斯（Ruth Perez）和索纳瓦拉克·莱克（Sonavarak Lek）。

Javier Vargas。祝您取得巨大成功。再见，祝您好运。