生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

本方案旨在生成由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的人脑类器官，其总体目标是模拟早期人类神经发育障碍。该方法有助于解答人类大脑发育领域中的一些关键问题，例如合成体和纤毛在新型神经发生及原发性小头症中的作用。该技术的主要优势在于，它是一种稳健且快速的模型，能够从患者来源的iPSC衍生脑类器官中获得可重复的实验结果。

本实验操作将由我位于科隆分子医学中心实验室的博士后研究员 Elke Gabriel 演示。开始该操作时，使用经无菌剪刀剪切过的2毫米移液器吸头，用200 µL 微量移液器收集神经球。接着，将神经球以彼此相距约5 mL 的距离放置于100 mm 培养皿中的石蜡膜上。

小心吸除尽可能多的残留培养基。然后，在每个单个神经球上加入一滴EHS基质。将含有神经球的EHS基质液滴于37摄氏度孵育15分钟。

随后，用神经球培养基冲洗石蜡膜，小心地将神经球清洗下来。接着，将神经球继续培养四天，并在第二天添加 2 毫米新鲜的神经球培养基。在此步骤中，通过旋转烧瓶的侧臂，向每个烧瓶中加入 100 毫升脑类器官培养基。

将培养基置于37摄氏度培养箱中预热至少20分钟。然后确保神经球均已分离。若两个或多个神经球通过EHS基质相连，需用手术刀切断连接的基质以分离神经球。

设置搅拌程序为 25 RPM。小心地将含有 EHS 基质的神经球转移至含有 100 毫升类器官培养基的旋转烧瓶中。随后，将旋转烧瓶置于培养箱内的磁力搅拌平台上，于 37 摄氏度下培养 14 天。

这是类器官培养的第0天。每周更换一次培养基，移除一半培养基后加入等量的新鲜培养基。在此步骤中，于第14天使用预先切口的1毫升微量移液器从旋转培养瓶中收集类器官。

将所有类器官放入一个60毫米培养皿中，用5毫升预热的DMEM/F12培养基洗涤一次，持续3分钟。随后，准备一个1.5毫升离心管，加入500微升预热的4% PFA固定液。将每个类器官分别放入不同的离心管中，在室温下固定30至60分钟。

随后，使用接种环取出类器官。然后，去除PFA，并用一毫升PBS将固定的类器官清洗两次，每次10分钟。之后，将类器官置于一毫升PBS中，于4摄氏度保存，可保存至多7天，以备后续使用。

为了包埋类器官以进行冷冻切片，移除 PBS，并在每个试管中加入 1 毫升 30%蔗糖溶液，以在冷冻前脱水类器官。加入蔗糖溶液后，类器官应漂浮在液面。将类器官在 4°C 的蔗糖溶液中过夜孵育。

第二天，类器官应已沉降至管底。随后，用 400 毫升 OCT 包埋剂填充乙烯基标本模具，并使用接种环将一个类器官置于模具中央。

用样本名称标记模具边缘。然后将含有类器官的模具在负80摄氏度下冷冻，直至进行冷冻切片。随后，在室温下用0.1% PLL和PBS对玻璃冷冻载片进行五分钟的包被处理。

然后，将切片干燥三小时。将切片于 4 摄氏度保存，并在使用前恢复至室温。随后，将冷冻的类器官在 PLL 包被的玻璃冷冻切片上切为 20 至 50 微米厚的切片。

将切片在室温下干燥一小时，并将切片保存在负80摄氏度直至进一步处理。冷冻切片类器官的免疫荧光成像，显示典型的室管膜区（VZ）和原始皮质板。VZ从顶端延伸至基底端。

请注意，脑室区（VZ）内的细胞核呈栅栏状排列，提示这些细胞为放射状胶质细胞。右侧面板显示了脑室区内巢蛋白阳性神经前体细胞（NPCs）的免疫荧光染色，以及原始皮质板中TUJ1阳性神经元的染色。此处展示了两例分别用PVIM和ARL13B染色的脑室区（VZ）示例。

白色方框标记的区域已放大。位于室管膜区（VZ）顶端侧面分裂的顶端放射状胶质细胞呈PVIM阳性。该细胞处于分裂后期，其分裂面与由ARL 13B染色标记的管腔表面线呈水平方向。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在23天内完成。在实施该过程时，重要的是要记住定期对培养物进行质量检查和微等离子体检查。该技术建立后，为神经生物学发育领域研究人员探索人脑类器官神经发育机制铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分了解如何利用不同的人诱导多能干细胞系（包括具有细胞功能缺陷的患者细胞系）生成人脑类器官。