Name: 简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外和体内表达人类 TCRs (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学习从单细胞中高效扩增TCR α和β链的两步PCR方法，用于免疫学研究和TCR克隆。该技术无需预先知道TCR序列，兼容后续体外和体内功能研究，为分析抗原特异性T细胞群体的TCR库和体内功能提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由 JDRF 1-FAC-2014-243-A-N、ADA 7-14-JF-07、NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ 以及罗伯特和简·麦克奈尔基金会资助。
感谢Sandra Pena和Andrene McDonald在患者招募方面的帮助，Samuel Blum提供的技术协助，以及George Makedonas博士提供的用于PCR优化的抗体和对照DNA。

1. 鉴定目标T细胞群体。
注意：可将抗原特异性增殖与细胞分裂染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，CFSE）结合使用，以根据T细胞对抗原刺激的增殖反应进行分离。若起始材料为外周血单个核细胞（PBMCs），建议培养7天 体外 扩增应足以鉴定出抗原特异性的CFSE低表达群体12.
<ol>
	<li>将PBMCs与MHC配型相合的饲养细胞按1:1混合，并用5 µM CFSE细胞分裂染料进行标记。</li>
	<li>在96孔圆底培养板中，每孔加入2-2.5 × 105个细胞，置于200 µL含10% FCS的完全RPMI培养基中。 
	注意：完全RPMI培养基包含2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 µM MEM必需氨基酸、5 mM HEPES、5.5 × 10− 5 单位的2-巯基乙醇、100 U mL− 1青霉素和100 µg mL− 1链霉素。</li>
	<li>用25 µM肽抗原刺激细胞。</li>
	<li>培养第四天，小心移除并更换100 µL培养基。 
	注意：鉴定抗原特异性T细胞更优的方法是使用肽-HLA四聚体13。四聚体染色可同时评估抗原特异性和HLA限制性。</li>
</ol>
2. 设置单细胞分选。
<ol>
	<li>所有操作均应在通风橱或指定的无扩增模板污染区域进行。为避免污染，需对试剂进行分装，PCR 准备前用 10% 次氯酸钠溶液清洁所有工作台面，若可行，也应清洁设备。在所有 PCR 和载体克隆步骤中使用带滤芯的吸头，以及无 RNA 酶和 DNA 酶的试剂与塑料耗材。关键试剂见材料表。 
	注意：多重 PCR 反应极为敏感，低水平的污染也可能导致扩增产物出现。</li>
	<li>在无菌移液储液槽中，将 10x 逆转录反应缓冲液、25x dNTPs、9 U 逆转录酶、0.01% Triton-X、0.7 U RNA 酶抑制剂以及每种 RT-TCR 引物（浓度为 383 nM，见表 1）混合，配制逆转录主混合液。每块 96 孔板额外多配制 10 个反应的量（总计 106 个反应），以补偿移液过程中的液体损耗。各反应组分及每孔用量详见表 2。</li>
	<li>使用多通道移液器，向 96 孔 PCR 收集板的每孔中加入 6 µL 逆转录主混合液，用于后续细胞分选。将该板置于冰上或冷块中保存。</li>
	<li>使用针对细胞表面标志物的抗体（如 CD4 和 CD3，或 CD8 和 CD3，每种抗体浓度为 2 µg/mL）结合细胞分裂染料或四聚体染色，对细胞进行标记。</li>
	<li>将 T 细胞以每孔一个细胞的方式进行分选，跳过第十二行，该行作为阴性对照。 
	注意：分选效率取决于收集板在板架中的精确对齐，以及在 cDNA 反应前保持细胞和板处于低温状态。除分选过程中将板固定于冷却板上外，收集板应始终置于冰上。并非所有分选仪均配备温度可控的板架，但强烈建议使用此类设备。由于每块板的分选通常耗时约 10–15 分钟，若未保持低温，RNA 降解的风险将显著增加。</li>
	<li>作为阳性对照，可在其中一个孔中手动加入较多数量的细胞（100 个细胞）。或者，也可使用先前提取的混合细胞 RNA 作为阳性对照，每孔加入 10 ng。 
	注意：操作纯化的对照 RNA 时应精确且谨慎，避免造成其他孔的交叉污染及假阳性结果。</li>
	<li>用粘性密封膜封板，并在 4 °C 下以 1000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>立即进行 RNA 到 cDNA 的逆转录，将板在 25 °C 孵育 10 分钟，37 °C 孵育 45 分钟，85 °C 孵育 10 分钟。 
	注意：为确保 PCR 反应高效进行，建议在同一天内进行第一次 PCR 反应。若无法实现，逆转录完成的板可在 -80 °C 保存最多 2 个月。</li>
</ol>
3. 进行多重巢式 PCR
注意：所有预混液均应在无模板的洁净区域配制，以避免污染。
<ol>
	<li>使用无DNA酶和RNA酶的H2O将每种可变区引物重悬至100 µM。随后，取44种引物中每种各20 µL混合，制备V-α引物池。为制备V-β引物池，取40种V-β引物中每种各20 µL，并加入80 µL无DNA酶和RNA酶的H2O。引物序列见表1。混合后，每种引物在混合液中的终浓度为2.3 µM。</li>
	<li>使用无DNA酶和RNA酶的H2O将恒定区引物重悬为100 µM的储存液。将恒定区引物稀释为10 µM的工作液，并分装备用。</li>
	<li>分别制备TCR-α和TCR-β扩增的两种独立主混合液。通过混合5X缓冲液、80 µM dNTPs、3% DMSO、2 µM引物池（每种引物的终浓度为46 nM）、200 nM TCR-恒定区反向引物、1 U DNA聚合酶以及无DNA酶和RNA酶的H2O来制备主混合液（表2）。每块96孔板需额外制备10个反应的量（总计106个反应），以补偿移液过程中的液体损失。 
	注：计算基于每孔终体积为25 µL的PCR反应，其中22.5 µL为主PCR混合液，2.5 µL为cDNA模板。</li>
	<li>将含有cDNA的板置于冰上或冷块中。使用多通道移液器将22.5 µL TCR-β反应液加入新的96孔PCR板中。然后使用多通道移液器将2.5 µL cDNA转移至该PCR板中。</li>
	<li>使用多通道移液器将22.5 µL TCR-α反应液直接加入含有剩余cDNA的板中。</li>
	<li>用封板膜密封板子，轻轻涡旋混匀，并在4 °C下以1000 × g离心5分钟。</li>
	<li>进行多重PCR反应，循环程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行34个循环（95 °C变性20秒，54 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后72 °C延伸7分钟。</li>
	<li>使用2.5 µL多重PCR产物作为模板，在终体积25 µL中进行巢式PCR反应。
	<ol>
		<li>使用无DNA酶和RNA酶的H2O将内部引物和接头引物重悬至100 µM，并分装为10 µM的工作液。</li>
		<li>分别制备TCR-α和TCR-β扩增的两种独立主混合液。混合5X缓冲液、25X dNTP、3% DMSO、200 nM正向接头引物、200 nM反向巢式引物、1 U DNA聚合酶以及无DNA酶和核酸酶的H2O，终体积为22.5 µL（表2）。每块96孔板需额外制备10个反应的量（总计106个反应），以补偿移液过程中的液体损失。 
		注：第二轮PCR反应中应使用含上样染料的5X PCR缓冲液，以便于琼脂糖凝胶上样。</li>
		<li>使用多通道移液器将TCR-α和TCR-β反应的主混合液各22.5 µL分别加入两个新的96孔PCR板中。</li>
		<li>每孔加入2.5 µL多重PCR反应产物作为模板。 
		注：剩余的第一轮PCR产物应密封后保存于-20 °C，以备必要时作为额外模板使用（参见步骤4.3注）。</li>
		<li>密封板子，轻轻涡旋混匀，并在4 °C下以1000 × g离心5分钟。</li>
		<li>进行巢式PCR反应，循环程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行34个循环（95 °C变性20秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后72 °C延伸7分钟。</li>
		<li>取5 µL最终PCR产物，在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳（包括阴性与阳性对照孔）。 
		注：预期条带大小约为500 bp。示例结果见图2。</li>
		<li>使用96孔板格式的PCR纯化试剂盒纯化剩余的第二轮PCR产物（20 µL），每孔用15 µL 70 °C的H2O洗脱，并进行Sanger测序。测序时使用相应的TCR-α或TCR-β接头正向引物（表1）。 
		注：序列可使用在线免疫遗传学软件进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. α和β PCR链的亚克隆。
注意：第一轮反应中使用的正向引物池，以及第二轮 PCR 反应中的反向引物池，用于引入限制性酶切位点。因此，所获得的α链和β链 PCR 产物已可依次亚克隆至模板逆转录病毒载体中（图 1）。
<ol>
	<li>用 BstbI 和 MfeI 酶切来自 β 嵌套反应的纯化 PCR 产物（表 3）。 
	注意：插入片段不得超过 5 µg。</li>
	<li>同时，用 BstbI 和 MfeI 酶切模板载体（表 3）。每种 TCR 使用 1–2 µg 模板载体。将酶切后的载体在琼脂糖凝胶上电泳，分离出较大的条带（约 7500 bp）。使用凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化载体。 
	注意：在限制性内切酶消化过程中，模板小鼠 TCR-β 可变区被去除，从而允许插入人 TCR-β 可变区。</li>
	<li>使用 PCR 纯化试剂盒纯化酶切后的 PCR 产物。 
	注意：请确认试剂盒中层析柱的 DNA 纯化能力；必要时可使用多个层析柱。成功连接反应所需的最少纯化插入片段量为至少 50 ng，最低浓度为 10 ng/µL。若纯化后的插入片段量不足以完成成功连接，可重复第二次 PCR 反应。</li>
	<li>用 10 U CIP 酶在 37 °C 处理模板载体 1 小时，以防止自连，随后在 75 °C 加热灭活 10 分钟。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA（表 3）。</li>
	<li>使用 DNA 连接酶将 TCR-β 插入片段与载体在 20 µL 总体积中进行连接，插入片段摩尔过量 6 倍，室温反应 30 分钟。 
	注意：连接反应总体应包含约 150 ng DNA（表 3）。</li>
	<li>转化时，将 8 µL 连接反应产物与 80 µL 化学感受态 E.coli DH5α 细胞（材料表）混合，冰上孵育 30 分钟。42 °C 热激 45 秒。加入 500 µL 含分解代谢抑制的超级优化肉汤（S.O.C.）培养基，于 37 °C 振荡培养 1.5 小时。</li>
	<li>取 250 µL 菌液涂布于含氨苄青霉素的溶菌肉汤（LB）琼脂平板。于 37 °C 培养过夜（约 16 小时）。</li>
	<li>次日挑取细菌菌落，在含氨苄青霉素的 3 mL LB 培养基中过夜培养。使用质粒 DNA 纯化试剂盒提取质粒 DNA。</li>
	<li>通过小规模限制性酶切实验（使用限制性内切酶 BstbI 和 MfeI）确认 β 链成功插入。在 12 µL 总反应体系中，加入 200–500 µg 质粒 DNA、每种酶 0.25 µL 及 10× 酶缓冲液（表 3）。在含溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，确认插入片段大小（约 500 bp）。</li>
	<li>确认插入片段存在后，使用 IRES 反向引物对载体中的 TCR-β 区段进行测序（表 1）。</li>
	<li>在确认 TCR-β 插入片段序列正确后，采用类似流程插入 α 可变区。用 SnaBI 和 SacII 分别酶切 α 嵌套反应的纯化 PCR 产物以及新构建的含 TCR-β 插入片段的载体。 
	注意：在限制性内切酶消化过程中，模板小鼠 TCR-α 可变区被去除，从而允许插入人 TCR-α 可变区。</li>
	<li>使用 DNA 连接酶将 α 插入片段连接至编码相应 β 可变区的 TCR 载体中，总体积为 20 µL，插入片段摩尔过量 6 倍，室温反应 30 分钟。 
	注意：连接反应总体应包含约 150 ng DNA（表 3）。</li>
	<li>转化时，将 8 µL 连接反应产物与 80 µL 化学感受态 E.coli DH5α 细胞（材料表）混合，冰上孵育 30 分钟。42 °C 热激 45 秒。加入 500 µL S.O.C. 培养基，于 37 °C 振荡培养 1.5 小时。</li>
	<li>取 250 µL 菌液涂布于含氨苄青霉素的溶菌肉汤（LB）琼脂平板。于 37 °C 培养过夜（约 16 小时）。</li>
	<li>次日挑取细菌菌落，在含氨苄青霉素的 3 mL LB 培养基中过夜培养。使用质粒 DNA 纯化试剂盒提取质粒 DNA。</li>
	<li>通过小规模限制性酶切实验（使用限制性内切酶 SnaBI 和 SacII）确认 α 链成功插入。在 12 µL 总反应体系中，加入 200–500 µg 质粒 DNA、每种酶 0.25 µL 及 10× 酶缓冲液（表 3）。在含溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，确认插入片段大小（约 500 bp）。</li>
	<li>确认插入片段存在后，使用 MSCV2-正向引物对载体中的 TCR-α 区段进行测序（表 1）。</li>
	<li>在 α 链序列验证完成后，使用 TCR-β-反向引物和 IRES-反向引物对完整 TCR 插入片段进行测序验证（表 1）。</li>
</ol>
5. 验证 TCR 细胞表面表达及特异性。
注意：使用 HEK293T 细胞检测 TCR 链的正确配对及细胞表面表达（图 3A）8。转染后的 HEK293T 细胞也可进行肽-MHC 四聚体染色，以检测 TCR 基因分离后抗原特异性的保留情况（图 3B）。
<ol>
	<li>在12孔组织培养板中接种HEK293T细胞，密度为1 × 10⁵5 每孔加入含5% FCS的1 mL完全DMEM培养基，接种适量细胞，于37 °C培养过夜。接种足够数量的细胞，以确保为每种新TCR、对照模板TCR载体、仅CD3载体、仅对照TCR载体以及非转染对照组分别预留独立的孔。 
	注意：使用完全小鼠模板的TCR载体（mTCR-pMIA）联合mCD3εγδζ-pMIG载体、单独使用mTCR-pMIA载体以及单独使用mCD3εγδζ-pMIG载体作为阳性与阴性对照。 
	注意：完全DMEM含有2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 µM非必需氨基酸、5 mM HEPES缓冲液、5.5 x 10-5 2-巯基乙醇单位，100 U/ml 青霉素/链霉素</li>
	<li>次日，按照制造商说明书，使用脂质体转染试剂将1 µg嵌合型h/mTCR-pMIA载体、1 µg小鼠CD3εγδζ-pMSCVII-GFP（pMIG）载体转染至细胞中。</li>
	<li>每种 TCR 中，加入 6 µL 转染试剂至 100 µL 室温无血清 DMEM 中。短暂涡旋混匀，室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>在单独的1.5 mL离心管中，将1 µg TCR-pMIA载体与1 µg小鼠CD3εγδζ-pMSCVII-GFP（pMIG）载体混合；对照组则分别加入1 µg各自单独的载体。</li>
	<li>逐滴将转染试剂/DMEM 溶液加入含有载体 DNA 的离心管中。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>逐滴将转染试剂/DMEM/DNA 溶液加入 HEK293T 细胞中。轻轻敲击培养板以混匀。在 37 °C 培养 24 小时。</li>
	<li>24小时后更换培养基，继续培养细胞24小时。</li>
	<li>通过剧烈吹打将细胞从培养板中移出，使用抗小鼠CD3抗体（2.5 µg/mL）对细胞进行染色，通过流式细胞术检测嵌合型TCR的表面表达情况。</li>
	<li>为了比较转染水平相似的细胞之间的 CD3 表达，应基于表达相似高水平荧光报告分子的细胞进行分析设门（CD3 复合物使用 GFP，TCR 表达载体使用 Ametrine）。理想情况下，分析应设门于 GFP+Ametrine+ 细胞，且其荧光强度位于前 10% 范围内4 至 105 荧光强度（图3A). 
	注意：转染嵌合构建体的细胞中 CD3 表达水平应与对照小鼠（原始模板）载体相当图3A）。生成的TCR逆转录病毒载体可与 体内 表达系统，如先前所述4.</li>
</ol>

<ol><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li>
<li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+fate+and+intense+debate%3A+myths%2C+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li>
<li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+naive+CD4%2B+T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li>
<li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li>
<li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated%2C+cell-autonomous+event%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li>
<li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li>
<li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+%27self-cleaving%27+2A+peptide-based+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+retrogenic+mice%3A+a+rapid%2C+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li>
<li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了一种高效的单细胞TCR扩增方法，并随后将成对的TCR α链和β链亚克隆至一种模板逆转录病毒表达载体中。尽管目前已开发出多种单细胞PCR方案，但迄今为止尚无一种方法可直接与表达载体的亚克隆兼容。在大多数情况下，仅扩增包含高度可变CDR3区的部分序列，其长度足以推断出可变区序列。这种较小的PCR产物有助于提高PCR效率，但后续功能研究需要进行de novo TCR基因合成。本方案在保持先前发表的以CDR3为重点的单细胞TCR测序方法高效性的同时，能够获得更长的扩增子，其中包含完整的可变区序列，适用于直接克隆。因此，该系统在提供定量序列信息的同时，也具备更高的灵活性和功能性输出能力。
根据所研究的科学问题，分析的T细胞来源和特异性可能有所不同。然而，如果项目最终目标是分析体内 TCR功能，则必须明确分离所得T细胞的HLA限制性。本实验方案专门设计为适用于HLA人源化小鼠中体内 TCR表达。目前已成功构建多种此类小鼠，且已有商业化产品，包括HLA-A2.1、HLA-DQ8（HLA-DQA1*301, HLA-D...

T细胞受体（TCR）决定了T细胞在发育过程、稳态/稳态维持以及外周抗原刺激期间的命运决定1,2,3。近年来深度测序技术的快速发展揭示了抗原特异性T细胞应答中先前被低估的TCR多样性。TCR多样性提示T细胞应答在功能上具有广泛的潜力。为了将TCR序列库分析与TCR功能检测相结合，测序策略应设计为与后续用于特定TCR功能分析的实验系统和体内模型相兼容。我们开发了一种高效的人源TCR序列分离方法，并可高效地亚克隆至一种嵌合人/鼠TCR载体模板中，该载体适用于在HLA人源化小鼠中表达TCR4。分离异源二聚体TCR对应的α链和β链需要从单个细胞中同时扩增两条链。尽管已有多种单细胞TCR克隆方案被开发并应用，但迄今为止尚无一种方法能简便地与高通量、高效、直接将未知Vα/Vβ TCR克隆至逆转录病毒载体的流程兼容，而此类载体是实现TCR在体内重新表达所必需的4,5,6,7。以往研究主要采用两种策略：其一是选择性扩增TCR的有限区域，足以推断其完整序列；其二是扩增完整的TCR序列4,5,6,7。通过第一种方法获得TCR序列后，其下游功能分析需要昂贵的计算机辅助组装和从头合成TCR。而第二种方法虽可提供完整的TCR序列，但人源恒定区与在小鼠模型中进行克隆TCR的体内表达不兼容。我们的方法专门设计用于与小鼠模型中TCR的体内功能分析相兼容。我们开发了一种高效且流程化的单细胞PCR方案，可将PCR产物直接亚克隆至表达载体模板中。
我们的方法采用了一种高灵敏度的两步多重嵌套PCR反应。在第一步多重反应中，使用一组包含40种特异性针对所有V-β链的引物和另一组包含44种特异性针对所有V-α链的引物，在无需预先知道序列的情况下扩增TCR-α或TCR-β（表1）。正向引物包含一个接头序列，该序列会被整合到PCR产物的5'端。反向引物则基于TCR的恒定区设计。我们已鉴定出在人类可变区或连接区TCR中均不存在的独特限制性酶切位点，并将这些位点整合到新设计的TCRα和TCRβ引物中（图1）。在第二步嵌套反应中，使用针对接头序列的特异性引物以及位于恒定区内的嵌套反向引物，进一步扩增TCR链，从而提高特异性（表1，图1）。在完成单细胞分离后，经过两轮PCR反应（第一轮使用Vα和Vβ引物混合物，第二轮使用接头引物），可获得可直接亚克隆至逆转录病毒载体模板中的PCR产物。最终的TCR构建体将在一个开放阅读框（ORF）内编码人可变区与鼠恒定区的组合，并通过“自剪切”蛋白序列P2A连接（hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ）8。P2A序列已在多个系统中被广泛应用，并已针对TCR表达进行了广泛验证8,9,10,11。尽管翻译后大部分P2A序列仍通过柔性连接子附着于α链的C末端，而β链信号序列额外含有一个脯氨酸，但该修饰对TCR功能无不利影响。构建体中使用鼠源恒定区而非人源，是为了避免在小鼠细胞中重新表达时与下游信号组分发生潜在的异常相互作用。该单一ORF可实现α链和β链的化学计量比独立表达9,11。本方案基于广泛可获取的试剂和方法，设计为高效、简化的操作流程。尽管我们已专门将该技术用于检测与自身免疫性糖尿病相关的自身反应性T细胞中的TCR，但我们预期该方案也可广泛适用于识别和功能评估针对自身免疫表位、肿瘤表位或病原体及疫苗应答的特异性人类TCR。

<table><tbody><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>抗人 CD4（OKT4）BV421</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗人 CD3（OKT3）PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 AF647</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>重组RNA酶抑制剂 生物技术级 2.5KU&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 高容量 cDNA 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U（RT酶）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O：无核酸酶水 1000 mL</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA聚合酶 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96孔半裙边PCR板</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 透明粘性封膜&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U（插入片段）30 U（载体）</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U（插入片段）80 U（载体）</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U（插入片段）80 U（载体）</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U（插入片段）80 U（载体）</td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶（CIP）</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>快速连接酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus 质粒小提 DNA 纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus 中量质粒DNA纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-25 试剂盒</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-5 试剂盒</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>DH5α 感受态细胞的亚克隆效率&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 转染试剂 1 mL（转染试剂）</td><td>Mirus&amp;nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II（分选仪）</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa（流式细胞仪）</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

简化单细胞tcr分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类tcr的表达

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

尽管目前已开发出多种用于从单个T细胞中测序配对的T细胞受体（TCR）α链和β链的方法，但迄今为止尚无一种方法能够有效支持TCR异源二聚体的下游体内功能分析。我们建立了一种基于两步多重嵌套PCR的改进方案，可扩增出覆盖人TCR α链和β链完整可变区的PCR产物。通过识别特异的限制性酶切位点并将这些位点引入PCR引物中，我们使PCR产物能够直接亚克隆至慢病毒载体模板中。所获得的慢病毒载体编码一种带有小鼠胞内区的嵌合型人/小鼠TCR，可在小鼠细胞或体内小鼠模型中发挥功能。总体而言，本文所述方案将人源单细胞配对TCR α链和β链的鉴定与高效构建慢病毒表达载体相结合，所获载体可便捷地用于体外和体内TCR表达研究。本视频及配套材料旨在对单细胞PCR过程提供极为详尽的说明，以便准确执行关键步骤并避免潜在问题。此外，我们还详细描述了构建表达载体所需的克隆步骤。一旦掌握，整个流程从单细胞分选到TCR表达可在短短两周内完成。

在步骤 3.2.7 中通过将第二次反应的 5µL 产物在琼脂糖凝胶上电泳来检测多重巢式 PCR 反应的效率（图 2）。通常，TCR-beta 扩增的效率预计约为 80%，而 TCR-alpha 反应的效率通常较低，约为 50%4。只有成对的 TCR-alpha 和 TCR-beta 链可用于 TCR 表达；然而，所有 PCR 产物均可进行测序，以获得 TCR 序列及免疫组库信息。
基因沉默将使得单个T细胞仅表达一条TCR-β链。然而，T细胞仍可能重排第二条TCR-α链，约25%的T细胞会表达第二条同相框的TCR-α链14。因此，预期分离获得的部分TCR-α链可能是次级α链，而非“正确”的α链。次级α链通常与TCR-β链并非最佳结合伙伴；因此，并非所有克隆获得的TCR都能形成稳定的复合物并在细胞表面表...

当前方案结合了单细胞配对的人类 T 细胞受体 α 和 β 链测序与简化流程的逆转录病毒载体构建，该载体具有兼容性 体外 和 体内 TCR 表达

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

尽管已开发出多种从单个T细胞中测序配对的T细胞受体（TCR）α链和β链的方法，但迄今为止尚无一种方法能够……

该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如抗原特异性细胞群的TCR α和β库，以及人源TCR在体内的功能。该技术的主要优势在于PCR反应具有相对较高的效率，并且可与后续的TCR克隆步骤兼容。本方案采用两步PCR法，在无需预先了解TCR序列的情况下，从单个细胞中扩增TCR α和β链。第一轮PCR为多重反应，使用一组针对α或β可变区的特异性引物混合物，并结合一个针对恒定区的特异性引物。第二轮PCR为嵌套式扩增反应，其引物结合于PCR产物5'端引入的接头序列以及恒定区内部序列。这些引物还在PCR产物的5'端和3'端引入了独特的限制性酶切位点，以便后续克隆操作。一旦将编码的TCR序列克隆至载体模板中，该序列即形成嵌合结构，包含人源可变区及对应的恒定区。这种嵌合型TCR结构可介导TCR与对应CD3信号复合物之间的相互作用，从而使本TCR克隆方案适用于后续在对应细胞系及人源化小鼠模型中的功能研究。为进行单细胞分选，需在洁净、无模板污染的区域预先配制反转录试剂。通常，初次接触单细胞 PCR 方法的研究人员会因模板量过低而遇到困难。另一方面，多重巢式 PCR 对模板污染极为敏感，即使污染量很低也可能产生影响。因此，必须彻底清洁用于配制 PCR 反应的实验区域。本反应中使用三种针对α链和β链恒定区的特异性反向引物混合物。通过在移液槽中混合试剂来配制反转录预混液。为补偿移液误差，应制备足够用于十个额外孔的反应混合液。使用多通道移液器向96孔PCR板的每个孔中加入6 µL。用封板膜轻轻覆盖板子，并将板子置于冰上。通过用细胞表面标志物抗体对细胞进行染色，制备用于单细胞分选的T细胞。将T细胞分选至每孔一个细胞，同时留空第十二行作为阴性对照。用封板膜密封后，在4°C、1000×g条件下离心5分钟。立即进行逆转录反应。如果可能，尽量在同一天进行第一次 PCR 反应。为了运行多重反应，分别在移液槽中混合 V alpha 和 V beta PCR 主混合液。将含有 cDNA 的板置于冰上或冷块上。将22.5微升TCR beta反应液转移至新的96孔PCR板中。然后使用多通道移液器将2.5微升cDNA转移至该PCR板中。使用多通道移液器将22.5微升TCR alpha反应液直接加入含有剩余cDNA的孔板中。用封板膜密封，轻轻涡旋混匀，短暂离心。进行第一次PCR反应。反应板可保存在20摄氏度。第二天，准备第二次巢式 PCR 反应。使用多通道移液器，将 TCR α 和 TCR β 反应的预混液分别加入两个新的 96 孔 PCR 板中，每孔 22.5 µL。每孔加入 2.5 µL 多重 PCR 反应模板。密封反应板，轻轻涡旋混匀，并短暂离心。剩余的第一轮PCR反应产物应密封后于20摄氏度保存，作为备用模板来源。进行第二轮PCR反应。第二次巢式PCR反应完成后，取5 µL反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。需包含阳性对照和阴性对照孔。预期条带大小约为500个碱基对。使用96孔板格式的PCR纯化试剂盒纯化第二次反应的剩余部分，即20微升，并进行Sanger测序。所获得的TCR序列可利用在线可用的免疫遗传学软件进行分析。序列信息可用于评估T细胞群体的多样性及克隆性。成对的TCR α和β序列可用于进一步的功能分析。将TCR β和TCR α依次连接至模板载体中。模板中的TCR β和TCR α将被PCR扩增的链所替换。在第一次连接反应中，将模板TCR β链替换为PCR扩增的β链。在通过测序和限制性酶切验证TCR β链成功插入后，将模板TCR α链替换为PCR扩增的α链。使用HEK293T细胞检测TCR链的正确配对及细胞表面表达情况。将HEK293T细胞共转染携带amarine荧光报告基因标记的TCR载体和编码由GFP标记的CD3复合物的载体。通过使用抗小鼠CD3抗体对细胞进行染色，并利用流式细胞术检测嵌合TCR在细胞表面的表达。转染嵌合TCR构建体的细胞中表面CD3表达水平应与转染完全镜像对照模板载体的细胞相当。综上所述，我们描述了一种高效的基于PCR的方法，用于从单个细胞中鉴定和克隆成对的T细胞受体链。我们预计该方法将成为研究人类T细胞在自身免疫、肿瘤监视以及病原体清除中应答的重要工具。本文所述PCR方法的主要优势在于其与后续体外和体内研究的兼容性。

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外和体内表达人类 TCRs

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内...

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de...

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

我们介绍一种将引导RNA通过逆转录病毒转导至Cas9转基因小鼠原代T细胞的实验方案，为研究Th17细胞分化过程中的基因编辑提供了一种高效的替代方法。...

逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。...

高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究G蛋白偶联受体介导的T细胞在多种组织微环境中的定位

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

本方案描述了原代T细胞培养的关键步骤，包括其分离、活化、扩增以及通过mRNA电穿孔进行的瞬时转染。此外，还提出了一套用于流式细胞术分析表型、活化标志物、细胞活力以及嵌合抗原受体（CAR）表达的实验流程和抗体组合。...

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

学习从单细胞中高效扩增TCR α和β链的两步PCR方法，用于免疫学研究和TCR克隆。该技术无需预先知道TCR序列，兼容后续体外和体内功能研究，为分析抗原特异性T细胞群体的TCR库和体内功能提供可靠工具。

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建体外和在体内人类TCR的表达

探索更多视频

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

探索更多视频

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建体外和在体内人类TCR的表达