多显微镜下的血管生成术在基因修饰的 3 d-PLGA/nHAp 支架上进行颅骨临界骨缺损修复
2017年9月7日
在这里, 我们提出了一个协议, 以可视化血管形成在体内和在 real-time 的3D 支架的多显微镜。在小鼠颅骨临界骨缺损模型中研究了基因修饰支架的血管生成。治疗组发现更多的新血管。
本实验的总体目标是通过多光子显微镜实时可视化三维支架中的体内血管形成。这些测量是骨生成领域的关键问题，例如如何实时中和和欺骗三维支架中的体内血管形成。该技术的一个优点是它能够在体内同时中和 CERES、细胞外指标和周围的分子网络。
首先，制备含有 20 克 PLGA 和 20 毫升 1,4 二恶烷的均相溶液。然后，向溶液中加入 2 克 nHAP 粉末。使用磁力搅拌器，在室温下以 1500 rpm 的速度剧烈混合悬浮液 16 小时，以形成均匀的糊状物，用于打印多孔 PLGA NHAP 支架。
打印后，将支架冷冻干燥 48 小时以完全去除任何溶剂。然后在 75% 的乙醇中消毒 1 小时。之后，再次对它们进行 lifalyly 以获得中性、防腐材料。
接下来，向每个支架中加入 4 个 5 乘以 10 到 5 个慢病毒颗粒，并让颗粒在保持 37 摄氏度的加湿培养箱中吸收 2 小时。现在慢病毒颗粒已在支架上吸收，用 2 毫升 PBS 洗涤支架两次，以去除任何未结合的残基。在液氮中快速冷冻清洗过的脚手架。
再次研磨后，将它们存放在零下 80 摄氏度以备进一步研究。将先前涂有 4 点 5 倍 10 的 3d 支架转移到携带绿色荧光蛋白的第五个慢病毒颗粒中，放入装有 1 毫升完整 DMEM 的 2 点 0 毫升低温小瓶中，并在 37 摄氏度下摇动孵育 5 天。每孵育 12 小时，收集 1 毫升含有从支架中释放的慢病毒颗粒的培养基样品，并用 1 毫升新鲜培养基替换它们。
要转导 HEK293T 细胞，首先从 12 孔板中培养的 HEK293T 细胞中取出培养基，然后用 PBS 洗涤细胞两次。然后，将 1 毫升先前收集的培养基添加到洗涤过的 HEK293T 细胞中，并在 37 摄氏度下在加湿培养箱中孵育板 48 小时。孵育 48 小时后，通过流式细胞术测量 GFB 阳性HEK293T细胞的数量，以确定生物活性慢病毒颗粒的数量。
首先，将 C57 黑色 6 只小鼠随机分为三个治疗组：对照组、PH 组和 PHp，每组 14 只动物。剃掉麻醉小鼠头上的皮肤，用碘酊剂和 75% 的酒精溶液消毒表面。将鼠标头部放在立体定向仪器中，用手术刀确定皮肤大小，然后用剪刀做一厘米的线性切割。
使用无菌棉签，从颅骨上刮下骨膜，露出其表面。然后，在颅骨的左侧，用环钻创建一个直径为 4 毫米的临界尺寸缺陷。将支架移植到骨缺损的一侧。
使用眼泪钳轻轻覆盖骨膜手术部位。之后，每厘米切口缝 3 针，闭合伤口。最后，服用镇痛药丁丙诺啡以控制术后疼痛，并将动物放在加热垫上以保持其体温，直到它醒来。
当老鼠恢复意识时，为它提供食物和水，并监测它的日常活动，直到实验结束。组装用于 TPEF 和 SHG 成像的多光子显微镜系统后，将飞秒钛蓝宝石激光器调谐到 860 纳米。为了观察新形成的血管，向小鼠静脉注射 200 微升每毫升 10 毫克的右旋糖酐盐水溶液，然后使用立体定向仪器将麻醉动物固定在加热板上，以将其体温保持在 37 摄氏度。
腹膜内给小鼠注射 200 微升生理盐水以防止脱水。最后，为动物提供 3% 的异氟醚和 100% 氧气混合物，以在成像过程中保持足够的麻醉和镇痛。要开始成像，请扫描一对振镜以创建 512 x 512 微米的采样区域。
然后，使用 NA 单点 O 水浸物镜，将激发光束聚焦在样品上并收集背散射 TPEF HSG 信号。设置视野，使其覆盖对照组中的正常骨骼区域和缺损边缘，但在从 PH 或 PHp 组对动物进行成像时，仅覆盖植入的支架。然后，扫描缺陷的五个不同部位。
在两个小时的成像周期内，每 12 秒采集一次图像堆栈。这里展示的是一张使用 3D 打印技术制备的支架的照片，以及一张显示制备材料整体孔隙率的显微 CT 图像。支架的微孔结构显示在以 5000 倍放大倍率采集的 SEM 图像中。
如图所示，用含有从支架释放的慢病毒颗粒的培养基处理的 HEK293T 细胞可有效表达绿色荧光蛋白。根据流式细胞术的估计，释放的颗粒总数达到约 40%。在研究的前 24 小时内观察到最强大的释放效果，并随着时间的推移逐渐降低，证实包被在支架上的慢病毒颗粒可保持其生物活性长达 96 小时。
对颅骨缺损内形成的血管的体内分析表明，新血管虽然在小鼠对照组中检测不到，但在支架移植 8 周后，PH 和 PHp 组都清晰可见。此外，虽然在 PH 和 PHp 组中都检测到许多胶原蛋白沉积位点，但仅在 PHp 组中可以观察到越来越多的较小血管生长成支架，并且整体血管面积显着不同。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。
在尝试此过程时，请务必记住固定鼠标头部，以便在扫描过程中保持静止，以避免任何伪影。按照此程序，可以执行其他方法，例如光声成像，以提供额外的数据，例如深层组织图像。开发后，这项技术为骨再生领域的研究人员研究移植中的血管生成铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何实时可视化 3D 支架中的体内血浆形成和微光子显微镜有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种使用多光子显微镜在体内和实时可视化三维支架内血管形成的协议。该研究集中于在小鼠颅骨关键骨缺损模型中的基因改造支架内的血管生成，结果显示治疗组中新生血管数量比对照组高。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 血管生成
背景
- 血管形成对于组织工程和再生医学至关重要。
- 了解血管生成可以改进骨再生策略。
- 多光子显微镜允许实时可视化血管动态。
- 基因改造支架可以影响血管生成反应。
研究目的
- 在三维支架内可视化体内血管形成。
- 评估基因改造支架对血管生成的影响。
- 利用多光子显微镜进行血管发育的实时成像。
使用的方法
- 制备PLGA和nHAP的均匀溶液。
- 使用磁力搅拌器创建用于支架打印的均匀糊状物。
- 实施多光子显微镜进行实时可视化。
- 比较治疗组和对照组之间的血管形成。
主要结果
- 观察到治疗组中血管形成增加。
- 实时成像提供了对血管生成过程的洞察。
- 该协议成功地展示了支架的有效性。
- 研究结果有助于理解组织工程中的血管化。
结论
- 该研究成功地使用先进的成像技术可视化了体内血管生成。
- 基因改造支架显示出增强的血管形成。
- 这种方法可以应用于骨再生和组织工程的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of angiogenesis within 3D biomaterial scaffolds addresses a critical bottleneck in bone tissue engineering by enabling direct assessment of vascular integration and scaffold performance. Multiphoton microscopy provides high-resolution, minimally invasive imaging to support predictive confidence in scaffold-driven bone regeneration. This capability informs early-stage portfolio decisions and de-risks translational advancement of engineered constructs for critical defect repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of angiogenic response to genetic scaffold modifications in vivo.
- Supports biological de-risking by visualizing vascular integration at the tissue–scaffold interface.
- Facilitates predictive confidence in scaffold design for regenerative applications.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D in vivo system for quantifying blood vessel formation in response to scaffold modifications.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs for comparative assessment of scaffold candidates.
- Supports standardization of angiogenesis assays for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold performance with disease-relevant vascularization endpoints in preclinical bone defect models.
- Enables continuity from discovery-stage scaffold optimization to preclinical validation of regenerative efficacy.
- Supports risk-adjusted advancement of scaffold technologies based on real-time vascularization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This multiphoton microscopy-based workflow bridges early discovery, scaffold optimization, and preclinical validation for bone regeneration programs.
- Discovery Biology: Visualizes and quantifies in vivo angiogenesis to clarify scaffold–host interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for candidate scaffold evaluation.
- Analytics: Provides volumetric and temporal data on blood vessel formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects scaffold design to preclinical vascularization and bone regeneration outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold-driven angiogenesis and bone repair.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging and quantification of vascularization in 3D scaffolds.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for scaffold advancement based on real-time biological integration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for critical defect repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy and in vivo imaging protocols.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and animal surgical facilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different scaffold materials or defect models.
- Imaging artifacts can arise from animal movement, requiring careful immobilization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Scaffold Preparation
7:00
Results: 3D Scaffolds Promote Angiogenesis in Bone Defects
8:33
Conclusion
3:51
Crtitical Bone Defect Model and Scaffold Transplantation
5:21
In Vivo Imaging of Angiogenesis within the Bone Defect
2:30
Lentivirus Particle Release and Transduction Capacity
