简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如抗原特异性细胞群的TCR α和β库，以及人源TCR在体内的功能。该技术的主要优势在于PCR反应具有相对较高的效率，并且可与后续的TCR克隆步骤兼容。本方案采用两步PCR法，在无需预先了解TCR序列的情况下，从单个细胞中扩增TCR α和β链。

第一轮PCR为多重反应，使用一组针对α或β可变区的特异性引物混合物，并结合一个针对恒定区的特异性引物。第二轮PCR为嵌套式扩增反应，其引物结合于PCR产物5'端引入的接头序列以及恒定区内部序列。这些引物还在PCR产物的5'端和3'端引入了独特的限制性酶切位点，以便后续克隆操作。

一旦将编码的TCR序列克隆至载体模板中，该序列即形成嵌合结构，包含人源可变区及对应的恒定区。这种嵌合型TCR结构可介导TCR与对应CD3信号复合物之间的相互作用，从而使本TCR克隆方案适用于后续在对应细胞系及人源化小鼠模型中的功能研究。为进行单细胞分选，需在洁净、无模板污染的区域预先配制反转录试剂。

通常，初次接触单细胞 PCR 方法的研究人员会因模板量过低而遇到困难。另一方面，多重巢式 PCR 对模板污染极为敏感，即使污染量很低也可能产生影响。因此，必须彻底清洁用于配制 PCR 反应的实验区域。

本反应中使用三种针对α链和β链恒定区的特异性反向引物混合物。通过在移液槽中混合试剂来配制反转录预混液。为补偿移液误差，应制备足够用于十个额外孔的反应混合液。

使用多通道移液器向96孔PCR板的每个孔中加入6 µL。用封板膜轻轻覆盖板子，并将板子置于冰上。通过用细胞表面标志物抗体对细胞进行染色，制备用于单细胞分选的T细胞。

将T细胞分选至每孔一个细胞，同时留空第十二行作为阴性对照。用封板膜密封后，在4°C、1000×g条件下离心5分钟。立即进行逆转录反应。

如果可能，尽量在同一天进行第一次 PCR 反应。为了运行多重反应，分别在移液槽中混合 V alpha 和 V beta PCR 主混合液。将含有 cDNA 的板置于冰上或冷块上。

将22.5微升TCR beta反应液转移至新的96孔PCR板中。然后使用多通道移液器将2.5微升cDNA转移至该PCR板中。使用多通道移液器将22.5微升TCR alpha反应液直接加入含有剩余cDNA的孔板中。

用封板膜密封，轻轻涡旋混匀，短暂离心。进行第一次PCR反应。反应板可保存在20摄氏度。

第二天，准备第二次巢式 PCR 反应。使用多通道移液器，将 TCR α 和 TCR β 反应的预混液分别加入两个新的 96 孔 PCR 板中，每孔 22.5 µL。每孔加入 2.5 µL 多重 PCR 反应模板。

密封反应板，轻轻涡旋混匀，并短暂离心。剩余的第一轮PCR反应产物应密封后于20摄氏度保存，作为备用模板来源。进行第二轮PCR反应。

第二次巢式PCR反应完成后，取5 µL反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。需包含阳性对照和阴性对照孔。预期条带大小约为500个碱基对。

使用96孔板格式的PCR纯化试剂盒纯化第二次反应的剩余部分，即20微升，并进行Sanger测序。所获得的TCR序列可利用在线可用的免疫遗传学软件进行分析。序列信息可用于评估T细胞群体的多样性及克隆性。

成对的TCR α和β序列可用于进一步的功能分析。将TCR β和TCR α依次连接至模板载体中。模板中的TCR β和TCR α将被PCR扩增的链所替换。

在第一次连接反应中，将模板TCR β链替换为PCR扩增的β链。在通过测序和限制性酶切验证TCR β链成功插入后，将模板TCR α链替换为PCR扩增的α链。使用HEK293T细胞检测TCR链的正确配对及细胞表面表达情况。

将HEK293T细胞共转染携带amarine荧光报告基因标记的TCR载体和编码由GFP标记的CD3复合物的载体。通过使用抗小鼠CD3抗体对细胞进行染色，并利用流式细胞术检测嵌合TCR在细胞表面的表达。转染嵌合TCR构建体的细胞中表面CD3表达水平应与转染完全镜像对照模板载体的细胞相当。

综上所述，我们描述了一种高效的基于PCR的方法，用于从单个细胞中鉴定和克隆成对的T细胞受体链。我们预计该方法将成为研究人类T细胞在自身免疫、肿瘤监视以及病原体清除中应答的重要工具。本文所述PCR方法的主要优势在于其与后续体外和体内研究的兼容性。