Name: 从美国牛蛙的小囊（毛细胞的生理准备牛蛙） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习制备美国牛蛙小囊用于毛细胞生物物理学研究的方法。本技术展示如何精细解剖内耳器官并保持毛细胞完整性，为感觉神经科学研究提供数小时的健康细胞实验窗口。

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作者谨此感谢 A. J. Hudspeth 博士为本论文所述实验方案的建立所提供的资金支持与专业指导。我们还要感谢 Brian Fabella 在本实验方案所用大量定制设备和软件的开发与维护方面做出的贡献。
J. B. A. 由美国国立卫生研究院资助项目 F30DC014215 支持，J. D. S. 由资助项目 F30DC013468 支持，J. B. A. 和 J. D. S. 均由资助项目 T32GM07739 支持。

伦理声明：所有实验程序均经洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验前准备
<ol>
	<li>溶液
	<ol>
		<li>制备丁香酚溶液（2.5 g·L-1·kg-1 蛙）。制备生理盐水溶液（表1）。 
		注意：对于单室制备，需配制人工外淋巴液；对于双室制备，需同时配制人工外淋巴液和人工内淋巴液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验工具
<ol>
	<li>玻璃刺激纤维的制备
	<ol>
		<li>使用电极拉制仪，以高温和高速进行单步拉制，将硼硅酸盐玻璃毛细管拉细。将拉制后的毛细管装入电磁驱动的拉制装置中。</li>
		<li>将毛细管尖端移向带有熔融玻璃珠的灯丝，直至毛细管接触玻璃珠。</li>
		<li>开启灯丝，使毛细管尖端熔入玻璃珠。当毛细管与玻璃珠之间形成细小的玻璃桥时，关闭灯丝，同时启动电磁拉制装置。 
		注意：这将使玻璃毛细管沿其长轴垂直方向被拉出，形成一根实心纤维。</li>
		<li>确保纤维直径不超过 0.5 - 1 µm，长度不超过 100 - 300 µm。若纤维过长，使用虹膜剪刀修剪。应使用已钝化的剪刀，以避免损坏解剖工具。</li>
		<li>为增强光学对比度，对纤维进行溅射镀膜。使用金-钯源的溅射镀膜仪。将每根纤维垂直装入溅射镀膜仪中，使其锥形端朝向镀膜源。使纤维尖端与金-钯源之间的距离保持在 1 - 2 cm。</li>
		<li>关闭溅射镀膜仪腔室以形成密封，并启动设备。反复用氩气冲洗腔室内的环境空气。冲洗完毕后，将腔室内压力降至 10 Pa (70 mTorr)。</li>
		<li>以 10 秒脉冲、10 秒间隔的方式，持续 120 秒进行溅射镀膜。 
		注意：若溅射镀膜成功，纤维尖端在整个过程中会逐渐变暗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尖锐微电极的制备
	<ol>
		<li>使用高温单步拉制法拉制带有内丝的玻璃毛细管。当填充 3 M KCl 时，电极电阻应为 100 - 300 MΩ。每个电极均需填充 3 M KCl。</li>
		<li>使用微电极成型仪将每个电极的尖端弯折，使其安装在放大器头级时，与毛细胞顶面垂直16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子电渗给药移液管的制备
	<ol>
		<li>将带有内丝的玻璃毛细管拉制成 50 MΩ 尖端。填充高浓度溶质（例如，500 mM 硫酸庆大霉素）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>铝制固定方片的制备
	<ol>
		<li>裁剪一块 1 cm × 1 cm 的铝箔。用毁髓针或其他尖锐物体在铝箔中心穿孔。将穿孔修整为圆形，直径约为 1 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>真空脂填充注射器的制备
	<ol>
		<li>从 5 mL 注射器中取出活塞。从后端向注射器内填充真空脂。重新装回活塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚四氟乙烯胶粘剂涂布器的制备
	<ol>
		<li>在木质涂布棒末端做一条 2 mm 长的轴向切口。从端面观察时，切口应位于涂布棒中心。</li>
		<li>使用锋利剪刀或刀片，从 1 mm 厚的聚四氟乙烯片材上切割出一块 2 mm × 4 mm 的矩形片。</li>
		<li>使用刀片将聚四氟乙烯矩形片的一条 2 mm 长边削薄。从矩形片中部开始，向外切削，使该边形成斜面。</li>
		<li>将聚四氟乙烯矩形片插入木质涂布棒的切口中，使斜面朝外远离木棒。在聚四氟乙烯矩形片基部涂抹 5 分钟&#160;环氧树脂以固定其位置。在室温下静置 1 小时，使胶粘剂完全固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双室固定装置下半部分的制备
	<ol>
		<li>加工或 3D 打印双室固定装置的下半部分（补充文件 2）。确认腔室下表面直径为 20 mm 的凹陷圆区域。</li>
		<li>在凹陷圆周向外 3 mm 范围内涂一层薄薄的环氧树脂。在其上放置一个 18 mm 圆形玻璃盖玻片。让环氧树脂固化 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 内耳器官的提取
<ol>
	<li>将一只美国牛蛙放入盛有丁香酚麻醉液的小桶中，麻醉10分钟。调整溶液的体积，使牛蛙的肱肩关节恰好位于液面之上。</li>
	<li>通过双重毁髓法处死已麻醉的牛蛙。
	<ol>
		<li>用一根手指按住麻醉青蛙的鼻部上方，另一根手指置于其下颌下方，将青蛙头部向前旋转。</li>
		<li>迅速将毁髓针经枕骨大孔插入蛙的颅腔，枕骨大孔位于蛙枕骨突起中线处。</li>
		<li>缓慢撤出并旋转探针，直至其尖端离开枕骨大孔。将探针向尾端推进，穿过椎间孔以破坏脊髓。</li>
		<li>通过观察蛙的下肢是否伸直，确认其已正确进行双重毁髓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用拇指按住蛙鼻背部，食指抓住犁骨齿以增强稳定性。通过双侧切断颞下颌关节使蛙断头，随后沿与头尾轴垂直的方向进行切割。为确保颅内耳器官保持完整，切割位置应位于两侧鼓膜的尾侧。</li>
	<li>使用体视解剖显微镜，从犁骨齿处开始沿中线切开腭部组织，直至组织最尾端图1A).</li>
	<li>用手术刀进行水平切割，切断并清除腭部组织下方的所有肌肉，以暴露后方的软骨。去除肌肉后，观察呈棒棒糖形状的耳颞软骨，该软骨构成耳囊的边界。</li>
	<li>切断柱状软骨与耳囊软骨接触处。</li>
	<li>反复通过浅层水平切割，逐层削去该软骨的薄层。避免深部切割，以防损伤内耳器官。此操作可暴露位于颞骨软骨棒状结构内的耳囊图1B）。耳囊内包含青蛙的内耳器官（图1C).</li>
	<li>修剪耳囊的后缘和侧缘，注意不要损伤内耳器官。解剖过程中应频繁用生理盐水冲洗内耳器官，确保其始终浸没并保持湿润。</li>
	<li>在颞骨上找到软骨与中线内侧连接处的两个圆形开口。沿最内侧的开口向下剪开，以击穿颞骨。</li>
	<li>在耳囊的后外侧边缘进行第二次向下的切割。移除本次切割与前次切割之间的软骨片，以暴露内耳器官。</li>
	<li>撬开步骤3.8和3.9切口之间的软骨，并将其从耳囊上分离。此操作将切断最近的半规管，随后可利用该结构作为进一步操作的抓手。</li>
	<li>在不接触球囊的前提下，切断第八对脑神经th 脑神经</li>
	<li>握住最邻近的半规管壶腹。轻柔地旋转内耳以暴露其余两个半规管。每暴露一个半规管后，将其切断。</li>
	<li>握住神经或半规管壶腹，将内耳从头部取出并置于盛有冰冷含氧人工外淋巴液的培养皿中。移除内耳后，可观察到颞骨中曾容纳半规管通过的通道。图1D). 
	注意：重复上述步骤以提取第二只耳。</li>
</ol>
4. 单室制备
<ol>
	<li>囊斑的分离
	<ol>
		<li>通过识别囊斑上大量的白色耳石团及其上方的囊斑神经来定位囊斑（图1E）。在后续操作中需小心避免对囊斑造成物理性损伤，以保持囊斑毛细胞的完整性。</li>
		<li>修剪半规管，使内耳更易于操作。</li>
		<li>去除覆盖在囊斑神经面的外淋巴囊。在外淋巴囊周围轻轻剪开其边缘，随后切断连接外淋巴囊膜与囊斑神经面之间的小组织柱。</li>
		<li>移除球囊（lagena）及其伴随的神经。</li>
		<li>捏住囊斑神经，轻轻提起囊斑，并剪开耳石囊的薄层膜结构。当耳石从囊中溢出时，沿囊斑边缘剪切，将其完全游离。 
		注：分离囊斑后，如需要可保存其余的内耳器官。移除囊斑有助于更清晰地识别其他结构，例如两栖类听斑和基底乳头。</li>
		<li>使用剪刀或镊子小心擦去附着在囊斑表面的残留耳石。操作过程中注意不要触碰囊斑本身。</li>
		<li>修剪囊斑边缘残留的耳石囊膜。该膜容易粘附于塑料和玻璃表面，去除后可减少组织操作中的困难。</li>
		<li>用巴斯德移液管轻轻将生理盐水冲洗过囊斑表面，以清除任何残留的耳石（图1F）。 
		注：对第二个囊斑重复此操作，其结构为第一个的镜像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化与装片
	<ol>
		<li>使用尖端已折断的巴斯德移液管的尾部，将分离出的囊斑转移至含有3 mL人工外淋巴液、并添加67 mg∙L-1蛋白酶XXIV的培养皿中。 
		注：该蛋白酶处理可降解每个动纤毛球与耳石膜之间的连接结构，从而在不损伤感觉毛细胞束的前提下实现耳石膜的去除。</li>
		<li>在22 °C下孵育30分钟（或在21 °C下孵育35分钟）。将消化后的每个囊斑转移至开放式实验腔室，并用磁性固定针固定组织。</li>
		<li>囊斑斑（saccular macula）位于耳石膜正下方，是囊斑中包含毛细胞的功能区域。识别该区域后，使用细睫毛小心去除其上方覆盖的耳石膜，注意避免接触囊斑斑本身。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 双室制备
<ol>
	<li>囊斑的分离
	<ol>
		<li>按照第4.1节的方法从内耳器官中分离囊斑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与消化
	<ol>
		<li>用人工外淋巴液填充固定块（补充文件3），将带孔的铝箔置于其中一个开口上，并用两小滴真空脂固定铝箔位置，形成较弱的密封。</li>
		<li>将一个囊斑转移至铝箔上，使其位于孔的正上方，斑面朝下，神经残端朝上。</li>
		<li>用拧成条状的纸巾吸除囊斑周围的生理盐水。用纸巾吸干铝箔方块表面、囊斑周围区域的液体。</li>
		<li>使用聚四氟乙烯涂布器将氰基丙烯酸酯胶水涂抹于囊斑边缘与铝箔方块交界处，形成紧密密封。确保囊斑的整个周长均被胶水覆盖。 
		注意：操作过慢会导致氰基丙烯酸酯胶水蔓延至囊斑的神经面并最终将其覆盖，因此必须迅速完成此步骤。</li>
		<li>在已固定的组织上方滴加一滴生理盐水以固化胶水。生理盐水滴表面可能形成一层薄薄的胶膜，需用镊子将其移除。</li>
		<li>小心地将铝箔从固定块上取下。将已固定的组织翻转，使囊斑的斑面朝上，并将其漂浮于盛有人工外淋巴液的培养皿中。</li>
		<li>在斑面顶部滴加一滴蛋白酶XXIV溶液，在22 °C下孵育30分钟（或在21 °C下孵育35分钟）。用外淋巴液填充双室装置的下层腔室（补充文件2），并在中央腔室周围涂抹真空脂。</li>
		<li>将固定在铝箔上的囊斑置于下层腔室上，使神经面朝向腔室表面。在铝箔边缘周围涂抹真空脂。</li>
		<li>将制备好的上层腔室（补充文件1）放置在铝箔上，注意利用真空脂形成完全密封。向上层腔室中加入通入气泡的人工内淋巴液，并用睫毛小心去除耳石膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Adult+Mouse+Utricle+and+Adenovirus-mediated+Supporting-cell+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).</li>
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<li>Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+hair+cell%27s+transduction+channels+at+the+hair+bundle%27s+top+by+iontophoretic+application+of+a+channel+blocker%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker.</a> Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).</li>
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<li>Martin, P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hair-bundle+movements+can+amplify+a+hair+cell%27s+response+to+oscillatory+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).</li>
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<li>Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Oscillation+by+Hair+Bundles+of+the+Bullfrog%27s+Sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus.</a> Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. , (1988).</li>
<li>Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+electrical+resonance+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging electrical resonance in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).</li>
<li>Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-selective+exocytosis+by+ribbon+synapses+of+hair+cells+in+the+bullfrog%27s+amphibian+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).</li>
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<li>Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation+by+mammalian+hair+bundles+supports+a+role+in+cochlear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification.</a> Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).</li>
<li>van Netten, S. M., Khanna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+changes+of+the+cupula+associated+with+the+mechanics+of+hair+cells+in+the+fish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).</li>
<li>Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+channels%27+gating+can+control+friction+on+vibrating+hair-cell+bundles+in+the+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actions+of+calcium+on+the+mechano-electrical+transducer+current+of+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 369-398 (1991).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

在牛蛙的球囊内有数千个易于获取的感觉毛细胞。本文展示了用于单室和双室记录的球囊提取与制备方法。这两种制备方式均可用于对毛细胞及其附属毛束进行微机械和电生理研究。由于组织在频繁更换含氧生理盐水中可存活数小时，实验可维持较长时间。在这些制备样本中，毛细胞通常在解剖后6小时内仍保持适合微电极记录的活性，而毛束在提取后可持续自发振荡达24小时。
成功提取并固定囊斑依赖于克服若干常见挑战。首先，在整个制备过程中应避免直接接触囊斑上皮的顶端表面。囊斑神经可作为安全操作囊斑的便利抓手。一旦从内耳其他器官中分离出来，应使用大口径移液管在液体中转移囊斑，以避免对其感觉上皮造成机械损伤。去除斑块表面耳石时，必须避免对毛细胞造成机械损伤。由于耳石直接位于斑块上方，在去除耳石时，若解剖工具与耳石膜发生意外接触，可能损伤毛细胞。为避免损伤，建议在远离斑块的位置夹持耳石的凝胶状团块，并将其整体移除，从而避免耳石团块碎裂为多个小簇而需逐一取出。若仍有少量耳石簇残留，可用巴斯德移液管施加轻柔的液流压力予以清除。最后一个挑战是在双室记录装置中实现囊斑与铝制固定框之间的严密密封。使用一个穿孔较小的铝框，使囊斑与周围铝框之间产生约100 μm的重叠区域，有助于实现组织的完全密封。胶水应与斑块周围约100 μm范围的囊斑组织接触，以形成紧密密封。
游离 Ca 的浓度2+ 是毛细胞研究中的一个重要考虑因素。Ca2+ 同时调控快速和慢速适应过程，从而决定机械转导装置的动力学特性以及毛束主动过程现象的特征，包括毛束的自发运动8,23内淋巴钙 在体内 存在于250 μM浓度下，因此该浓度下测得的动力学参数最具生理相关性（Maunsell J. H. R.，R. Jacobs，和 A. J. Hudspeth。未发表观察结果）16）。然而，毛细胞的微电极记录需要外部钙浓度超过 2 mM，才能在微电极周围实现细胞膜的良好封接。因此，此类实验必须使用高钙任氏液。最后，研究者可能希望利用不同浓度的钙来探究外部钙对机械转导的影响。在此类实验中，需注意钙浓度低于 1 μM 时通常会导致顶连接断裂，并造成转导功能的不可逆丧失。28.
本文所述的两种实验制备方法可用于对毛细胞进行多种生物物理测量。然而，通过对这些制备方法进行轻微改进，还可实现更多类型的测量。在折叠状囊斑制备方法中，毛细胞束从侧方被观察。从此视角成像毛细胞束的运动，可揭示短动纤毛和长动纤毛的协调运动29。在此方法中，首先将囊斑感觉上皮从其下方组织分离，随后沿囊斑神经所定义的轴线进行折叠，使毛细胞束朝外，并在折痕处从侧方进行观察。第二种改进方法是毛细胞分离法，可同时用于研究毛细胞的纤毛束及其胞体。通过机械分离将毛细胞置于玻片上，用于成像和电生理记录30。最后，还可采用类似分离方案但省去机械分离步骤，使毛细胞从上皮中逐渐挤出。该处理方式可在尽量减少机械损伤的同时，暴露毛细胞的基底外侧区域，便于进行电生理记录。这些制备方法及其多种变体，充分展示了青蛙囊斑作为感觉毛细胞生物物理研究模型系统的多样性与灵活性。

哺乳动物的听侧器具有复杂的结构，并位于难以接近的解剖学区域。例如，哺乳动物耳蜗呈螺旋状迷路结构，深埋于致密的颞骨之中。分离耳蜗的过程常常会对其中的感觉细胞造成机械性损伤，因此一直是一项具有挑战性的操作1。神经科学家因而转向更容易从耳部结构中获取的模式系统进行研究。
在这些模型系统中，美国牛蛙（Rana catesbeiana）的囊斑数十年来为听觉和前庭系统的功能研究提供了普遍适用的见解。囊斑是一种具有多重功能的器官，在低频听觉和地震感知中均发挥感觉作用。囊斑的感觉细胞是毛细胞，这类特化的换能器可将机械能转化为听觉和前庭器官中的电信号。每个毛细胞的顶端表面伸出一个机械敏感性的毛束，由一束梯度排列、增大的微绒毛（称为静纤毛）组成。相邻静纤毛的顶端通过丝状的顶端连接蛋白相互连接，这些蛋白可在机械刺激作用下机械性地调控离子通道的开闭2,3。尽管听觉和前庭器官响应不同类型的刺激，但它们共享一种共同的检测机制。这种共性使得通过研究牛蛙囊斑获得了大量关于毛细胞机械转导的深刻认识。例如，该器官已被广泛用于研究毛细胞的主动过程4,5,6,7，其中毛束利用消耗能量的过程产生机械功。研究表明，毛细胞不仅能够产生主动机械功6，而且通过对牛蛙侧线听觉器官的研究，还揭示了主动过程及其毛细胞调谐特性的不同机制。这些机制包括囊斑中的主动毛束运动8和毛细胞的电共振9,10,11，以及两栖类乳头中毛细胞带状突触的频率选择性12。
美洲牛蛙的球囊因多种原因而受到感觉神经科学家的青睐。首先，与哺乳动物的耳蜗不同，该器官位于易于接触的耳囊内。其次，在适当条件下，该器官内的毛细胞可保持数小时的健康状态13,14，这使得相对于哺乳动物的毛细胞，可在更长的时间尺度上进行实验操作。第三，该器官弯曲度很小，便于操作。第四，每个器官包含上千个甚至更多的毛细胞15，既提供了高通量，也大大增加了在特定实验中找到合适毛细胞群的概率。最后，由于该器官较薄且毛细胞体积较大，美洲牛蛙的球囊易于观察。
这些特性为研究牛蛙囊斑中的感觉细胞提供了极大的灵活性。根据具体研究问题，可从囊斑制备多种不同的实验样本。其中最简单的是单室制备法，即将囊斑固定于一个充满人工外淋巴液的腔室中，该溶液为富含钠离子且高钙的盐溶液。此种制备方式可用于研究毛细胞电流及毛束基本力学特性。第二种配置为双室制备法，可用于研究毛束的自发运动。在此配置中，毛细胞的顶端侧暴露于一种称为人工内淋巴液的富钾低钙盐溶液中，而基底外侧则浸浴在人工外淋巴液中。这两个隔室模拟了 体内 盐溶液的排列方式，并提供一个允许毛细胞束自发振荡的环境。
本文介绍了用于感觉毛细胞生物物理研究的牛蛙壶腹的制备方法。我们首先详细描述了从牛蛙内耳中分离该器官的步骤，随后介绍了单室和双室两种实验装置的制备方法，并分别展示了每种配置下的代表性实验结果。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;两种制备方法通用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>金属毁髓针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管及吸头（x2）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>固定在皮下注射针头上的细睫毛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-557-172</td><td></td></tr><tr><td>道康宁真空润滑脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td></td></tr><tr><td>用于真空润滑脂的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿（x2 - 3）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97 或 P-2000</td><td></td></tr><tr><td>120 V 电磁阀拉制装置</td><td></td><td></td><td>自制，见零件清单</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Anatech USA</td><td>Hummer 6.2</td><td></td></tr><tr><td>离子电泳电流源</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>压电驱动器</td><td>Piezosystem Jena</td><td>P-150-00</td><td></td></tr><tr><td>压电驱动器放大器</td><td>Piezosystem Jena</td><td>ENV800</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;单室制备用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微电极放大器</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>可同时用于离子电泳和微电极记录</td></tr><tr><td>磁性固定针（x2）</td><td></td><td></td><td>自制，见零件清单</td></tr><tr><td>带磁性板的开放式腔室</td><td></td><td></td><td>自制，见零件清单</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;双室制备用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>上腔室</td><td></td><td></td><td>补充文件1</td></tr><tr><td>槽型下腔室</td><td></td><td></td><td>补充文件2</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>固定底座</td><td></td><td></td><td>补充文件3</td></tr><tr><td>木质涂药棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（Teflon）片</td><td>McMaster-Carr</td><td>8545K12</td><td>用于聚四氟乙烯涂药棒</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>实验室擦拭纸（Kimwipes）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>快干环氧树脂</td><td>McMaster-Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-546</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生理盐水成分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;&amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;自制设备零件清单&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电磁阀拉制装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>Guardian Electric</td><td>A420-065426-00</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>脚踏开关</td><td>Linemaster</td><td>T-51-SC36</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>移液管固定器</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH900R</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>粗调操纵器</td><td>Narishige Group</td><td>MM-3</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>铂丝</td><td>Alfa Aesar</td><td>25093</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>电源</td><td>Leica</td><td>Z050-261</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;磁性固定针&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>McMaster-Carr</td><td>7556A33</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>1 mm 厚铝板</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;开放式磁性腔室&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>柔性磁条</td><td>McMaster-Carr</td><td>5759K75</td><td>可使用其他来源</td></tr><tr><td>1 mm 厚铝板</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>可使用其他来源</td></tr></tbody></table>

美国牛蛙（rana catesbeiana）球囊毛细胞的生理学制备

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

听觉与平衡功能的研究依赖于从模式系统的生物物理研究中获得的见解。其中一种模式系统——美洲牛蛙的球囊，已成为听觉和前庭研究的主要模型。对这一器官的研究揭示了毛细胞如何主动感知来自环境的信号。基于这些研究，我们现在更深入地理解了毛细胞换能通道的机械门控机制与定位、钙离子在机械适应中的作用，以及毛细胞电流的特性。这一易于获取的器官持续为毛细胞的功能机制提供重要见解。本文中，我们描述了为开展毛细胞生物物理研究而制备牛蛙球囊的方法。我们包含了完整的解剖步骤，并针对特定实验条件提供了具体的球囊制备方案。此外，我们还展示了利用该制备方法获得的代表性结果，包括毛束瞬时力-位移关系的计算以及毛束自发振荡的测量。

牛蛙球囊的感觉上皮可用于多种构型，以研究毛细胞的生理特性。由于该组织相对平坦，因此可适用于单室和双室两种制备方式。单室构型为毛细胞的电生理和微机械记录提供了简单的实验装置；而双室构型则可在毛细胞的顶端和基底侧分别模拟内淋巴和外淋巴环境。这两种腔室共同为研究毛细胞的机械转导提供了符合生理条件的环境。
毛细胞的敏感性和换能特性决定了其对机械刺激的电反应。为了研究这些特性，我们同时记录了单个毛细胞的纤毛束位置及其感受器电位（图2）。首先，我们将一根柔韧的玻璃纤维连接到毛细胞纤毛束的动纤毛球部，以施加力脉冲。随后，使用双光电二极管系统2测量毛细胞纤毛束的位移（图2A）。同时，通过尖锐的微电极刺入细胞来记录毛细胞的电位。通过将每个机械刺激所引发的峰值电压反应与其对应的纤毛束位移作图，获得位移-反应曲线（图2B）。毛细胞的电反应在正向和负向位移的极值处均趋于饱和。负向位移导致膜电位减小，表明存在静息状态下的内向机械换能电流。该静息电流受到Ca2+对快速和慢速适应过程的调节17,18,19,20,21。
毛细胞的行为不仅取决于其电学特性，还取决于其感受毛束的微机械特性。双室结构模拟了内淋巴液与外淋巴液的分隔。 体内，为研究毛细胞束的力学特性提供了理想条件。在这些条件下，若去除耳石膜，毛细胞束可自发振荡。6. 此处我们采用双室制备法评估单个束的微机械特性。通过将毛束的影子投射到双光电二极管位移监测器上，记录其自发振荡图3). 为了评估氨基糖苷类抗生素庆大霉素对机械转导的作用，我们通过离子电泳将庆大霉素直接释放到毛束上（图3）。庆大霉素的释放浓度与通过微移液管的电流呈正比。庆大霉素可抑制毛束的振荡，并诱导毛束向其高侧产生静态偏移。这些效应反映了庆大霉素作为通道开放阻滞剂的作用，即在维持机械转导通道开放状态的同时阻塞其通透孔道。带电化学物质的离子电渗技术能够在无流体流动引起的机械干扰条件下，实现化学物质在不同浓度下的局部化与可量化释放，因此特别适用于毛束等机械敏感性细胞器的研究。22.
毛细胞束的自发运动源于适应性与非线性束刚度之间的相互作用7,8,23,24。这种自发运动是毛细胞束主动过程的特征，该过程将信号能量转化为机械功，以克服黏滞阻力。研究表明，毛细胞束在前庭系统2、听觉系统25以及侧线系统26中均表现出非线性的瞬时刚度。
我们直接测量了牛蛙囊斑中单个毛细胞束的瞬时刚度（图4）。为实现这一目的，我们将一根柔性玻璃纤维的尖端连接到毛细胞束的动纤毛球状结构上（图4A）。通过移动玻璃纤维的基部来向毛细胞束施加力。刺激纤维施加在毛细胞束上的力等于纤维基部与尖端位移之差乘以纤维的刚度2,27。在一系列不同力的作用下进行脉冲刺激，可得到施加在毛细胞束上的力与其随后产生的位移之间的关系。该力-位移关系曲线的斜率即为毛细胞束的瞬时刚度（图4A）。
该方法使我们能够测量单个束的瞬时刚度与其偏转之间的函数关系（图4B）。瞬时力-位移曲线呈现出非线性关系，表明毛束在其静息位置约20 nm范围内表现出非线性刚度。在此范围之外，毛束表现得如同胡克材料，其刚度在大幅度偏转时呈线性。
这些结果表明，牛蛙囊斑在毛细胞生理学研究中具有广泛的适用性。利用本方法及其他制备技术，可深入探究信息从纤毛束传递至大脑过程中多个阶段的机械转导机制。
<img alt="青蛙解剖结构，带标签的生物标本，显微镜图像，教学示意图" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 牛蛙内耳的解剖 (A从腹侧观察牛蛙的上腭，可识别出耳咽管（圆圈所示）。将覆盖上腭右侧的皮肤向侧方翻起，可显露内耳的位置（虚线框所示）。B) 去除蛙类颞骨腹侧的软骨可打开耳囊（虚线所示）。C耳囊的高倍放大图像显示，球囊、椭圆囊、前庭蜗神经（CN VIII）和球囊神经可清晰辨认。D去除内耳器官后观察耳囊，可显示半规管的位置。E去除分离的内耳后，取出球囊、椭圆囊和第八对脑神经th 颅神经（CN VIII）可轻易辨认。F分离的球囊具有一段较短的球囊神经残端，以及覆盖于其感觉上皮上方的耳石膜。标签分别对应于（i）球囊、（ii）椭圆囊、（iii）前庭蜗神经（CN VIII）、（iv）球囊神经和（v）耳石膜。坐标轴标签P和A分别代表后方和前方。比例尺分别表示1 cm（A，B）、1 mm（C，D，E） 400 μm (F)。 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a> 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure1_Dissection.eps" target="_blank">请点击此处下载该图的矢量版本。</a>
<img alt="机械转导图；受体电位与束位移；电生理数据分析。" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 单个毛细胞的位移-反应曲线。 （A）将玻璃刺激纤维的尖端耦合至毛束的动纤毛球部，随后将纤维基部进行九个离散步进的位移。使用双光电二极管系统追踪毛束的位置，同时利用微电极测量其受体电位，电极输出信号通过桥式放大器进行记录。电极尖端电阻为 95 MΩ，毛束静息膜电位为 -47 mV。 （B）毛束受体电位随其位移变化的曲线图显示，毛束的反应与其位置之间存在非线性关系。每个数据点代表在机械刺激开始后 2.5 ms 起、持续 2.5 ms 时间窗口内的平均电位和平均位移。每种颜色代表对应相同位移脉冲的一组时间序列。 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure2_Xd_Xc_Vm_version4.eps" target="_blank">请点击此处下载该图的矢量版本。</a>
<img alt="电流轨迹图；离子通道活性，电生理实验，电流与时间关系。" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：庆大霉素对毛细胞束自发振荡的影响。 使用双光电二极管系统记录双室装置中毛细胞束的自发运动。在无电流驱动释放庆大霉素（0 nA）时，毛细胞束表现出对称性振荡。随着充满500 mM硫酸庆大霉素的电泳微电极所通过的电流增大（10 nA，20 nA），毛细胞束摆动频率呈剂量依赖性降低，且细胞束更长时间地偏移至其高侧边缘。 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a> 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure3_GentaSpontOsc_version2.eps" target="_blank">请点击此处下载此图的矢量版本。</a>
<img alt="力-位移图与示意图，说明力平衡（FF=KF(XF-XB)）的测量方法。" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 计算毛细胞束的瞬时刚度。（A）一根刚度为 KF 的刺激纤维（红色）连接到单个毛细胞束（黄色）的动纤毛球状顶端（棕色）。将该纤维基部移动已知距离 XF，会导致毛细胞束移动距离 XB。刺激纤维与毛细胞束之间的位移差与刺激纤维施加在毛细胞束上的力 FF 成正比。在一系列不同力作用下重复该操作，可得到瞬时的力-位移关系（右图），其斜率即为毛细胞束的瞬时刚度。（B）对单个毛细胞束施加幅度递增的力脉冲，并测量脉冲开始后前50 ms内的位移（蓝色点）。此处毛细胞束在其静息位置附近约20 nm范围内表现出非线性的瞬时刚度。红色曲线为对关系式 F = k*X - 60*z*(1/(1+exp(-z*(X-X0)/(kB*T))) + F0 的拟合结果，其中 F 为施加于毛细胞束的力，X 为毛细胞束的位移，k = 790 ± 51 µN∙m-1 表示所有离子通道均处于全开或全闭状态时毛细胞束的恒定刚度，z = 0.43 ± 0.04 pN 为单个门控弹簧所受的力，X0 = 2 ± 1.9 nm 为毛细胞束50%通道开放时的位置，kB 为玻尔兹曼常数，T 为温度，F0 = 11.7 ± 1.3 pN 为偏移力。该拟合的决定系数为0.98。所用刺激纤维的刚度为107 µN∙m-1。 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a> 
<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure4_v5.eps" target="_blank">请点击此处下载此图的矢量版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">溶质</td>
			<td rowspan="2">分子量 (g/mol)</td>
			<td colspan="2">加入至 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人工外淋巴液</td>
			<td>人工内淋巴液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.4</td>
			<td>6.54 g</td>
			<td>0.117 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.149</td>
			<td>0.149 g</td>
			<td>8.62 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 ⦁ 2H2O</td>
			<td>147</td>
			<td>2 mL 的 1 M CaCl2 储存液</td>
			<td>250 µL 的 1 M CaCl2 储存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>1.19 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>180.2</td>
			<td>0.541 g</td>
			<td>0.541 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 解剖与实验制备用溶液。 本表列出了用于解剖及单室或双室制备的人工外淋巴液和人工内淋巴液的配方。应用约2 mL NaOH（外淋巴液）或2 mL KOH（内淋巴液）将溶液pH值调节至7.2–7.4。由于离子解离不完全，渗透压强度应约为230 mmol·kg-1。

美国牛蛙（Rana catesbeiana）的球囊允许直接检测毛细胞的生理特性。本文描述了用于生物物理研究的牛蛙球囊的解剖与制备方法。我们展示了来自这些毛细胞的代表性实验，包括纤毛束力-位移关系的计算及其无驱动力运动的测量。

美国牛蛙（Rana catesbeiana）球囊毛细胞的生理学制备

听觉与平衡功能的研究依赖于从模式系统的生物物理研究中获得的见解。其中一个模式系统是美洲...的囊斑

本实验的总体目标是为牛蛙的球囊制备适用于微机械和生物物理研究的样本。该方法有助于解答感觉神经科学领域中的关键问题：听觉和前庭毛细胞如何实现适应？自发性毛束振荡的成因是什么，以及毛细胞如何主动响应机械刺激。该技术可便捷地获取保持数小时健康状态的毛细胞。由于毛细胞脆弱且对机械刺激敏感，在这些操作过程中维持其完整性可能具有挑战性。本文提供了该方法的可视化演示，以便其他研究人员能够掌握正确的组织处理技术，并在内耳生物物理研究中取得成功。首先，将刚断头的牛蛙头部置于无菌解剖显微镜下。此图中虚线框标示了内耳的位置。使用解剖刀从犁骨齿处沿中线切开腭部组织，直至该组织最后端。接着，用解剖刀进行水平切口，切断并清除位于腭部组织下方的任何肌肉，以暴露后方软骨。去除肌肉后，观察呈棒棒糖形状的颞部软骨，该软骨构成耳囊的边界。在柱状软骨与耳囊软骨接触处将其切断。随后反复进行浅层水平切割，以削去数层薄软骨。避免深层切割，以防损伤内耳器官。当位于颞部软骨棒棒糖样结构内的耳囊已打开且内耳器官可见时（如本图所示），即停止削切。接着修剪耳囊的后缘和侧缘，注意不要损伤内耳器官。在解剖过程中，需频繁用生理盐水冲洗内耳器官，以确保其始终浸没并保持湿润。现在，找到颞骨上位于软骨与中线连接处内侧的两个圆形开口。沿最内侧的开口向下切割，以破裂颞骨。然后，在耳囊的后外侧边缘处进行第二次向下的切割。撬松此切口与前一切口之间的软骨组织，以暴露内耳器官。此操作将切断最近的半规管，随后可利用该半规管作为操作手柄进行后续步骤。接下来，注意避免触碰球囊，于前庭神经节（Scarpa's ganglion）水平切断耳蜗小囊（lagena）及第八脑神经。握住最近一个半规管的壶腹，轻柔地旋转内耳，并切断其余两个半规管。握住神经或半规管壶腹，将内耳从头部取出，置于盛有冰冷含氧人工外淋巴液的培养皿中。取出内耳后，可观察到颞骨中曾容纳半规管穿行的通道。通过表面大块的耳石和球囊神经可识别出球囊。确定球囊位置后，修剪半规管，使内耳更易于操作。接着，在覆盖于球囊神经面的外淋巴囊周围，沿其边缘进行轻柔切割。切断连接囊斑膜与球囊神经侧的小组织柱，移除囊斑。接着，去除通向椭圆囊、耳石器官及耳石神经的神经。然后，在固定球囊神经的同时，轻轻提起球囊，剪开耳石囊的薄膜，随着耳石从囊中溢出，沿球囊周缘剪开，将其完全游离。使用剪刀或镊子小心擦去耳石器上残留的耳石。在此过程中注意不要触碰耳石器。现在修剪耳石器边缘残留的耳石囊膜，以防止膜黏附到塑料和玻璃表面。最后，用巴斯德移液管将生理盐水轻轻流过球囊，以清除任何残留的耳石。此处详细展示了分离后的球囊。虚线标示了耳石膜的位置以及其下方含有毛细胞的感觉斑区域。使用尖端破损的巴斯德移液管后端，将分离的囊状结构转移至含有 Proteus 24 溶液的培养皿中。随后在 22 摄氏度下孵育组织 30 分钟。将每个消化后的囊状结构转移至敞面实验腔室，并用磁性固定针固定组织。然后使用细小的睫毛，去除覆盖的耳石膜，暴露含有毛细胞的球囊斑。分离出球囊后，在包埋块中充满人工外淋巴液。接着在其中一个开口处涂抹两处真空脂，将穿孔铝片置于其上，形成一个较弱的密封。然后将囊斑转移至锡箔上，使其位于孔洞中央，耳石器官朝下，神经残端朝上。用拧紧的组织块从固定室的对侧吸取盐溶液，以在囊斑与固定箔之间形成紧密密封。用吸水纸吸去铝方块表面囊斑周围的盐溶液。使用聚四氟乙烯涂布器沿囊状结构边缘与铝片之间的边界快速涂抹氰基丙烯酸酯胶水。确保囊状结构的整个周长均被胶水覆盖。涂抹氰基丙烯酸酯胶水时，应使用涂布器引导胶水沿组织边缘移动，同时避免与组织直接接触。您的目标是实现完全密封，以隔离内淋巴和外淋巴腔室。操作应迅速进行，以防止胶水蔓延至组织背面。在安装好的组织上方滴加一滴生理盐水，以固化胶水。如果生理盐水液滴表面形成一层薄薄的胶膜，需用镊子将其移除。小心地从支撑块上取下铝箔。将已固定的组织翻转，使球囊的椭圆囊斑侧朝上，漂浮于盛有人工外淋巴液的培养皿中。在耳石膜上滴加一滴 Proteus 24 溶液，并在 22 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，用外淋巴液填充双室装置的下部通道，并在中央腔周围涂抹真空润滑脂。将固定在箔片上的球囊置于下部腔室上，使其神经面朝向腔室表面。在锡箔边缘涂抹真空脂。将制备装置的上腔室置于锡箔上，注意用真空脂形成完全密封。向上腔室中加入通入气泡的人工内淋巴液，然后用睫毛轻轻移除耳石膜，暴露出含有毛细胞的球囊内侧组织。该图像显示了毛细胞静纤毛束在离散步进下的位移结果。通过双光电二极管系统追踪纤毛束的位移，同时使用尖锐微电极测量感受器电位。纤毛束感受器电位随其位移变化的曲线表明，纤毛束的反应与其位置之间存在非线性关系。每种颜色代表一组时间序列，对应于相同的位移脉冲。从上方观察时，双室制备中的毛束会自发振荡。在未进行庆大霉素离子电泳释放的情况下，毛束表现出对称振荡。然后，随着通过充满500毫摩尔硫酸庆大霉素的离子电泳微管的电流强度逐渐增大，毛束偏移频率以剂量依赖的方式下降，且毛束向其高侧边缘偏移的时间延长。一旦掌握该技术，可在75分钟内完成操作。在此步骤之后，可进行电生理学和机械负载钳制等实验方法，以研究毛细胞的主动过程。该技术为感觉神经科学领域的研究人员奠定了基础，以探索脊椎动物听觉和平衡的力学机制。观看本视频后，您应能很好地掌握如何制备牛蛙的球囊，以开展对毛细胞生理学的生物物理研究。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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从美国牛蛙的小囊（毛细胞的生理准备<em&gt;牛蛙</em&gt;）

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