Name: 使用体外生物法测定抗 tnf 单克隆抗体 (抗体) 的相对效力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: 学习使用WEHI 164细胞进行抗TNF-alpha单克隆抗体相对效力测定的体外生物测定法。该方法通过比较参比抗体与待测抗体的中和效率，为免疫学和生物技术领域的研究人员提供定量评估单克隆抗体生物活性的标准化方案。

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本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）资助，项目编号为PEI CONACYT 2015 220333，但该机构未参与研究设计。

1. 培养基与溶液的制备
<ol>
	<li>准备培养基：含 10% FBS 的 RPMI-1640，pH 7.4。</li>
	<li>准备检测用培养基：不含酚红但含 1% FBS 的 RPMI-1640，pH 7.4。</li>
	<li>准备细胞洗涤液：含 0.02% EDTA 的无镁无钙 DPBS 溶液，pH 7.4。</li>
	<li>准备细胞解离液：含 1 mM EDTA 的 0.125% 胰蛋白酶溶液。
	<ol>
		<li>解冻 100 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并转移至无菌的 500 mL 锥形瓶中。</li>
		<li>加入 100 mL 细胞洗涤液混匀，分装为每管 15 mL 至无菌 15 mL 离心管中。储存于 -70 至 -80 °C，直至使用。</li>
		<li>使用前通过 0.22-µm 滤膜过滤上述溶液，并在使用前至少 30 分钟预热至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备凋亡诱导储备液：浓度为 3.3 µg/mL 的 TNFα 溶液。
	<ol>
		<li>在 TNFα 原装容器中加入 500 µL 经滤膜除菌的水，溶解 20 µg TNFα，混匀至完全溶解。</li>
		<li>转移至 15 mL 无菌离心管中，加入 5.5 mL 无镁无钙 DPBS 溶液，轻轻涡旋混匀。</li>
		<li>将溶液分装为每份 70 µL，每份加入 0.5 mL 微量离心管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备凋亡诱导工作液：浓度为 40 ng/mL 的 TNFα 溶液。
	<ol>
		<li>取出一份凋亡诱导储备液，在 25 °C 水浴中孵育 10 分钟以解冻。</li>
		<li>在 15 mL 无菌离心管中，将 61 µL 的 3.3 µg/mL TNFα 储备液加入 4.939 mL 检测用培养基中，稀释至终浓度为 40 ng/mL。</li>
		<li>涡旋混匀 10 秒；该溶液必须在使用前新鲜配制。</li>
		<li>在中和实验使用前，至少预热 30 分钟至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备底物溶液：caspase 3/7 Glo 溶液7,8。
	<ol>
		<li>在使用前 12 小时解冻 caspase 缓冲液（caspase 3/7 Glo 缓冲液）。</li>
		<li>将 caspase 缓冲液与底物（caspase 3/7 Glo 底物）分别在 25 ± 5 °C 放置 30 分钟后再进行混合。</li>
		<li>将 10 mL caspase 缓冲液转移至底物小瓶中，通过倒置混匀。</li>
		<li>避光保存于 25 ± 5 °C，直至使用。 
		注意：该溶液在室温下可稳定保存 6 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养与计数
<ol>
	<li>细胞复苏与首次传代培养
	<ol>
		<li>取出一个含有 WEHI 164 细胞的小瓶9 从-80 °C冰箱中取出并转移至冰浴中。</li>
		<li>用1 mL预热的培养基上下吹打，直至冻存的细胞完全解冻。</li>
		<li>将9 mL预热的培养基加入一个15 mL无菌离心管中。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 mL无菌管中，轻轻倒置混匀5次。</li>
		<li>将细胞悬液在125 x g条件下离心 g 3 分钟。弃去上清液，并分散细胞沉淀。</li>
		<li>加入5 mL培养基至离心管中，混匀直至细胞完全重悬。</li>
		<li>进行细胞计数时，转移 50 µL 细胞悬液至 500 µL 微量离心管中并混匀 50 µL 0.4% 台盼蓝。计数细胞并调整至 0.5 × 106 细胞/mL。参见下文步骤 2.2。</li>
		<li>向一个75 mL细胞培养瓶中加入13 mL预热的培养基。</li>
		<li>从步骤 2.1.6 中取出足够的细胞悬液体积，以达到 0.5 x 106 细胞/mL于细胞培养瓶中，并在 37 °C 和5% CO2 过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数 
	注：参见参考文献10.
	<ol>
		<li>使用步骤2.1.6中的溶液，取0.05 mL加入血细胞计数板，利用台盼蓝排斥法在显微镜下测定细胞密度。</li>
		<li>定量测定细胞总数和活细胞数。</li>
		<li>将细胞悬液调整至 0.5 x 106 cells/mL 
		公式 1 
		V培养基（mL）= <img alt="细胞浓度计算，公式：(0.5×10⁶ cells/mL × 5 mL) / NVC cells/mL，示意图。" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		V培养基（mL）=（5 mL - V）细胞悬液) 
		V培养基（mL）= WEHI 164 细胞悬液的调整体积 
		NVC = 每毫升具有活力的 WEHI 164 细胞数量/mL 
		V培养基（mL）= 为使细胞悬液达到 0.5 x 10 添加的检测培养基体积6 cells/mL 
		0.5 × 106  靶细胞密度</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞脱离及第二代和第三代继代培养。 
	注意：可使用真空系统从烧瓶中移除溶液。可使用一次性或玻璃无菌移液管。若移液管顶端带有棉花塞，使用前必须将其移除。
	<ol>
		<li>使用1 mL无菌移液管和真空泵吸出细胞培养T型瓶中的培养基。</li>
		<li>向培养T形瓶中加入5 mL细胞洗涤液，轻轻混匀后弃去。重复此步骤两次。 
		注意：完全去除培养基对于实现高效的细胞脱离至关重要。</li>
		<li>向T形瓶中加入15 mL细胞解离液，在培养箱中孵育3分钟 37 °C 和5% CO2.</li>
		<li>在显微镜下确认培养瓶内壁无贴壁细胞残留。使用 20 mL 无菌移液管将细胞从培养T瓶中吹下，并转移至 50-mL 无菌离心管中。</li>
		<li>将细胞悬液在 125 x g 孵育3分钟。弃去上清液，用5 mL培养基重新悬浮沉淀。</li>
		<li>计数细胞，并根据所需细胞浓度加入适量培养基 公式 1.</li>
		<li>将此悬液加入72 cm2 T- flask中，37°C过夜培养 37 °C 和 5% CO2.</li>
		<li>在用于中和实验之前，至少传代培养细胞两次。接下来的两天内重复步骤 2.3.1–2.3.8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测细胞悬液。
	<ol>
		<li>选择一个已传代至少三次的 WEHI 164 亚培养物。参见步骤 2.1。</li>
		<li>根据本方案的步骤 2.2 和 2.3 进行细胞解离与计数。</li>
		<li>根据需要稀释细胞悬液 公式 1 至 0.5 × 106 cells/mL</li>
		<li>将此细胞悬液用于中和实验。使用前，用涡旋混合器混匀所有细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗体的制备与稀释
<ol>
	<li>单克隆抗体的定量
	<ol>
		<li>通过在 280 nm 处测定紫外吸收，利用质量消光系数（1.39）确定参考物质、对照样品和分析样品的浓度11. 
		注意：原始浓度可从药品标签获取，但必须通过紫外吸收进行验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单克隆抗体稀释液
	<ol>
		<li>在2 mL微量离心管中，用不含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS溶液将所有样品独立稀释三个复孔，稀释至2 mg/mL。使用不含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS溶液作为空白对照，通过紫外吸收法测定三次，确认该浓度。</li>
		<li>使用涡旋混合器将蛋白储备液混合5秒。</li>
		<li>稀释 100 µL 将每种2 mg/mL的mAb溶液与0.9 mL的检测培养基混合。</li>
		<li>涡旋振荡混合5秒。 
		注意：这些溶液的浓度为 200 µg/mL每次实验需设三个重复，每个重复均需进行稀释。</li>
		<li>稀释 10 µL 每一项的 200 µg/mL 将 mAb 溶液与 0.99 mL 检测培养基混合，使用涡旋混合器混匀 5 秒。这些溶液的浓度为 2 µg/mL对每个三复孔样品在用于中和实验前进行系列稀释。</li>
		<li>在三个独立的微孔板中配制抗TNFα单克隆抗体稀释液。从每个独立的三复孔中取一份复孔，分装至同一微孔板中，如图所示。 表1. 参考物质
		<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" fo:text-align="center">
			<tbody>
				<tr>
					<td colspan="2">1号培养皿</td>
					<td colspan="2">2号培养皿</td>
					<td colspan="2">图3</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>孔板</td>
					<td>样本</td>
					<td>孔板</td>
					<td>样本</td>
					<td>孔板</td>
					<td>样本</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>B2:B11</td>
					<td rowspan="2">参照物质</td>
					<td>B2:B11</td>
					<td rowspan="2">对照样本</td>
					<td>B2:B11</td>
					<td rowspan="2">分析样品</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>C2:C11</td>
					<td>C2:C11</td>
					<td>C2:C11</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>D2:D11</td>
					<td rowspan="2">分析样品</td>
					<td>D2:D11</td>
					<td rowspan="2">参照物质</td>
					<td>D2:D11</td>
					<td rowspan="2">对照样品</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>E2:E11</td>
					<td>E2:E11</td>
					<td>E2:E11</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>F2:F11</td>
					<td rowspan="2">对照样本</td>
					<td>F2:F11</td>
					<td rowspan="2">分析样品</td>
					<td>F2:F11</td>
					<td rowspan="2">参照物质</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>G2:G11</td>
					<td>G2:G11</td>
					<td>G2:G11</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		表1：微孔板样品阵列。 完整的中和试验必须在三块微孔板的 B2 至 G11 坐标范围内进行。参考样本、分析样本和对照样本的随机分配可使研究人员验证试验中是否存在任何偏差。</li>
		<li>按照所示对每个参考品、样本或对照品进行单克隆抗体稀释 表2. 
		注意：本表中所述的抗 TNFα 单克隆抗体浓度并非中和试验中的最终浓度。
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
			<tbody>
				<tr>
					<td>平板柱</td>
					<td>检测用培养基体积（μL)</td>
					<td>参考物质、分析样品或对照样品的体积（uL）</td>
					<td>检测板中的浓度（ng/mL）</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>2</td>
					<td>0</td>
					<td>230</td>
					<td>2000</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3</td>
					<td>150</td>
					<td>150，来自第2行</td>
					<td>1000</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>4</td>
					<td>75</td>
					<td>第3行起75</td>
					<td>500</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>5</td>
					<td>100</td>
					<td>第3行起的50</td>
					<td>333</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>6</td>
					<td>75</td>
					<td>第4行起第75条</td>
					<td>250</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>7</td>
					<td>75</td>
					<td>第5行起第75个</td>
					<td>166</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>8</td>
					<td>75</td>
					<td>第6行起第75条</td>
					<td>125</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>9</td>
					<td>75</td>
					<td>75，来自第7行</td>
					<td>83</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>10</td>
					<td>75</td>
					<td>第9行起第75个</td>
					<td>41</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11</td>
					<td>150</td>
					<td>第10行起第75条</td>
					<td>13</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		表2：抗TNFα单克隆抗体稀释比例。 本表展示了抗TNFα单克隆抗体的系列稀释。表中所述终浓度并非中和实验中的实际浓度，因为在中和实验中抗TNFα单克隆抗体被稀释了3倍（单抗稀释液 + 培养基 + 细胞悬液）。加粗行表示来自第3、5、7、9和10行的稀释；非加粗行表示来自第3、4和6行的稀释。这些系列稀释操作需在进行中和实验前立即完成。分装稀释液前，必须用移液器上下吹打混匀三次。</li>
		<li>将培养皿置于 25 ± 5 °C 直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用 WEHI 164 细胞进行中和实验
<ol>
	<li>通过涡旋振荡混匀所有细胞悬液（0.5 x 106 细胞/mL）在本方案的任何步骤分装之前。 
	注意：在本部分中，将每种溶液加热至 37 °C 使用前孵育30分钟。</li>
	<li>转移 50 µL 将细胞悬液分别加入微孔板的60个孔中，从第2至第11列、B至G行依次进行。</li>
	<li>转移 50 µL 将单克隆抗体参考品、样品和对照品稀释液加入微孔板中。遵循图示模式进行操作。 图1.</li>
	<li>添加 50 µL 向每个孔中加入凋亡诱导溶液。</li>
	<li>使用细胞对照 50 µL WEHI 164 细胞，分装至三个孔中，每孔补加液体至终体积 150 µL 使用检测培养基。</li>
	<li>使用细胞毒性对照混合物 50 µL WEHI 164 细胞的 50 µL 凋亡诱导溶液。将每孔补至最终体积 150 µL 用检测培养基。</li>
	<li>对于TNFα对照，使用 50 µL 凋亡诱导溶液，并将其补至 150 µL 用检测培养基。</li>
	<li>空白对照使用 150 µL 仅含检测用培养基。</li>
	<li>用填充剩余的孔 150 µL 以避免培养板蒸发效应。</li>
	<li>在另外两个微孔板中重复步骤 4.1.1–4.1.9 两次。 
	注意：微孔板中单克隆抗体的最终浓度分别为：0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 µg/mL.</li>
	<li>将样品加入微孔板中，具体操作如图所示。 图1. 
	<img alt="96孔板示意图；TNF-α检测、稀释系列、对照/参考样本、实验设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
	图1： 检测板中样品的放置方式。 B1 至 G11 是微孔板中的孔位坐标，表示样品稀释液所放置的位置。缺失的坐标（A1-A12 和 H1-H12）为加入对照和检测培养基的孔。样品在微孔板中采用随机分布（正向与反向稀释）的方式，有助于消除因培养基蒸发或其他变量引起的实验结果偏差。建议每块微孔板由同一名分析人员完成。R：参考，S：样品，CS：对照样品，Dil：稀释。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a></li>
	<li>将三个培养皿置于培养箱中培养 37 °C 和 5% CO2 16 ± 2 小时。</li>
	<li>让caspase 3/7 Glo试剂在25 ± 5 °C 使用前放置 30 min。</li>
	<li>添加 100 µL 将该试剂加入所有孔中，包括样品孔和对照孔。</li>
	<li>使用微孔板涡旋混合器以 25 ± 3 min 充分振荡混匀各孔中的样品。 5 °C 加样至孔板后立即进行。</li>
	<li>将培养板在 25 ± 5 °C，避光保存。</li>
	<li>将微孔板插入发光仪中，并完成下一环节。</li>
</ol>
5. 结果分析
<ol>
	<li>使用发光检测软件，选择发光模式和终点检测功能。</li>
	<li>选择一个96孔透明底板，使用其80个内部孔，排除第1列和第12列。</li>
	<li>选择1,250 ms的积分时间，并在读数前以10 s混匀微孔板。</li>
	<li>选择放置参照物质、分析物质和对照样品的孔，并标注其相应的浓度。</li>
	<li>使用光度计读取置于微孔板中的样品。</li>
	<li>使用四参数方程对结果进行分析。绘制剂量-反应曲线，如图所示。 图2. 
	<img alt="中和实验，浓度与相对光单位（RLU）关系图；对照、分析、对照样本，误差线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
	图2： 剂量-反应曲线 抗TNFα单克隆抗体浓度与发光强度（细胞活力）的关系如图所示。采用描述抗TNFα单克隆抗体保护效应的四参数方程作为拟合模型。EC50表示在每次实验中能够中和引起50%细胞死亡量TNFα的单克隆抗体浓度，在图中体现为斜率变化点。误差棒表示每个单克隆抗体浓度下发光强度的标准差。 x 表示抗TNFα抗体浓度，以ng/mL为对数函数形式表示，而 y 表示 任意发光单位中的发光响应。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a> 
	注意：在第四个参数方程中，C 是有效浓度50（EC50）。该值将用于通过效应函数比较参考物质、分析样品和对照样品。</li>
	<li>在计算相对效价时，将参照物质设定为100%，并据此计算样品和对照品的效价。 
	注：这些数值在图中显示为 图3. 
	<img alt="四参数曲线拟合结果；图中符号：对照（红色），分析（蓝色），对照（绿色）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
	图3： 用于计算EC50及其数值的数学方程。 EC50值（或C参数）的不确定性以标准误表示。样本与参比品之间的EC50比较用于反映相对效价，同时展示其置信区间，置信区间的计算采用α = 0.05。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a></li>
</ol>

<ol><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Patho%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="https://www.dovepress.com/regulatory-mechanisms-of-apoptosis-in-regularly-dividing-cells-peer-reviewed-article-CHC">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li>
<li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18155297">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li>
<li>Körner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin%3A+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li>
<li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17916444">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li>
<li>Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+antagonists%3A+different+kinetics+and%2For+mechanisms+of+action+may+explain+differences+in+the+risk+for+developing+granulomatous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection.</a> Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).</li>
<li>Karvinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence+quenching+assay+%28LANCE%29+for+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3.</a> J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).</li>
<li>Ren, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li>
<li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+CD8%2B+T+cells+to+control+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).</li>
<li>Ramasubramanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamasubramanyan%2C+N+%22Low+acidic+species+compositions+and+methods+for+producing+and+using+the+same%22">Low acidic species compositions and methods for producing and using the same</a>. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF%3A+sensitivity%2C+specificity%2C+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li>
<li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li>
<li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+immune+function%3A+molecular+mechanisms+to+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li>
<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

该表征有助于确定 先验的 在开展成本高昂且耗时的临床试验之前，该方法可用于评估一种在研分子的生物学行为。同时，它也适用于已获批药品的批间放行检测。值得指出的是，这类检测可用于判断分子是否具有与其作用机制相符的充分生物学效应。本教程所介绍的生物分析方法对于不同抗TNFα分子之间的比较具有至关重要的意义。尽管存在常规的理化检测方法，但该方法能够通过生物学手段测定药物的效价与效力，作为其质量属性，从而全面、完整地反映效应功能的真实意义。
通常，细胞对 TNFα 诱导凋亡的反应性检测对研究人员而言可能具有挑战性。在标准化该生物学方法之前，可通过表征日常使用的细胞库来进行故障排查。一个例子是细胞系在一定时间范围内的细胞反应变异性，这与细胞系的老化相关。12该问题可通过使用在 -80 °C 冻存的主细胞库来消除。工作细胞库的规模必须足以满足由 R 开展的一项 DOE 研究的需求&amp;#38;D 或一年期限内用于质量控制实验室。此外，在本方案的任何步骤中将溶液加入细胞之前，均可使用温度稳定的溶液来固定这种响应性。在进行中和试验...

生物效价是基于与相关生物学特性关联的检测产品属性而测定的生物学活性的定量度量，而含量（以质量表示）则是蛋白质含量的理化度量。效价检测与其他分析方法一起，作为产品符合性、稳定性及可比性研究的一部分进行。在此意义上，效价测定用于证明在临床试验各阶段以及上市批准后，各批次产品均符合关键质量属性（CQAs）或可接受标准。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在细胞受到病毒感染或受到损害细胞活力和功能的环境因素胁迫时自然发生1,2。其中，抑制细胞凋亡或生物学中和作用是单克隆抗体（mAbs）主要已知的治疗机制之一，尤其在治疗慢性疾病（如免疫介导的炎症性疾病）中具有重要作用。抗TNFα分子通过阻断肿瘤坏死因子α（TNFα）与细胞表面p55和p75受体的相互作用3，从而抑制最终导致细胞凋亡的信号通路。
TNFα 可在某些慢性疾病中引发炎症4。作为先天免疫系统的哨兵细胞以及此类疾病中的主要效应细胞，巨噬细胞会异常地将 TNFα 分泌到细胞外环境中5。TNFα 调控失常是一条常见的致病通路，与这些疾病的发病机制密切相关。若缺乏有效调控，并在持续诱导和细胞应激条件下，TNFα 会诱导细胞死亡和组织退化，最终导致类风湿性关节炎、克罗恩病及其他病理状态6。
阻断TNF与其受体相互作用的TNF拮抗剂已被 increasingly 用于有效减轻症状并延缓这些疾病的进展。目前，抗TNFα药物产品已广泛应用于控制该细胞因子的全身浓度，从而防止受累组织进一步退化。因此，建立一种可重复且稳健的生物检定方法，以描述药物实现其生物学效应的特异性能力，显得至关重要。
在本实验方案中，重点强调了在中和实验开发过程中确定的关键步骤，这些步骤对于成功测定生物活性至关重要，尤其突出了执行该生物分析方法所需的技术要点。该生物分析方法在与经过临床验证的参照物质进行比较时，可为不同批次或抗TNFα药物产品之间提供有价值的可比性信息。

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>来自小鼠（Mus musculus）的纤维肉瘤细胞</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>将培养基储存于 2 &amp;deg;C 至 8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>无酚红 RPMI 1640 培养基</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>将培养基储存于 2 &amp;deg;C 至 8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>将试剂储存于 -10 &amp;deg;C 至 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>将培养基储存于 2 &amp;deg;C 至 8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 TNF-α 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 至 -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（美国来源），超低 IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>储存于 -10 &amp;deg;C 至 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（美国来源），经鉴定</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>储存于 -10 &amp;deg;C 至 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>将 Caspase-Glo 3/7 底物和 Caspase-Glo 3/7 缓冲液于 &amp;ndash;20 &amp;ordm;C 避光保存</td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物，晶体，ACS 级试剂</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>待测单克隆抗体阿达木单抗</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>在微孔板中的终浓度为：&amp;nbsp;0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>参比和对照单克隆抗体阿达木单抗</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>在微孔板中的终浓度为：&amp;nbsp;0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 多功能酶标仪</td></tr><tr><td>酶标仪软件&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>--</td><td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>Revco&amp;nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB 强制通风 CO2 培养箱</td></tr><tr><td>超净工作台&amp;nbsp;</td><td>The Baker Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>200256</td><td>Baker SG603A-HE | 高效，II 级 A2 型&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用中和tnf法测定抗tnf单克隆抗体（mab）的相对效价 体外 生物分析方法

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

本方案展示了利用抗TNFα单克隆抗体在小鼠成纤维细胞模型（WEHI 164）中检测TNFα诱导凋亡活性的中和作用。此外，本方案也可用于评估其他抗TNFα分子，如融合蛋白。所采用的细胞模型在细胞培养条件下引入额外应激因素时，对TNFα介导的凋亡具有敏感性例如， 血清剥夺）。该流程示范了如何执行此分析测定，重点强调了与样品制备、细胞稀释、凋亡诱导及分光光度测量相关的关键操作步骤，这些环节对于确保实验成功至关重要。本方案揭示了实现最佳凋亡诱导效果和高效信号记录的最优条件，从而获得较低的不确定度数值。

剂量-反应曲线（含对照） 
图1 显示了发光反应与单克隆抗体（mAb）浓度之间的关系。该S型曲线反映了由于细胞裂解导致的检测培养基中caspase 3和caspase 7的释放。细胞死亡因血清饥饿联合TNFα信号诱导而增强。因此，抗TNFα分子（mAb）与细胞因子结合，通过空间位阻抑制其与TNF细胞受体的相互作用，从而在较高mAb浓度下促进细胞存活。
本方法中使用的对照包括：仅含检测培养基的细胞、含TNFα和检测培养基的细胞，以及仅含检测培养基的对照组。在FBS饥饿条件下，仅含检测培养基的细胞未发生凋亡，因而产生发光信号。此外，仅暴露于TNFα但培养于培养基中的细胞确实存活。
另一个重要的对照是仅含检测用培养基的样本。该对照有助于...

本文介绍了一种利用WEHI 164细胞通过中和机制测定抗TNFα单克隆抗体相对抗凋亡活性的实验方案。该方案适用于比较具有相同生物学功能的不同分子的中和能力。

利用中和TNF法测定抗TNF单克隆抗体（mAb）的相对效价 体外 生物分析方法

本方案展示了利用小鼠成纤维细胞模型（WEHI 164）检测TNFα诱导的凋亡活性中和作用的方法，使用……

本实验的总体目标是测定抗TNF-α分子的相对效价。在此示例中，我们比较两种抗TNF-α单克隆抗体，以确定待测样本单抗相对于参考单抗的中和效率。本教程展示了文献中未包含的TNF-α中和效价测定的详细步骤。细胞可能受到不同环境因素的胁迫，例如饥饿。每种细胞表面都具有不同的蛋白质，称为受体。其中一些受体特异性识别细胞因子TNF-alpha。当该分子与其受体相互作用并产生特定信号时，此信号传导与环境应激因素共同引发一种称为细胞凋亡的程序性细胞死亡。然而，在存在抗TNF-α分子（如单克隆抗体）的情况下，该细胞因子可被单克隆抗体滴定，经历中和过程，从而帮助细胞存活。因此，在标准化方法下，可测定分子的中和能力。本方案目前需在五天内完成。第一天需配制细胞培养所需的溶液，同时复苏并传代培养 WEHI 164 细胞。在第二天和第三天，必须验证细胞的融合度。此步骤完成后，细胞必须被消化脱离，计数，调整细胞密度，最后重新培养。这些步骤必须每天进行。在第四天，必须通过紫外吸收法测定单克隆抗体浓度，并进行抗体稀释。随后将配制诱导凋亡的溶液。最后，需将WEHI 164细胞的密度调整至每毫升五十万个细胞。在第五天，将制备用于检测凋亡细胞的底物溶液，并进行分光光度分析。最后，将讨论结果的计算机模拟分析。本方案中使用的所有溶液均在此幻灯片中展示。在第一天，除凋亡诱导剂和底物溶液需在重悬后立即使用外，该溶液必须在方案实施前预先配制。本方案开始时，需从液氮容器中取出冻存的细胞。装有冻存WEHI细胞的冻存管在使用前须保持在冰上。在进行任何操作之前，请保持工作场所清洁并预先消毒，以避免交叉污染。将等温架转移至超净工作台中，并将九毫升预热的培养基加入一个15毫升无菌离心管内。用一毫升预热的培养基洗涤WEHI 164细胞，通过轻柔的上下吹打，直至冻存细胞从微量离心管中脱离。上下颠倒混匀五次，直至冻存细胞完全解冻。随后以125 g离心3分钟。弃去上清液，并重悬细胞沉淀。向试管中加入 5 mL 预热的培养基，混匀悬浮液，直至细胞完全重悬。将细胞转移至 T 型培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。每天传代前，必须在显微镜下观察细胞培养状态，以确认培养物的健康状况，并对培养细胞进行计数。研究人员必须验证细胞的健康状况、活力和传代时的细胞密度。对于生物学实验，也必须进行此项验证。首先，必须确认不存在生物污染，例如细菌污染。其次，可通过汇合度来验证细胞健康状态。汇合度超过90%即可获得良好的实验结果。然而，如果细胞尚未达到预期的细胞密度，则需将培养瓶放回培养箱中，继续培养直至细胞达到预期的密度和汇合度。必须从T型培养瓶中移除陈旧的培养基。用5 mL细胞清洗液冲洗T型培养瓶壁上贴壁的细胞，注意避免去除贴壁细胞。手动混匀以去除培养基残留物和细胞碎片。此步骤必须重复执行两次。使用真空装置移除残留的洗涤液，并加入3 mL细胞解离溶液。振荡并孵育三分钟。孵育结束后，向T形培养瓶中加入预热的培养基以灭活酶，并回收细胞。将细胞悬液转移至15 mL离心管中并离心。识别细胞沉淀并弃去上清液。去除陈旧的培养基对于健康细胞的培养至关重要。重悬细胞沉淀，并用5 mL预热的培养基重新悬浮细胞。取50 µL细胞悬液转移至微量离心管中。使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。计数细胞并确定细胞活力。根据活细胞数量，使用以下公式将15 mL培养基调整至每毫升含50万个细胞的密度。取15 mL调整后的细胞悬液转移至T型培养瓶中，过夜培养。在开始中和试验之前，必须将整个培养过程至少再重复一次，共完成三次细胞传代。在第四天，使用紫外吸收法在280纳米处测定参考物质、分析样品和对照样品的光密度。每种样品均用检测培养基独立进行三次平行操作，初始稀释至每毫升含2毫克。对每种单克隆抗体样品进行第二次稀释，稀释至每毫升含两微克。向聚苯乙烯微孔板中央的60个孔中各加入75微升检测培养基。在2B和2C孔中各加入230微升参考物质。分析样品位于孔 2D 和 2E 中。最后，对照样品位于孔 2F 和 2G 中。对照样品是指具有已知相对效价的分子。然后将溶液进行倍比稀释至微孔板中。后续幻灯片中展示了示例。在将溶液加入各孔之前，请务必预先混匀。此操作对本实验方案的成功至关重要。先将细胞调整至每毫升50万个，再用分液器向检测板内侧的60个孔中加样，从第二列至第11列开始，每孔加入50微升细胞悬液。在向微孔板中添加液体前，先混匀细胞悬液。立即将50微升单克隆抗体稀释液转移至检测板中。对于配对孔，通过旋转移液器的方式分配稀释液。可以按以下顺序将单克隆抗体稀释液加入各孔中，对照品加入周围孔中。用500 µL超纯水稀释TNF-α。在2200 rpm条件下用旋涡混合器混匀。转移至15 mL离心管中，最终用检测培养基稀释至40纳克/毫升。向60个内部检测孔中每孔加入50微升凋亡诱导溶液。向60个内部检测孔中每孔加入50微升凋亡诱导溶液。最后，孵育16小时。第五天，按照制造商说明书中的指示，用此缓冲液溶液重悬底物。颠倒混匀5次。加入底物溶液。向检测板的每个样品孔中加入50微升底物溶液。同时向对照孔中加入底物。将检测板在涡旋混合器上以400 rpm的速度振荡3分钟。从混合器中取出检测板，在室温下孵育。开启酶标仪-分光光度计。打开 SoftMax Pro 软件或任何等效程序。将微孔板装入分光光度计，并调整以下参数。启用发光功能，并将读数类型设置为终点法。调整读取区域，排除第一列和第12列。选择板类型为96孔标准透明底微孔板。将积分时间调整至最长1250毫秒。将微孔板的振荡时间调整为10秒。选择放置参照物质、分析物质和对照样品的孔。开始读数。本实验的结果是以发光强度表示的反应曲线，相对于单克隆抗体浓度的对数尺度绘制。这些曲线的拐点即为各单克隆抗体的有效浓度，即 EC50。C 值或 EC50 以每毫升纳克（ng/mL）表示。然而，该数值本身并无意义，除非与参比样品进行比较。因此，待测样品的效价以百分比表示，称为相对效价。相对效价基于三个独立微孔板实验结果的平均值，每个结果均来自相应微孔板的EC50值。对照样品与参考样品之间的比较有助于确定当前检测中的任何偏差或偏倚。参考样品与待测样品的比较有助于确定相对效价。该表格显示了单克隆抗体的相对效价及其95%置信区间，同时还列出了各样品相对于参考物质效价的相对标准偏差。相对标准偏差超过15%被视为不可接受。该表征有助于在开展昂贵且耗时的临床试验之前，预先确定处于研发阶段分子的生物行为特性。同时，该方法也适用于已批准产品的批间放行。我们确信这些检测方法有助于确定分子是否具有与其作用机制相关的充分生物学效应。作为生物物理方法的一部分，该技术能够通过生物学手段测定药物质量及其特性的效价和功效，从而全面充分地体现其效应功能的意义。

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