Name: 源自iPSC的人脑组织体的一代新型早期神经发育障碍 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解利用iPSC衍生的人脑组织体模拟早期神经发育障碍的方法。该技术通过神经球培养和EHS基质嵌入，为研究小头畸形等疾病的神经发生机制提供可重复的快速模型。

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本工作由弗里茨·蒂森基金会（Az.10.14.2.152）资助。我们感谢CMMC组织包埋平台和显微镜核心设施提供的支持。我们感谢中心体与细胞骨架生物学实验室成员在讨论和技术方面给予的支持。我们感谢李明贵对稿件的校对。

1. 脑类器官的生成（23 天）
<ol>
	<li>神经外胚层启动（5天） 
	注意：在开始分化之前，应考虑以下几点。重编程方法（基于慢病毒、基于仙台病毒、基于附加体或基于微小RNA） 等等。) 获得人iPSCs时，理想情况下所有患者和对照iPSC系应使用相同的重编程方法。目前已有多种基于已发表方案的重编程试剂盒及相关操作说明可供使用15,16,17,18人类iPSC细胞系的质量是实现最佳分化的关键。使用显微镜监测克隆和细胞形态，并通过检测Oct3/4、Nanog或TRA-1-60等标志物的表达来验证其多能性。
	<ol>
		<li>在涂有Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质的培养皿中，使用培养基A在无饲养层条件下培养人iPSCs。 
		注意：以无饲养层、无血清条件培养人iPSCs，以维持明确的培养环境，并避免在启动分化前额外去除小鼠胚胎成纤维饲养层细胞（MEFs）的步骤。人iPSCs启动分化时的最佳传代次数范围为重编程后的第15代至总计第70代。传代时，使用适当的细胞解离溶液，结合低机械应力操作和2 mL血清学移液管，将hiPSC克隆以细胞团聚体形式从原培养皿转移至新培养皿。避免将细胞解离为单细胞，因为这可能在大多数iPSC系中诱导分化和凋亡。已有报道指出，长期进行单细胞传代可能增加人iPSCs的基因组变异。19,20避免使用需要离心去除消化液的细胞解离步骤，因为这会降低iPSC的总体存活率。定期对所有培养物进行微生物污染检测，尤其是支原体，因为污染可能影响iPSC的质量及其分化能力。
		<ol>
			<li>按照制造商说明，用EHS基质包被60 mm组织培养皿。</li>
			<li>解冻一份1 x 10的等分试样6 人iPSCs。将iPSCs接种于经EHS基质包被并含有5 mL培养基A的60 mm组织培养皿中（参见 材料表每日更换培养基，当细胞融合度达到约80%时，于5至7天后进行传代。 
			注意：使用标准方法（如无酶法解离细胞集落）在细胞融合度达到80%时对解冻后的iPSCs进行传代21在开始分化前，至少执行一次上述操作。简言之，移除iPSC培养基，用预热至37 °C的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）洗涤细胞一次，然后按照试剂A生产商的说明进行孵育（参见材料表）。孵育时间不得超过推荐时长，以避免细胞解离为单细胞。人iPSC应以细胞团簇形式脱落并悬浮，而非单细胞状态。随后可将细胞团转移至新的EHS基质包被培养皿中；例如，一个60 mm培养皿中的iPSC团簇可分配至4个新的60 mm培养皿中。</li>
			<li>使用支原体检测试剂盒，按照制造商说明书检测支原体。仅使用无支原体的iPSCs，因为支原体可能改变iPSCs的分化能力。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将iPSCs（80%汇合度）消化并使用试剂B制备单细胞悬液。
		<ol>
			<li>用预热至37 °C的DMEM/F12培养基洗涤iPSCs一次。</li>
			<li>加入预热的试剂B（例如， 1 mL置于60 mm培养皿中），将iPSCs在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟2.</li>
			<li>用指尖轻弹培养皿的侧面和底部20次，以解离iPSCs。在显微镜下检查细胞是否已解离。</li>
			<li>用1 mL微量移液器在培养皿中将细胞悬液上下吹打5次。</li>
			<li>向1 mL试剂B中加入3 mL培养基A进行稀释，并将细胞悬液收集至15 mL离心管中。</li>
			<li>将iPSCs在室温下以500 × g离心4分钟。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于1 mL B培养基中，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。 
			注意：重悬时仅使用B培养基。避免使用A培养基，因其含有过高浓度的bFGF，可能抑制分化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞悬液稀释至 4.5 x 105 每毫升B培养基中加入10 µM Rho相关蛋白激酶抑制剂（Y-27632）。</li>
		<li>在非黏附性V型底96孔板中，每孔加入100 µL。 
		注意：每次吸取100 µL细胞悬液前，务必振荡试管，确保细胞在悬液中均匀分布。为获得大小和形态均一（圆形、表面清晰）的神经球，保证每孔细胞数量相等至关重要。</li>
		<li>轻轻将含有细胞的培养板在500 × g、室温下离心3分钟，随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育2.</li>
		<li>接下来5天内，每天更换培养基，每孔移除50 µL并加入50 µL新鲜的培养基B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在 EHS 基质中包埋神经球（4 天）
<ol>
	<li>通过混合以下成分制备神经球培养基：DMEM/F12 与 C 培养基按 1:1（v/v）比例混合，补充 1:200（v/v）的添加剂 1，1:100（v/v）不含维生素 A 的添加剂 2，1:100 的 L-谷氨酰胺，0.05 mM 非必需氨基酸（MEM），100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，1.6 g/L 胰岛素，以及 0.05 mM β-巯基乙醇。</li>
	<li>使用经无菌剪刀剪去约 2 mm 的吸头，通过 200 µL 移液器收集神经球。</li>
	<li>将神经球放置在空的 100 mm 培养皿中的石蜡膜（3 × 3 cm2）上，各神经球之间相距约 5 mm，并小心尽可能去除残留的培养基。</li>
	<li>在每个单独的神经球上加入一滴（7 µL）EHS 基质胶。</li>
	<li>将含有神经球的 EHS 基质胶液滴在培养箱中孵育 15 分钟。</li>
	<li>用神经球培养基轻轻冲洗，将神经球从石蜡膜上洗下。冲洗时使用 1 mL 移液器，并将神经球转移至含有 10 mL 神经球培养基的新 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>继续孵育神经球 4 天，并在第 2 天添加 2 mL 新鲜神经球培养基。 
	注意：确保培养箱内的架子保持水平，以防止嵌入 EHS 基质胶的神经球聚集到培养皿的一侧。</li>
</ol>
3. 旋转悬浮培养中的类器官（14 天）
<ol>
	<li>通过混合以下成分制备脑类器官培养基：DMEM/F12 与培养基 C 按 1:1（v/v）比例混合，1:200（v/v）补充剂 1，1:100（v/v）不含维生素 A 的补充剂 2，1:100 L-谷氨酰胺，0.05 mM MEM，100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，1.6 g/L 胰岛素，0.5 µM dorsomorphin，5 µM SB431542，以及 0.05 mM β-巯基乙醇。</li>
	<li>通过旋转瓶的侧臂向每个旋转瓶中加入 100 mL 脑类器官培养基，并将其放入培养箱中预热至少 20 分钟。</li>
	<li>根据制造商说明设置搅拌程序，转速为 25 rpm。 
	注意：在将包埋于 EHS 基质中的神经球转移至旋转瓶之前，确保它们彼此分离。若多个神经球通过 EHS 基质相连，需使用手术刀切断连接的基质以进行分离。</li>
	<li>使用 2 mL 血清移液管小心地将包埋于 EHS 基质中的神经球转移至含有 100 mL 类器官培养基的旋转瓶中。通过旋转瓶的侧臂将神经球导入瓶内。</li>
	<li>将旋转瓶置于培养箱内的磁力搅拌平台上，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养；此为类器官培养的第 0 天。</li>
	<li>每周更换一次培养基（或在培养基颜色发生变化时更频繁更换），移除一半培养基后加入等量的新鲜培养基。 
	注意：从培养箱中取出旋转瓶后，等待 3–5 分钟，使类器官沉降至瓶底。将连接泵的玻璃移液管管尖置于液体表面，通过瓶体一侧的开口/侧臂小心吸除培养基。所有操作必须在超净工作台内进行。</li>
</ol>
4. 脑类器官的分析
<ol>
	<li>类器官的固定
	<ol>
		<li>在旋转烧瓶培养的第14天，使用剪去约5 mm的1 mL移液枪头收集类器官。将所有类器官转移至一个60 mm培养皿中，并用5 mL预热的DMEM/F12培养基洗涤一次，持续3分钟。</li>
		<li>准备一个1.5 mL离心管，加入500 µL预热的4%多聚甲醛（PFA）。 
		注意：操作PFA固定液时需佩戴皮肤和眼部防护装备，并在通风橱中进行。</li>
		<li>将每个类器官单独放入离心管中，在室温下固定至少30分钟。固定时间不得超过60分钟。转移类器官时可使用接种环或其他方便的工具。</li>
		<li>吸除PFA溶液，用1 mL PBS缓冲液洗涤固定后的类器官两次，每次10分钟。</li>
		<li>将类器官保存在1 mL PBS中，置于4 °C冰箱内，最多可保存7天，直至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的包埋用于冷冻切片
	<ol>
		<li>吸除PBS，每管中加入1 mL蒸馏水中含30%蔗糖的溶液，以在冷冻前对类器官进行脱水处理；加入蔗糖溶液后，类器官应漂浮于液面。将类器官在4 °C条件下于蔗糖溶液中过夜孵育；次日，类器官应沉降至管底。 
		注意：如有需要，类器官可在蔗糖溶液中于4 °C保存3-5天。</li>
		<li>取一个乙烯基标本模具，加入400 µL最佳切割温度（OCT）包埋剂，并用接种环将一个类器官置于模具中央。在模具边缘标记样本名称。</li>
		<li>将含有类器官的模具置于-80 °C环境中冷冻，直至进行冷冻切片。</li>
		<li>将玻璃冷冻切片载玻片在PBS中浸泡于0.1%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液中5分钟，室温孵育，随后让载玻片在室温下干燥3小时。将处理后的载玻片保存于4 °C，使用前恢复至室温。 
		注意：PLL包被是关键步骤，可防止类器官切片在后续操作中脱落。收集并保存PLL溶液于4 °C，最多可保存3个月。重复使用前需用0.22 µm滤器过滤，并恢复至室温。</li>
		<li>将冷冻的类器官在PLL包被的玻璃冷冻载玻片上切成20–50 µm厚的切片22。将切片载玻片在室温下干燥1小时。切片可保存于-80 °C，直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 类器官切片的免疫荧光染色
注意：对于类器官的一般表征，建议使用巢蛋白（nestin，一种神经前体细胞标志物）和 TUJ1（一种泛神经元标志物）进行染色。作为额外示例，本文描述了使用磷酸化波形蛋白（phospho-Vimentin, p-Vim，用于标记有丝分裂期的顶端正中胶质细胞）和 Arl13b（用于纤毛）进行免疫荧光染色的方法。为检测细胞凋亡，可采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP缺口末端标记（TUNEL）法。在孵育过程中，应将载玻片置于塑料盒内，以防止灰尘污染、光照以及干燥。
<ol>
	<li>室温下解冻载玻片30分钟。</li>
	<li>用200 µL PBS-甘氨酸溶液（PBS中含0.225 g甘氨酸）洗涤载玻片两次，每次3分钟，以淬灭PFA引起的自发荧光。</li>
	<li>用200 µL含0.5% Triton X100和0.1% tween的PBS溶液在室温下对切片透化处理10分钟。</li>
	<li>用 200 µL PBS-甘氨酸溶液洗涤两次，每次 3 分钟。</li>
	<li>在室温下孵育1小时，或在4 °C过夜，使用200 µL含0.5%鱼明胶/0.1% Triton X-100的PBS溶液，以阻断非特异性抗原结合。 
	注意：如果需要进行TUNEL检测，请按照制造商提供的说明书操作。应在进行免疫染色之前先完成TUNEL检测，因为后续使用该检测可能干扰二抗并淬灭荧光团。</li>
	<li>将抗体用封闭液按以下浓度稀释：nestin 1:200；p-Vim 1:500；TUJ1 1:200；Arl13b 1:20；二抗 1:1,000。</li>
	<li>加入200 µL第一种一抗，孵育例如， nestin）在室温下孵育1-2小时，或在4°C下过夜。</li>
	<li>用200 µL封闭液洗涤3次，每次3分钟。</li>
	<li>将第一种二抗（anti-mouse 488）用封闭液按1:1,000稀释，取200 µL加入载玻片，室温孵育1–2小时。此后操作需始终避光。</li>
	<li>用200 µL封闭液洗涤3次，每次3分钟。</li>
	<li>加入200 µL的下一种一抗，孵育例如， TUJ1）在室温下孵育1-2小时，或在4°C下过夜。</li>
	<li>用200 µL封闭液洗涤3次，每次3分钟。</li>
	<li>加入200 µL的下一种二抗（anti-rabbit 647），室温孵育1–2小时。</li>
	<li>用200 µL封闭液洗涤3次，每次3分钟。</li>
	<li>在室温下，加入200 µL浓度为30 nM的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）PBS溶液，孵育15分钟，进行细胞核染色。</li>
	<li>用200 µL封闭液洗涤2次，每次3分钟。</li>
	<li>用200 µL蒸馏水洗涤1次，每次1分钟，然后让切片干燥10–20分钟，直至肉眼不可见明显水滴为止。</li>
	<li>用封片剂封片，置于4 °C避光保存，可存放数周。</li>
	<li>继续进行显微分析，以成像类器官、室管膜区、原始皮质板及其他感兴趣区域的整体概览。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜，配备63倍油镜物镜和荧光滤光片，滤光片根据所用荧光染料标记的二抗进行选择1,10.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

小头畸形症是一种复杂的人类神经发育障碍，无法在动物模型中重现 体内 或在简单的人类细胞培养方法中 体外MCPH 的临床表现在妊娠第一孕期即开始显现，此时早期神经发生启动。因此，三维脑类器官是模拟 MCPH 发育过程的可靠实验体系。此外，三维人脑类器官是一种理想的研究方法，因为：i）可适应具有不同遗传背景的多种患者样本；ii）能够形成包含多种神经细胞类型的组织结构；更重要的是，iii）可呈现神经发育过程中多个分化阶段的特征 体外 方法与它们相关联的 体内 对应物25,26,27. 例如，神经玫瑰花结是与发育中的神经管相对应的结构。
兰开斯特 等 与对照组iPSCs相比，使用了两倍数量的患者iPSCs才能成功生成患者类器官。值得注意的是，通过改进现有方法并采用本方案所述流程，我们能够从相同数量的...

由于人类大脑具有扩展的皮层表面，这一特征不同于非人类动物，因此诸如小头症等人类神经发育障碍在动物模型中难以得到充分研究。
这一特点使得人类大脑发育成为一个复杂的过程，无法在二维条件下得到充分研究， 体外 细胞培养系统。新兴的3D培养技术能够利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成类似组织的类器官。 体外 多能干细胞在三维悬浮培养中的分化能够以时间和区域特异性的方式形成多种细胞类型，进而发育为结构有序、分层的组织1,2,3感谢那些率先开发三维培养技术并揭示了从干细胞出发的器官形成复杂性的实验室，我们由此建立了一种可靠的方法来生成脑类器官，以阐明人类大脑发育的早期事件，并建立小头畸形的模型 体外1,2,3值得注意的是，我们对 Lancaster 开发的原始方法进行了改进 等 生成脑类器官1该方法根据我们的实验需求进行了修改。
Gabriel 等 的一项研究旨在分析脑发育过程中神经干细胞维持的细胞与分子机制。为此，研究人员通过分析来自小头症患者诱导的三维脑类器官中的神经前体细胞（NPCs），开展了一项机制性研究4。该患者携带CPAP基因的突变，CPAP是一种保守的中心体蛋白，对中心体的生成至关重要5。目前广泛接受的假说是，小头症是由于NPC池的耗竭所致，这种耗竭可能由细胞死亡或过早分化引起1,6,7,8,9。
通过分析小头症脑类器官的室管膜区（VZs），研究发现大量神经前体细胞（NPCs）进行不对称细胞分裂，而健康供体来源的脑类器官则无此现象4。对小头症脑类器官进行广泛的显微观察和生化分析，揭示了CPAP在纤毛及时解聚过程中此前未被认识到的作用4。具体而言，突变型CPAP与纤毛解聚延迟及细胞周期再进入延迟相关，导致神经前体细胞过早分化4。这些结果提示纤毛在小头症中的作用，以及其在神经发生和脑大小调控过程中的参与10。
本方案的第一部分描述了一种三步法，用于生成均一的大脑类器官。如前所述，我们对原始的Lancaster方案进行了调整和修改，以适应我们的研究目的1。首先，将人iPSCs在Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质上进行定义明确的无饲养层条件培养。该步骤避免了依赖饲养层的多能干细胞培养中可能出现的变异。在本方案中，神经分化诱导形成神经上皮直接从iPSCs开始。通过跳过拟胚体（EB）形成步骤，神经分化过程得以更加可控和定向地进行。该方法限制了中胚层和内胚层等其他胚层的自发性和非定向形成。采用本方案后，可在第5天收获含有神经玫瑰花环结构的神经球，用于EHS基质包埋及静置悬浮培养。在本方案第三步所使用的类器官培养基中添加了dorsomorphin和SB431542。Dorsomorphin是一种骨形态发生蛋白（BMP）的小分子抑制剂，SB431542则抑制TGFβ/activin/nodal信号通路。与单独使用视黄酸相比，这两种因子的联合使用可更有效地促进神经分化11,12,13,14。
总体而言，这些改进能够实现脑类器官的可重复生成，且类器官之间的变异极小。尤为重要的是，该方法已成功应用于从携带影响中心体和细胞周期动态相关基因突变的患者iPSCs中稳定地生成小头症脑类器官。
本方案的第二部分提供了制备脑类器官以分析和解读小头症中细胞缺陷的操作说明，包括固定、冷冻切片、免疫荧光染色以及共聚焦显微镜分析。本方案将为读者提供对预期结果的详细描述以及相应的解读指导。

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B 兔多克隆抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；多个供应商</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>化合物 C；多个供应商</td></tr><tr><td>包埋介质</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol；包埋介质；多个供应商</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC 认证基质；重要：必须为 hESC 认证级别</td></tr><tr><td>鱼明胶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>来自冷水鱼皮的明胶；多个供应商；加入 PBS 后高压灭菌以溶解并灭菌，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>分子生物学级甘氨酸；多个供应商&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一次性接种环带针（1 &amp;micro;L）</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>多个供应商&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td></tr><tr><td>培养基 A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1（hiPSC 培养基）</td></tr><tr><td>培养基 B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>神经诱导培养基（NIM）；神经分化培养基</td></tr><tr><td>培养基 C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>神经基础培养基</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓缩）</td></tr><tr><td>MycoAlert 支原体检测试剂盒</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>支原体检测试剂盒；多个供应商</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin 小鼠单克隆抗体（4D11）</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>PBS 中 4%，溶液保存于 -20 &amp;deg;C；注意：佩戴皮肤和眼部防护装备，并在通风橱中操作&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>参见制造商&amp;acute;说明；多个供应商</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（PLL）</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>磷酸化波形蛋白（Ser55）单克隆抗体</td></tr><tr><td>试剂 A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>参见方案 1.1.1.2 注释；ReLSR（无酶人 ES 和 iPS 细胞筛选与传代试剂）；请遵循制造商&amp;acute;操作说明；多个供应商提供替代产品</td></tr><tr><td>试剂 B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase 溶液是一种用于单细胞解离的酶解溶液；多个供应商；方案 1.1.2 中的“酶解细胞解离溶液”&quot;&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica CM3050 S 研究型冷冻切片机</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>250 mL 摇瓶</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>Superfrost 超级加号载玻片</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>载玻片应标有“&quot;+&quot;”符号且为正电荷</td></tr><tr><td>添加剂 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 添加剂（100 倍浓缩）</td></tr><tr><td>添加剂 2（不含维生素 A）</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 添加剂（50 倍浓缩），不含维生素 A；多个供应商</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-微管蛋白 III（兔多克隆）</td></tr><tr><td>TUNEL 检测试剂盒</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd 荧光 TUNEL 检测系统；多个供应商</td></tr><tr><td>分子生物学级 Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>多个供应商</td></tr><tr><td>防水膜</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;；多个供应商</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK 抑制剂（Y-27632 2HCL）；多个供应商</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-巯基乙醇（50 mM）；多个供应商</td></tr></tbody></table>

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

合适材料的可获得性受限 体外 能够可靠地模拟复杂人类大脑发育的模型是制约基础脑科学研究向临床应用转化的一个重要瓶颈。尽管诱导性多能干细胞（iPSCs）已取代存在伦理争议的人类胚胎干细胞，但基于iPSC的神经元分化研究仍主要停留在细胞水平的描述性阶段，未能充分提供源自复杂三维人类脑组织的详细信息。 
如今，通过应用源自诱导多能干细胞（iPSC）的三维脑类器官——“培养皿中的大脑”——填补了这一空白，这类模型能够模拟复杂人类大脑发育的多种特征。本文介绍了一种生成源自诱导多能干细胞的三维脑类器官的方法。这些类器官有助于建模常染色体隐性原发性小头畸形（MCPH），这是一种罕见的人类神经发育障碍疾病。目前广泛接受的关于MCPH患者脑部畸形的解释是，在人类大脑发育早期阶段神经干细胞池耗竭所致，而这一发育缺陷在体外极难重现或证实in vitro。
为了研究小头畸形症（MCPH），我们利用携带中心体蛋白CPAP基因突变的患者成纤维细胞生成了诱导多能干细胞（iPSCs）。通过分析小头畸形3D脑类器官的脑室区，我们揭示了神经前体细胞的过早分化。这些3D脑类器官是一种强大的体外（in vitro）研究系统，在模拟由神经毒性化学物质、神经营养性病毒感染或遗传性基因突变引起的先天性脑部疾病方面将发挥关键作用。

脑类器官的生成需要至少三周的连续培养（图1A）。为了获得可重复的结果，我们建议研究人员记录每一步操作，并且重要的是，避免对培养基成分、时间节点和细胞操作进行任何改动。在此，我们概述了如何评估关键里程碑是否达成，以确保在实验结束时获得足够质量的类器官。在96孔板中神经球的形成应从第4天起清晰可见。神经球可被识别为每个孔底部界限清晰的球状结构（图1B，步骤1）。
第5天时，神经球的直径应约为500 µm，表面光滑，具有围绕暗色中心的明亮边缘。在此明亮边缘内可能已可观察到类似神经玫瑰花环样的延伸结构（图1C，步骤2的起始阶段）。如果神经球发生解体或更类似于细胞团块，则不应继续进行分化。最后，在旋转烧瓶中的分化过程中，类器官应逐渐增大并表现出相似的大小（图1D，步骤3）。更多信息请参见故障排除表（Table 1...

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。

适合用于可靠模拟复杂人类大脑发育的体外模型可及性有限，是一个重要的瓶颈……

本方案旨在生成由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的人脑类器官，其总体目标是模拟早期人类神经发育障碍。该方法有助于解答人类大脑发育领域中的一些关键问题，例如合成体和纤毛在新型神经发生及原发性小头症中的作用。该技术的主要优势在于，它是一种稳健且快速的模型，能够从患者来源的iPSC衍生脑类器官中获得可重复的实验结果。本实验操作将由我位于科隆分子医学中心实验室的博士后研究员 Elke Gabriel 演示。开始该操作时，使用经无菌剪刀剪切过的2毫米移液器吸头，用200 µL 微量移液器收集神经球。接着，将神经球以彼此相距约5 mL 的距离放置于100 mm 培养皿中的石蜡膜上。小心吸除尽可能多的残留培养基。然后，在每个单个神经球上加入一滴EHS基质。将含有神经球的EHS基质液滴于37摄氏度孵育15分钟。随后，用神经球培养基冲洗石蜡膜，小心地将神经球清洗下来。接着，将神经球继续培养四天，并在第二天添加 2 毫米新鲜的神经球培养基。在此步骤中，通过旋转烧瓶的侧臂，向每个烧瓶中加入 100 毫升脑类器官培养基。将培养基置于37摄氏度培养箱中预热至少20分钟。然后确保神经球均已分离。若两个或多个神经球通过EHS基质相连，需用手术刀切断连接的基质以分离神经球。设置搅拌程序为 25 RPM。小心地将含有 EHS 基质的神经球转移至含有 100 毫升类器官培养基的旋转烧瓶中。随后，将旋转烧瓶置于培养箱内的磁力搅拌平台上，于 37 摄氏度下培养 14 天。这是类器官培养的第0天。每周更换一次培养基，移除一半培养基后加入等量的新鲜培养基。在此步骤中，于第14天使用预先切口的1毫升微量移液器从旋转培养瓶中收集类器官。将所有类器官放入一个60毫米培养皿中，用5毫升预热的DMEM/F12培养基洗涤一次，持续3分钟。随后，准备一个1.5毫升离心管，加入500微升预热的4% PFA固定液。将每个类器官分别放入不同的离心管中，在室温下固定30至60分钟。随后，使用接种环取出类器官。然后，去除PFA，并用一毫升PBS将固定的类器官清洗两次，每次10分钟。之后，将类器官置于一毫升PBS中，于4摄氏度保存，可保存至多7天，以备后续使用。为了包埋类器官以进行冷冻切片，移除 PBS，并在每个试管中加入 1 毫升 30%蔗糖溶液，以在冷冻前脱水类器官。加入蔗糖溶液后，类器官应漂浮在液面。将类器官在 4°C 的蔗糖溶液中过夜孵育。第二天，类器官应已沉降至管底。随后，用 400 毫升 OCT 包埋剂填充乙烯基标本模具，并使用接种环将一个类器官置于模具中央。用样本名称标记模具边缘。然后将含有类器官的模具在负80摄氏度下冷冻，直至进行冷冻切片。随后，在室温下用0.1% PLL和PBS对玻璃冷冻载片进行五分钟的包被处理。然后，将切片干燥三小时。将切片于 4 摄氏度保存，并在使用前恢复至室温。随后，将冷冻的类器官在 PLL 包被的玻璃冷冻切片上切为 20 至 50 微米厚的切片。将切片在室温下干燥一小时，并将切片保存在负80摄氏度直至进一步处理。冷冻切片类器官的免疫荧光成像，显示典型的室管膜区（VZ）和原始皮质板。VZ从顶端延伸至基底端。请注意，脑室区（VZ）内的细胞核呈栅栏状排列，提示这些细胞为放射状胶质细胞。右侧面板显示了脑室区内巢蛋白阳性神经前体细胞（NPCs）的免疫荧光染色，以及原始皮质板中TUJ1阳性神经元的染色。此处展示了两例分别用PVIM和ARL13B染色的脑室区（VZ）示例。白色方框标记的区域已放大。位于室管膜区（VZ）顶端侧面分裂的顶端放射状胶质细胞呈PVIM阳性。该细胞处于分裂后期，其分裂面与由ARL 13B染色标记的管腔表面线呈水平方向。一旦掌握，该技术若操作得当，可在23天内完成。在实施该过程时，重要的是要记住定期对培养物进行质量检查和微等离子体检查。该技术建立后，为神经生物学发育领域研究人员探索人脑类器官神经发育机制铺平了道路。观看本视频后，您应能充分了解如何利用不同的人诱导多能干细胞系（包括具有细胞功能缺陷的患者细胞系）生成人脑类器官。

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

源自iPSC的人脑组织体的一代新型早期神经发育障碍

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

一种体外生成人脑类器官的方法

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

我们描述了一种详细的人诱导性多能干细胞来源的脑类器官的生成方案，及其在模拟线粒体疾病中的应用。...

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。...

衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

增殖、迁移和神经突生长等神经发育过程在神经精神疾病中常受到干扰。因此，我们提供了快速且可重复地评估人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞（NPCs）中这些神经发育过程的实验方案。这些方案还可用于评估相关生长因子和治疗药物对NPC发育的影响。...

快速检测人类神经前体细胞（NPCs）中的神经发育表型

了解利用iPSC衍生的人脑组织体模拟早期神经发育障碍的方法。该技术通过神经球培养和EHS基质嵌入，为研究小头畸形等疾病的神经发生机制提供可重复的快速模型。

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

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