快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

CD11b磁珠分离小胶质细胞的总体目标是在相对较短的时间内获得高纯度的出生后小胶质细胞终产物，以用于多种体外实验。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如与神经炎症相关的信号传导机制。与现有方法相比，该技术的主要优势在于分离过程仅需约30分钟，且在纯度、得率和细胞活性方面均无损失。

首先，将出生后一至两天的小鼠幼崽新鲜断头的头部转移至超净工作台。然后，使用4.5英寸直头显微解剖剪，将剪尖插入断头后形成的开口处，在颅骨和脑膜上做一小切口，沿尾侧向头侧方向剪开。完成切口后，将一侧脑半球掀开至旁边。

然后使用一对弯头或钩状镊子取出整个大脑。将大脑转移至含有2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA的50毫升离心管中，在37°C水浴中孵育15分钟。通过添加并移除新鲜培养基，洗涤大脑。

洗涤完成后，每份脑组织加入两毫升培养基，通过吹打脑组织进行匀浆。当脑组织不再变小时，换用孔径更小的移液枪头继续吹打。吹打结束时，当悬液变得澄清且无可见组织块，将悬液通过70微米细胞滤网，以制备单细胞培养物。

然后将8至9毫升培养基移液至T75培养瓶中，每脑使用两个培养瓶，每瓶加入1毫升脑匀浆。细胞培养至第16天进行分离。培养16天后，将培养瓶中的培养基转移至新的50毫升离心管中。

向每个T75培养瓶中加入3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。然后将培养瓶置于旋转摇床上，在室温下振荡5分钟。以0.4 × g离心培养基5分钟。

振荡五分钟后，加入至少四毫升的离心培养基以终止胰蛋白酶EDTA反应，并吹打混匀以确保所有细胞均已脱落。随后将细胞通过70微米细胞滤网，制备成单细胞悬液。进行细胞计数，然后以0.4 × g离心五分钟。

接下来，取一个5毫升的聚苯乙烯管，加入1毫升推荐的培养基，并标记弯月面位置。再将推荐的培养基补充至2.5毫升，同样标记该弯月面位置。然后，移除培养基，并将沉淀物重新悬浮于500微升推荐的培养基中。

将此混合液转移至一个5毫升的聚苯乙烯管中，然后稀释至1毫升刻度线。每1毫升悬浮细胞中加入50微升大鼠血清，在室温下孵育5分钟。孵育期间，通过混合25微升组分A和25微升组分B来配制分选混合液。5分钟结束后，向细胞中加入50微升分选混合液，并在室温下继续孵育5分钟。

将微球涡旋震荡45秒。然后每1毫升样品中加入80微升微球，在室温下孵育3分钟。接着，加入推荐的培养基至聚苯乙烯管的2.5毫升刻度线处。

将试管置于磁力架上，室温静置3分钟。孵育结束后，缓慢将上清液倒入仍处于磁力架上的15毫升聚苯乙烯试管中。再重复磁分离操作三次，每次加入推荐培养基至2.5毫升刻度线。

最后一次磁性分离后，加入三毫升培养基，使用细胞计数器对细胞数量进行计数。将细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的培养板中用于处理。将15毫升离心管中的阴性组分（主要含有星形胶质细胞）接种至T75培养瓶中。

在37摄氏度培养箱中孵育至少六小时后，将含有阴性组分的培养瓶中的所有生长培养基更换，然后放回培养箱继续培养。该图像显示了分离的小胶质细胞培养物的免疫细胞化学染色结果，其中绿色通道检测小胶质细胞标志物IBA，红色通道检测星形胶质细胞标志物GFAP。Hoechst染色显示了细胞核的存在。

缺乏 GFAP 阳性细胞表明，使用 CD11b 阳性选择试剂盒分离的 microglia 同样具有高纯度。对分离的 microglia 培养物中提取的蛋白质进行免疫印迹检测，检测靶标为 GFAP（呈现为约 51 千道尔顿的条带）和 IBA1（呈现为约 15 千道尔顿的条带）。Beta-actin 用作上样对照，出现在约 42 千道尔顿处。

旧的分离试剂盒存在一个问题，即PE荧光可能会在红色通道中被观察到，如图所示。经过改进的实验步骤不会使磁珠在红色通道中产生任何自发荧光，如图所示。采用该方法分离得到的小胶质细胞可用于信号通路研究。

Western blot 分析显示，采用我们新优化的方法分离的小胶质细胞中可检测到 Fyn 和磷酸化 Src 酪氨酸 Y416。小胶质细胞分离所得的阴性组分中含有星形胶质细胞，可用于信号通路研究。Western blotting 结果表明，该阴性组分含有 GFAP 阳性细胞。

Western blot 分析显示，可在 GFAP 阳性细胞中检测到 Fyn 和磷酸化 Src 酪氨酸 Y416。通过此方法，可进一步采用多通道荧光显微镜、Western blotting 和定量 PCR 等其他技术，以研究基因表达和蛋白质信号通路相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用该快速分离技术开展小胶质细胞实验研究。