Name: 使用电刺激人干细胞衍生的心肌细胞的成熟中Biowires (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 了解利用三维细胞培养与电刺激促进人胚胎干细胞及诱导多能干细胞衍生心肌细胞成熟的Biowires技术。该方法可构建功能更成熟的心脏组织模型，用于药物安全性与有效性筛选研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了加拿大心脏与中风基金会资助（G-14-0006265）、加拿大卫生研究院运营基金（137352 和 143066）以及 J.P. Bickell 基金会资助（1013821）的支持，资助对象为 SSN。

1. 主控设计与制备
注意：使用软光刻技术进行器件制备。制作双层 SU-8 模具用于聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制成型。
<ol>
	<li>使用设计与制图软件设计该装置（图1A，左侧）。分别绘制母版的每一层。以20,000 dpi将器件设计分别打印到两张光刻掩模上，对应母版的两层。15将器件图案设置为透明，周围区域设置为暗色；这些掩模将作为模板，通过光刻技术将器件图案光学转移至SU-8上（方法如他人所述）15).</li>
	<li>在4英寸硅片中心滴加约4 mL SU-8 50。使用匀胶机以2,000转/分钟（RPM）匀速旋转30秒，使SU-8 50在硅片表面均匀涂覆。将硅片置于95 °C热板上烘烤10分钟。用200 mJ/cm²的紫外（UV）光照射硅片2.</li>
	<li>在晶圆中心倒入约 4 mL SU-8 2050，以 2,500 RPM 旋涂 30 秒。在 95 °C 热板上烘烤 15 分钟。冷却至室温（RT）。</li>
	<li>重复步骤1.3两次。</li>
	<li>将涂覆好的晶圆覆盖第一层透明光刻掩模，用270 mJ/cm²的紫外光照射晶圆2 制作第一层。在95 °C的加热板上烘烤15分钟。</li>
	<li>通过重复步骤1.3两次，制备第二层SU-8 2050。</li>
	<li>使用掩模对准器将第二层掩模与第一层的图形对准。然后在240 mJ/cm²的紫外光下曝光。在95 °C下烘烤15分钟。 
	注意：曝光时间由所需的总紫外剂量和使用前一天测得的紫外光输出强度决定。</li>
	<li>将晶圆浸入丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）中，在轨道摇床中以200转/分钟的速度振荡30分钟以进行显影。</li>
	<li>将模具放入培养皿中，小心地将PDMS混合物（基础剂与交联剂按10:1的质量比混合）倒在晶片中央，确保完全覆盖所有结构特征，并避免产生气泡。</li>
	<li>在 70 °C 烤箱中加热 2 小时。使用锋利刀片沿 PDMS 生物导线模板边缘切割图1A， 右侧）。将PDMS从模具上剥离，用刀片修整器件。将PDMS生物线模板放入灭菌袋中，于121 °C高压蒸汽灭菌20分钟。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中，将PDMS生物微线模板放入培养皿内。使用镊子夹持一段无菌外科缝合丝线（6-0），将其置于PDMS微孔通道的中央，并将其两端嵌入通道末端的凹槽中以固定图1B-I).</li>
</ol>
2. 电刺激室的构建
<ol>
	<li>制作一对矩形聚碳酸酯片（长 × 宽 × 厚：2 cm × 0.85 cm × 0.35 cm），用作电刺激室的框架（图2）。</li>
	<li>沿每片聚碳酸酯框架的中心线钻两个直径为3 mm的孔，两孔间距为2 cm。</li>
	<li>截取两段长度为1.5 cm的碳棒。在距碳棒一端约3 mm处钻一个直径为1 mm的孔，将铂丝穿过该孔，并通过将铂丝缠绕在碳棒上将其固定。在铂丝的另一端连接一个夹子，以便后续与电刺激器连接。</li>
	<li>将碳棒插入聚碳酸酯框架中。将装配好的带碳棒的框架放入六孔板的一个孔中。</li>
	<li>向孔中加入2 mL PDMS。使聚碳酸酯框架的底部浸入PDMS中，同时保持PDMS液面接近但不达到碳棒底部。在70 °C烘箱中加热2小时。</li>
	<li>将电刺激室从六孔板中取出，放入灭菌袋中，在121 °C下进行蒸汽灭菌20分钟。</li>
</ol>
3. hPSC-CMs 的酶解离
<ol>
	<li>使用已建立的方案诱导人多能干细胞（hPSC）向心肌细胞分化4。 
	注意：简而言之，通过在干细胞培养基中依次添加骨形态发生蛋白4（BMP4）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、激活素A（activin A）、血管内皮生长因子（VEGF）和Dickkopf同源物1（DKK1），采用已建立的拟胚体（EB）方案生成心肌细胞4。使用分化第20至34天的拟胚体制备生物导线（biowires）。</li>
	<li>用P1,000移液器吸头从低吸附培养板中收集拟胚体，并转移至锥形管中。在室温下以125 × g离心5分钟，形成沉淀。弃去上清液，用预热至37 °C、含1%脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）的胶原酶I重悬沉淀。于37 °C孵育2小时进行消化。</li>
	<li>加入5 mL预热至37 °C的洗涤液，以125 × g在室温下离心5分钟。弃去上清液。用2 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液重悬沉淀，于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入1 mL含3%（v/v）DNAse I的终止液。</li>
	<li>将20 G（0.9 mm）针头连接至5 mL注射器，将拟胚体悬液通过针头推注3–5次。</li>
	<li>加入7 mL洗涤液，以280 × g离心5分钟。弃去上清液。用Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）重悬沉淀，并置于冰上保存。使用血细胞计数板测定细胞数量。取0.5 × 106个细胞，以280 × g离心5分钟形成沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>在无菌离心管中混合所有凝胶组分前，先将各组分置于冰上预冷。混合以下胶原凝胶组分（终浓度）：2.1 mg/mL大鼠尾部I型胶原蛋白、24.9 mM葡萄糖、23.8 mM NaHCO3、14.3 mM NaOH、10 mM HEPES，以及10%细胞外基质（ECM），溶于1× M199培养基中。最后加入胶原蛋白和细胞外基质，通过反复吹打混匀。</li>
	<li>用3.5 µL胶原凝胶重悬0.5 × 106个细胞，并充分混匀。</li>
	<li>使用P10移液器吸头将4 µL细胞悬液加入0.5 cm长的微通道中（图1B-II）。如有必要，用无菌镊子调整缝合线的位置。</li>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖培养皿底部，注意不要触碰凝胶。于37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>将PBS更换为12 mL培养基（例如，stem pro或细胞生产商推荐的培养基），用量以覆盖细胞为宜（图1B-III）。在37 °C培养箱中培养1周，每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
4. 生物导线培养的电刺激
<ol>
	<li>在生物安全柜中，向六孔板的每个孔中加入 2 mL PBS，该六孔板将用于放置电刺激装置室。使用无菌镊子轻轻将已灭菌的电刺激装置放入孔中，随后弃去孔内的 PBS。</li>
	<li>用 5 mL 预热的培养基覆盖碳棒。使用无菌镊子将生物导线安装到电刺激室中，并使其垂直于碳棒方向放置（图 2）。</li>
	<li>将六孔板盖盖上，但需留出足够的铂丝延伸至板外，以便连接电刺激仪。将六孔板置于 37 °C 细胞培养孵箱中，并将铂丝连接至电刺激仪。</li>
	<li>使用电刺激仪对生物导线进行刺激，设置参数如下：双相重复脉冲，脉冲持续时间 1 ms，电场强度 3 V/cm，频率为每秒 1 次脉冲（PPS）。每 24 小时逐步提高 PPS 至以下数值：1.83、2.66、3.49、4.82、5.15 和 6。每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>在显微镜下以 10 倍物镜观察心肌细胞在电刺激下的收缩活性。 
	注意：刺激一周后，生物导线将趋于成熟（见结果部分）。</li>
</ol>

<ol><li>Sun, X., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+hydrogel-based+strategies+for+application+in+cardiac+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration.</a> Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).</li>
<li>Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+of+engineered+tissues+and+their+application+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).</li>
<li>Hastings, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+cell+delivery+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug and cell delivery for cardiac regeneration.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Dolnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+intracellular+Ca2%2B+handling+and+the+role+of+sarcoplasmic+reticulum+in+the+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction.</a> Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+differentiated+cardiac+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct.</a> Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assembly+of+engineered+myocardium+by+electrical+stimulation+of+cardiac+myocytes+cultured+on+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Lake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/4049">Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li>
<li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications for human pluripotent stem cells.</a> Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+correlate+with+cell+density+and+cell+viability+in+engineered+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue.</a> Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文描述了工程化平台“生物导线”（biowire）的构建与实施方法，旨在促进人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的成熟。该装置可在标准微加工设施中制备，生物导线的制备可结合常规细胞培养技术与电刺激仪完成。
据我们所知，目前尚无与生物导线（biowires）类似的方法被报道。该策略表明，心肌细胞成熟度的提升依赖于电刺激方案，这一点在采用较高刺激频率递增方案（6 Hz 对比 3 Hz）的生物导线中观察到更高的成熟水平得到了证实。与培养20天（EBd20）或40至44天（EBd44）的拟胚体（EBs）相比，生物导线中的心肌细胞表现出更低的自律性以及更高的hERG电流和IK1。EBd20心肌细胞代表了细胞在整合入生物导线前的特性，而EBd44心肌细胞的培养时间比生物导线培养时间长10天，这表明即使以拟胚体形式延长培养时间，心肌细胞也无法达到生物导线中通过电刺激所诱导的成熟程度。然而，通过生物导线获得的心肌细胞仍不及成年心肌细胞成熟。
有研究表明，机械刺激可有效诱导人多能干细胞来源的心肌细...

基于细胞的治疗是实现心脏修复/再生最有前景且研究最广泛的战略之一。该策略得到了心脏组织工程以及生物材料共递送技术的支持1,2。目前大多数可用的细胞来源已在动物模型中被研究，以评估其对受损、患病或衰老心脏可能产生的有益作用3。特别是，研究人员已投入大量努力，致力于将人多能干细胞（hPSC）来源的心肌细胞（hPSC-CM）应用于心脏组织工程，因其是一种潜在的无限自体细胞来源。hPSC-CM可通过多种已建立的方案进行制备4,5,6。然而，所获得的细胞表现出类似胎儿的表型，与成人心室心肌细胞相比具有一系列未成熟的特征7,8。这可能阻碍hPSC-CM在药物发现研究中作为成人心脏组织模型，以及在成人心脏疾病模型构建中的应用9。
为了克服心肌细胞表型不成熟这一局限性，研究人员已积极探究多种新方法以促进心肌细胞的成熟。早期研究表明，周期性机械10或电刺激11可有效促进新生大鼠心肌细胞的成熟。凝胶收缩和周期性机械刺激也被证明可在一定程度上改善人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的成熟度12,13，但对电生理特性和钙处理能力的提升作用有限。因此，研究人员开发了一种名为&#34;生物导线&#34;（biowire）的平台系统，通过提供结构引导和电场刺激来增强hPSC-CMs的成熟度14。该系统利用微加工平台构建排列有序的心肌组织，并可施加电场刺激，从而改善hPSC-CMs的结构和电生理成熟度。本文将详细描述此类生物导线的制备方法。

<table><tbody><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM 培养基成分</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>设计设备的软件</td></tr><tr><td>碳棒， &amp;Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>电刺激器腔室组件</td></tr><tr><td>I型胶原，大鼠尾部</td><td>BD 生物科学</td><td>354249</td><td>胶原凝胶：2.1 mg/mL 大鼠尾部I型胶原，溶于24.9 mM葡萄糖、23.8 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;14.3 mM NaOH，10 mM HEPES，溶于含10%生长因子减少型Matrigel的1x M199培养基中。</td></tr><tr><td>I型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>PBS（含Ca）中含0.2% I型胶原酶（w/v）和20%胎牛血清（v/v）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. 使用 0.22 微米滤器除菌 &amp;mu;m 滤膜过滤并分装为 12 mL 等份。于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>配制1 mg/mL DNase I储存液于水中。过滤除菌后，分装为0.5 mL每份，于－20°C保存 &amp;minus;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>钻孔 &amp;和钻头（&amp;Oslash; 1 mm 和 2 mm</td><td>Dremel</td><td></td><td>在聚碳酸酯框架上钻孔</td></tr><tr><td>电刺激器</td><td>草</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>WISENT 公司</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&amp;Omega;&amp;middot;cm 在 25 &amp;deg;C，超纯，用于配制所有溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>加热板</td><td>托里松树</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>EVG&amp;nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>基质胶，生长因子减量型&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>354230</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>Medium 199 (M199)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11825015</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>单硫代甘油（MTG）</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM 培养基成分</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（P/S）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>含钙磷酸盐缓冲液（PBS）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>康宁</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板，低吸附</td><td>康宁</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>铂丝，0.2 mm</td><td></td><td></td><td>电刺激器腔室组件</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）</td><td>Doe &amp;amp; Ingalls 公司</td><td></td><td>开发晶圆</td></tr><tr><td>袋装，可剥离开启</td><td>转换器</td><td>92308</td><td>用于蒸汽灭菌</td></tr><tr><td>硅晶圆，4 英寸</td><td>UniversityWafer 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>胶原凝胶组分</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM 培养基。配制 50 mL 时，加入 1.3 mL 添加剂、500 &amp;mu;100 L&amp;times; L-谷氨酰胺，250 &amp;mu;30 mg/mL 转铁蛋白的 L，500 &amp;mu;5 mg/mL 抗坏血酸溶液，150 μL &amp;mu;26 升 &amp;mu;l/2 mL 巯基甘油（MTG），以及 500 &amp;mu;L (1%) 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>停止培养基</td><td></td><td></td><td>洗涤液：FBS（1:1）</td></tr><tr><td>SU-8 50&amp;nbsp;</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td>光刻胶，母版组件</td></tr><tr><td>SU-8 2050&amp;nbsp;</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td>光刻胶，母版组件</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>罗氏</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM 培养基成分</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM 培养基成分</td></tr><tr><td>洗涤液</td><td></td><td></td><td>含1%青霉素/链霉素的IMDM</td></tr></tbody></table>

利用电刺激在生物导线中促进人干细胞来源心肌细胞的成熟

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

由人多能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CMs）是一种极具前景的细胞来源，已推动其在心脏研究领域潜在应用的广泛探索，包括药物发现、疾病建模、组织工程和再生医学。然而，现有方案所产生的细胞与天然的成年心室心肌细胞相比，表现出不同程度的不成熟状态。尽管已开展大量促进hPSC-CMs成熟化的研究，但迄今为止所实现的成熟程度仍较为有限。因此，研究人员开发了一种名为“生物导线”（biowire）的工程化系统，通过提供物理和电学双重刺激，以促进hPSC-CMs在体外向更成熟的状态发展。该系统利用微加工平台，将hPSC-CMs接种于I型胶原凝胶中，并沿刚性缝合模板排列，从而组装成取向一致的心肌组织（即生物导线），随后对其进行频率逐步递增的电场刺激。与未受刺激的对照组相比，接受电刺激的生物导线心肌细胞在结构和电生理特性方面均表现出更显著的成熟化特征，且此类变化依赖于刺激频率。本文详细描述了生物导线系统的设计与构建过程。

在生物导线中使用缝合线的原理是作为三维结构形成的模板，使细胞沿单一轴向排列，并模拟心肌纤维的形态。我们发现，在生物导线中培养7天后，细胞重塑了缝合线周围的凝胶（图3A）。细胞沿缝合线轴向组装，形成有序排列的心肌组织（图3）。经过7天的预培养后，生物导线接受了为期7天的电场刺激，进一步表现出与心肌细胞结构和功能成熟相一致的特性。
在生物导线中培养的人多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs）表现出心脏收缩蛋白、肌节α-肌动蛋白和肌动蛋白的强烈表达（图4A）。我们观察到人PSC-CMs收缩装置呈现肌节条带结构，并且肌原纤维结构沿缝合线轴向排列，这种结构定性上类似于成人心脏组织（图4A）。其次，与拟胚体（EBs）来源的细胞相比，这些生物导线培养的hESC-CMs增殖率较低（图4B）。第三，生...

心脏类导线平台是一种 体外 通过结合三维细胞培养与电刺激，用于促进人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）成熟的实验方法。本文详细介绍了心脏类器官导线平台的构建步骤。

人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）作为一种具有前景的细胞来源，已推动了对其……的研究

本实验的总体目标是利用三维可控的细胞培养方法结合电刺激，促进人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的心肌细胞的成熟。该方法有助于解答心脏组织工程领域中的关键问题，例如不同的电刺激参数或刺激时间长短如何影响心肌细胞的功能和成熟状态。最终可获得成熟度更高的工程化人源心脏组织。该技术的应用前景涵盖诊断领域，例如用于测试新药的安全性和有效性，因为具有成熟特征（如电生理特性）的心肌细胞最有可能在药物筛选研究中作为更准确的人类心肌细胞模型。按10:1的比例混合PDMS单体与固化剂，并充分混匀。静置5分钟以去除气泡。然后将含有生物导线模板母版的培养皿中加入PDMS混合物。尽量减少气泡的产生。接着在70°C下固化PDMS两小时。然后，先用锋利的刀片沿边缘切割，将固化的模具取出，再将其剥离。接着修剪多余的PDMS，并将所有模板收集到灭菌袋中。在121摄氏度下通过蒸汽高压灭菌器对模板灭菌20分钟。然后在生物安全柜的通风条件下，将每个模板放入无菌培养皿中。接着，使用镊子将一段无菌6.0号丝线缝合线沿通道全长置于模板的凹槽内。模板随后即可用于细胞接种。缝线将作为三维结构形成的模板，使细胞沿缝线轴向排列，模拟心肌纤维的形态。为每个腔室制作一对矩形聚碳酸酯片，作为电刺激腔室的框架。在每片聚碳酸酯片的中心线上，钻两个直径三毫米的孔，两孔间距为两厘米。为每个腔室准备两根1.5厘米长的碳棒。在每根碳棒末端约3毫米处钻一个直径1毫米的孔。然后将铂丝穿过每个孔，并将铂丝的一端缠绕在碳棒上。接下来，为每个腔室在两块聚碳酸酯材料之间插入两根杆，形成一个框架。然后将约两毫升的PDMS倒入六孔板的一个孔中，并将框架放入含有PDMS的孔内，使框架底部浸入PDMS中。在70°C下固化PDMS两小时，使PDMS牢固固定框架。然后将带有已固化PDMS的完整腔室从培养板上取下。为测试组装好的腔室功能，将铂金丝连接至电池，并使用电压表检查电流是否通过电极杆。现在将功能正常的腔室转移至灭菌袋中，在121摄氏度下进行20分钟的蒸汽灭菌，以备用于细胞培养。制备凝胶时，先将所有凝胶组分在冰上预冷，然后在无菌离心管中混合。务必最后加入胶原蛋白和细胞外基质，并通过移液操作混合各组分。细胞为由人多能干细胞分化而来的心肌细胞。收集细胞，为每根生物线制备装置准备含有50万个细胞的3.5微升胶原凝胶。现在使用P10移液枪头将约4毫升悬液加入每个培养皿中0.5厘米长的通道模具内。根据需要使用无菌镊子调整缝线位置，使其完全拉伸。接种细胞后，每次取用前务必重新悬浮凝胶-细胞混合物，以确保结果一致。加样至通道后，用无菌 PBS 覆盖培养皿底部，注意勿接触凝胶，以防止生物微线在聚合过程中脱水。将生物导线在 37 摄氏度下孵育 30 分钟后，用足量培养基替换 PBS，以覆盖细胞，通常 12 毫升即可。随后培养培养皿一周，每隔一天更换一次培养基。在生物

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用电刺激人干细胞衍生的心肌细胞的成熟中Biowires

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。...

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本方案描述了用于临床前药物测试的人类心脏切片的切片与培养步骤，并详细说明了如何利用光学标测技术同步记录这些切片中的跨膜电压和细胞内钙信号。...

利用人源类器官心脏切片的双电压与钙光学标测进行临床前心脏电生理学评估

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

在此，我们展示了一种利用二维人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）单层在柔性基底上培养，并结合基于视频的显微镜技术，用于无创评估心脏医疗设备收缩力的方法。该工具将有助于 体外...

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解利用三维细胞培养与电刺激促进人胚胎干细胞及诱导多能干细胞衍生心肌细胞成熟的Biowires技术。该方法可构建功能更成熟的心脏组织模型，用于药物安全性与有效性筛选研究。

利用电刺激在生物导线中促进人干细胞来源心肌细胞的成熟

探索更多视频