用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

顺序盐提取法的总体目标是表征蛋白质与总染色质的结合特征，并评估当蛋白质自身或其环境发生改变时，这种结合如何发生变化。该方法可测量表观遗传调控因子与染色质之间的相对亲和力，可用于评估在基因、化学或环境干预条件下这些相互作用发生的变化。该技术的主要优势在于，它是一种快速且经济的方法，可用于分析染色质结合蛋白的结合特性。

刚进入染色质领域的研究人员通常在染色质免疫沉淀（ChIP）实验上遇到困难。连续盐萃取是一种经典技术，即使经验不足的科研人员也可使用该方法来回答许多相同的问题。开始实验时，从每种目标细胞系中收获 8,000,000 个细胞。

用5毫升预冷的PBS洗涤每个细胞样品，重复两次。将每个样品重悬于含蛋白酶抑制剂的1毫升低渗缓冲液中。将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。

将悬浮液上下颠倒旋转 10 分钟，温度为 4 °C，然后在相同温度下以 6,000 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。使用 1 mL 吸头装配微量移液器。

向沉淀中加入 200 微升含蛋白酶抑制剂的无盐改良 RIPA 缓冲液。将移液器吸头轻触微量离心管底部，使沉淀进入吸头内。上下吹打沉淀 15 次。

随着沉淀物破裂，样品应变得浓稠且具有黏性。以这种方式匀浆每个样品，并将样品在冰上孵育3分钟。然后在4°C条件下以6500 G离心3分钟。

将上清液转移至洁净的1.5毫升微量离心管中。向每份沉淀中加入200微升含100毫摩尔/升氯化钠及蛋白酶抑制剂的改良RIPA缓冲液。用移液器将沉淀吹打15次。

如果沉淀物最初难以吸入移液枪头，可轻敲枪头底部。对每个样品重复此操作，并将样品置于冰上孵育3分钟。在4°C条件下以6500 G离心3分钟。

将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。继续使用含逐渐增加氯化钠浓度的改良RIPA缓冲液溶液提取样品。当沉淀不再停留在管底时，在倾倒上清液前将沉淀置于离心管盖内。

经过连续盐提取后，对每个样品，向五个上清液组分中的每一个加入70毫升的4倍蛋白上样缓冲液。将每个组分的30微升上样至SDS丙烯酰胺凝胶。通过将蛋白质转移至膜并用相应的特异性一抗进行染色，进行标准的蛋白质印迹（Western blot）分析。

将印迹膜与标记有红外染料的二抗孵育，并对印迹膜进行成像。使用图像分析软件计算每种盐浓度下的条带强度。以条带强度对盐浓度作图，以确定目标蛋白的洗脱模式。

ARID1a 和 Polybromo 1 蛋白的连续盐梯度提取结果显示，它们分别在 200 和 300 毫摩尔的盐浓度下稳定洗脱。而对相同蛋白进行的非连续盐提取则表现出较低的一致性。针对每种待检测蛋白，孵育时间必须进行优化。

因此，采用SSE来分析不同孵育时间后的洗脱谱。转录激活因子Polybromo 1在孵育3分钟和10分钟时表现出相似的洗脱谱。而由BMI1指示的转录抑制因子Polycomb抑制复合物1（Polycomb Repressive Complex 1）则需要超过3分钟才能从染色质中释放。

通过分析洗脱谱的变化来研究蛋白质-蛋白质相互作用。在存在抑制剂的情况下，含溴结构域蛋白4在较低盐浓度下即被洗脱，而无抑制剂时则在较高盐浓度下洗脱。当细胞经组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理后，观察到组蛋白修饰模式的差异，从而改变了染色质的结构特征。

当细胞经历基因组应激时，蛋白质结合的变化也反映在洗脱谱中。此处，洗脱所需盐浓度的升高表明，在阿霉素诱导的DNA损伤后，Polybromo 1 与染色质的结合更加紧密。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三小时内完成。

进行该实验操作时，请务必尽可能保持每个样本处理的一致性。该方法可用于研究的初始阶段，以阐明染色质结合蛋白的作用机制及其调控方式，从而避免不必要的全基因组研究，节省时间和经费。