原代小胶质的快速和精细的CD11b电磁隔离带增强的纯度和多功能性
April 13th, 2017
这里，我们提出用于体外实验的协议来隔离来自出生后小鼠幼仔的小胶质细胞（1天）。此简易分离方法产生了高收率和纯度，在替代方法一个优点显著允许阐明小胶质生物学的目的范围广泛的实验。
CD11b 磁性小胶质细胞分离的总体目标是在相对较短的时间内实现出生后小胶质细胞的高纯度最终产量，用于多功能体外实验。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如与神经炎症相关的信号传导机制。与目前可用的方法相比，该技术的主要优点是分离大约需要 30 分钟，而不会牺牲纯度、产量或活力。
首先将刚斩首的头部从 1 到 2 天大的小鼠幼崽转移到层流罩中。然后，使用 4.5 英寸直显微解剖剪刀在颅骨和脑膜上做一个小切口，将尖端插入斩首形成的开口中，并从尾部到喙部。切开后，将一个半球剥到一边。
然后使用一对弯曲或钩状的镊子去除整个大脑。将大脑转移到含有 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 的 50 毫升试管中，并在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。通过添加和去除培养基，用新鲜的生长培养基洗涤大脑。
洗涤完成后，每个大脑加入 2 毫升生长培养基，并通过研磨大脑进行匀浆。当脑组织没有变小时，过渡到孔径较小的移液器。研磨结束时，当悬浮液透明且没有可见的块状物时，将悬浮液通过 70 微米细胞过滤器，以产生单细胞培养物。
然后将 8 至 9 毫升生长培养基移液到 T75 培养瓶中，每个大脑 2 个培养瓶，并向每个培养瓶中加入 ml 脑匀浆。培养细胞直至第 16 天分离。16 天后，将生长培养基从培养瓶转移到新的 50 mL 试管中。
向每个 T75 培养瓶中加入 3 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。然后在轨道摇床上在室温下摇动培养瓶 5 分钟。将生长培养基以 0.4 x g 离心 5 分钟。
振荡 5 分钟后，加入至少 4 mL 的离心培养基以终止胰蛋白酶 EDTA 反应，并研磨以确保所有细胞均已分离。然后将细胞通过 70 微摩尔的细胞过滤器，以产生单细胞培养物。进行细胞计数，然后以 0.4 倍 g 的浓度离心 5 分钟。
接下来，取 5 毫升聚苯乙烯管，加入 1 毫升推荐培养基，并标记弯液面。添加推荐高达 2.5 毫升的培养基，并标记此弯液面。然后，去除培养基，并将沉淀重新悬浮在 500 μL 推荐培养基中。
将此混合物转移到 5 毫升聚苯乙烯管中，然后稀释至 1 毫升标记。然后，每 1 mL 悬浮细胞加入 50 μL 大鼠血清，并在室温下孵育 5 分钟。在孵育过程中，混合 25 μL 组分 A 和 25 μL 组分 B 来制备选择混合物，5 分钟过后，向细胞中加入 50 μL 选择混合物，并在室温下再孵育 5 分钟。
涡旋微球 45 秒。然后每 1 mL 样品加入 80 μL 微球，并在室温下孵育 3 分钟。接下来，在聚苯乙烯管上添加推荐的培养基，直至 2.5 毫升标记。
将试管放入磁性支架中，在室温下放置 3 分钟。孵育后，将培养基缓慢倒入仍在磁力架中的 15 毫升聚苯乙烯管中。再重复磁分离 3 次，每次添加推荐的培养基至 2.5 mL
。最后一次磁分离后，加入 3 mL 生长培养基，并使用细胞计数仪计数细胞数。将细胞接种在多聚-D-赖氨酸包被的板中进行处理。将 15 毫升试管中的阴性馏分（主要含有星形胶质细胞）接种在 T75 烧瓶中。
在 37 摄氏度的培养箱中孵育至少 6 小时后，在返回培养箱之前更换培养瓶中含有阴性组分的所有生长培养基。该图像显示了分离的小胶质细胞培养物的免疫细胞化学，其中 IBA（绿色通道中小胶质细胞的标志物）和 GFAP（星形胶质细胞的标志物）在红色通道中。Hoechst 染色显示细胞核的存在。
GFAP 阳性细胞的缺失表明，使用 CD11b 阳性选择试剂盒分离的小胶质细胞也具有高纯度。探测来自分离的小胶质细胞培养物的这些免疫印迹蛋白的 GFAP（表现为约 51 道尔顿带）和 IBA1（表现为约 15 道尔顿带）。β-肌动蛋白被用作负载对照，出现在大约 42 道尔顿。
旧分离试剂盒的一个问题是可以在红色通道中观察到 PE 荧光，如图所示。修改后的程序不会从磁珠中产生任何自发荧光，如此处的红色通道所示。使用该程序分离的小胶质细胞可用于信号研究。
Western blot 分析显示，使用我们新改进的方法可以从分离的小胶质细胞中检测到 Fyn 和磷酸化 src 酪氨酸 Y416。小胶质细胞分离的阴性组分含有可用于信号转导研究的星形胶质细胞。Western blotting 显示阴性组分含有 GFAP 阳性细胞。
Western blot 分析显示，可以从 GFAP 阳性细胞中检测到 Fyn 和磷酸化 src 酪氨酸 Y416。在此程序之后，可以执行其他方法，如多通道荧光显微镜、蛋白质印迹和定量 PCR，以回答有关基因表达和蛋白质信号转导的问题。观看此视频后，您应该对如何利用这种快速分离技术进行小胶质细胞实验有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种从新生小鼠幼鼠中分离小胶质细胞以进行体外实验的协议。该方法实现了高产量和高纯度，为广泛的小胶质细胞生物学研究提供了便利。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 小胶质细胞生物学
背景
- 小胶质细胞在神经炎症中扮演着关键角色。
- 分离小胶质细胞对于研究其功能至关重要。
- 当前的方法可能缺乏效率或纯度。
- 该协议旨在解决这些局限性。
研究目的
- 提供一种可靠的小胶质细胞分离方法。
- 增进对小胶质细胞信号传导机制的理解。
- 促进多样化的体外实验。
使用的方法
- CD11b磁性小胶质细胞分离技术。
- 使用新鲜断头的小鼠幼鼠头部。
- 快速分离过程，约需30分钟。
- 保持高纯度、高产量和高活力的小胶质细胞。
主要结果
- 分离的小胶质细胞具有高纯度和高产量。
- 相比现有方法，分离过程更高效。
- 在神经科学研究中具有广泛应用的潜力。
- 促进神经炎症信号传导的探索。
结论
- 该协议是小胶质细胞研究的重大进展。
- 它允许快速和有效地分离小胶质细胞。
- 该方法可以引领神经科学的新见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, high-purity isolation of primary microglia enables robust in vitro modeling of neuroinflammatory mechanisms, supporting early discovery and target validation in neurodegeneration research. This refined CD11b magnetic separation protocol delivers reproducible cell populations for downstream signaling and gene expression studies, reducing biological ambiguity at critical pipeline inflection points. Enhanced yield and purity accelerate translational insights and portfolio triage for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial signaling pathways relevant to neuroinflammation and neurodegeneration.
- Supports functional target validation by providing pure, viable microglia for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in early-stage CNS target selection and de-risking.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-purity microglial cultures for reproducible assay development.
- Improves assay reliability by minimizing astrocyte contamination and autofluorescence artifacts.
- Enables quantitative readouts for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular models for studying neuroinflammatory responses in vitro.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling signaling and gene expression analyses.
- Reduces translational risk by ensuring experimental fidelity and biological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This refined isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling hypothesis-driven studies and assay development for CNS drug discovery.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microglial activation and signaling mechanisms in neuroinflammation.
- Screening: Provides assay-ready, pure microglia for reproducible compound evaluation and pathway analysis.
- Analytics: Enables quantitative protein and gene expression measurements for comparative studies.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant neuroinflammatory models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for CNS-focused R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroinflammation research.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable microglial isolation for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in CNS portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroinflammatory targets and programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary CNS cell isolation and handling.
- Needs access to magnetic separation instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to postnatal mouse models; extension to other species may require optimization.
- Potential limitations include scalability for large-scale screening and adaptation to adult tissue.
