Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

该程序的总体目标是在电刺激中利用受控的三维细胞培养方法，以促进人胚胎和诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的成熟。这种方法可以帮助回答心脏组织工程领域的关键问题，包括不同的电刺激参数或时间长度如何影响心肌细胞功能和成熟状态。最终结果是工程化的人类心脏组织成熟度更高。

该技术的含义延伸到诊断应用，例如测试新药的安全性和有效性，因为具有成熟特性（如电进展）的心肌细胞最有可能在药物筛选研究中用作更准确的人类心肌细胞模型。将 PDMS 单体和固化剂以 10：1 的比例混合并充分混合。静置 5 分钟以脱气。

然后用 PDMS 混合物加载包含 biowire 模板母版的培养皿。尽量减少气泡的形成。接下来，在 70 摄氏度下固化 PDMS 两个小时。

然后首先在边缘周围使用锋利的刀片，然后将其剥离，以恢复凝固的霉菌。然后修剪多余的 PDMS 并将所有模板收集在灭菌袋中。Steam 在 121 摄氏度下自动加热模板 20 分钟。

然后在生物安全柜的通风下将每个模板加载到无菌培养皿中。现在对于每个模板，使用镊子将一根无菌 6.0 丝缝合线安装到横跨整个通道的凹槽中。然后模板即可用于细胞接种。

缝合线将作为形成 3D 结构的模板，这些结构沿缝合轴对齐，模仿心脏纤维的形状。对于每个腔室，制作一对矩形聚碳酸酯件作为电刺激室的框架。沿着每件作品的中心线，钻两个 3 毫米宽的孔，相距 2 厘米。

对于每个腔室，准备两根 1.5 厘米长的碳棒。在距每根杆末端约 3 毫米处钻一个 1 毫米宽的孔。然后用铂丝拧入每个孔，并将金属丝的一端缠绕在杆上。

接下来，对于每个腔室，在两个聚碳酸酯片之间插入两根杆，形成一个框架。然后将约 2 毫升 PDMS 倒入六孔板的孔中，并将框架放入装有 PDMS 的孔中，浸没框架底部。将 PDMS 在 70 摄氏度下固化 2 小时，以便 PDMS 固定框架。

然后从板上取下连接了 PDMS 的腔室。要测试组装室的功能，请将铂线连接到电池，并使用电压表检查电流是否通过棒。现在将功能室转移到灭菌袋中，并在 121 摄氏度下使用 20 分钟的蒸汽灭菌，为细胞培养做好准备。

制备凝胶时，将所有凝胶组分在冰上预冷，然后再将它们混合到无菌管中。确保最后添加胶原蛋白和细胞外基质，并使用移液混合成分。因为这些细胞具有从人多能干细胞分化而来的心肌细胞。

收集细胞，并为每个 biowire 制备植物准备 3.5 微升含有五十万个细胞的胶原蛋白凝胶。现在使用 P10 移液器吸头将大约 4 毫升的悬浮液加载到每个培养皿中 0.5 厘米长的通道模板中。根据需要使用无菌镊子调整缝合线的位置，使其完全拉伸。

接种细胞后，确保在进行高压灭菌之前始终重悬凝胶细胞混合物，以获得一致的结果。加载通道后，用无菌 PBS 覆盖培养皿底部，确保不要接触凝胶。这将确保生物线在聚合过程中不会脱水。

在 37 摄氏度下孵育生物线 30 分钟后，用足够的培养基替换 PBS 以覆盖细胞。12 毫升通常就足够了。然后将培养皿培养一周，每隔一天更换一次培养基。

在生物安全柜中，将 2 毫升 PBS 添加到一个六孔板的每个孔中，该板将容纳一个电刺激器室。然后使用无菌镊子轻轻地将高压灭菌装置放入孔中。就位后，丢弃 PBS 并用 5 毫升温热培养基代替，该培养基应完全覆盖碳棒。

在培养细胞 24 小时之前，观察心肌细胞对电刺激的收缩力，以确保细胞捕获电刺激并响应收缩。接下来，将生物线放入电刺激器室中，并将通道垂直于碳棒。将铂丝从板中伸出，然后盖住板。

将电线连接到电刺激器。将刺激器设置为以 1 赫兹和 3 伏/厘米的速度提供双相 1 毫秒脉冲。然后将电刺激器中的制剂转移到 37 摄氏度的培养箱中。

24 小时逐渐提高刺激率，从第 0 天的 1 赫兹增加到第 6 天的 6 赫兹。在这一周的培养期间，每隔一天更换一次培养基。并每天观察心肌细胞的收缩力。

在 biowire 细胞中预培养 7 天后，在缝合线周围重塑凝胶。细胞沿缝合线轴组装形成对齐的心脏组织。表达心脏收缩蛋白的细胞在收缩器中显示肌节带，其肌原纤维沿缝合轴对齐。

生物线中的细胞表现出比拟胚体中的细胞更低的增殖速率。在 biowires 中培养的心肌细胞中的钙处理得到显着改善。咖啡因治疗诱导钙从骶浆网中突然释放。

这种瞬变仅在受刺激的细胞中发现。根据钙释放幅度，刺激频率也显着升高。此外，与在拟胚体中培养相比，在生物线中培养的心肌细胞显示出更高的 hERG 和向内整流器电流密度，而拟胚体则进一步增强了电刺激。

改进的内向整流电流与钾内向整流通道 jean KCN J2 的表达增加一致。与受控生物线相比，自发跳动能力在胚状体衍生的心肌细胞中显着更高。对照显示出与接受 6 赫兹方案的 biowire 制备相当的自动性。一旦掌握了生物线的设置，就可以在半天内完成。

电刺激的设置需要几个小时，两周内即可获得最终结果。在尝试此程序时，重要的是要记住，从不同细胞系或通过不同方案分化的心肌细胞的成熟度和纯度可能略有不同。因此，可能需要优化实验参数，例如对细胞的刺激率。

按照此程序，可以优化其他条件，包括细胞组成的变化和突变心肌细胞的利用，以回答一系列其他问题。