稀有抗原特异性B细胞的检测与富集用于表型和功能分析

本简单而有效方法的总体目标是利用磁性纳米颗粒从人外周血中分离并富集稀有的抗原结合性B细胞，以进行其表型和功能分析。该方法有助于解答免疫学领域中关于稀有抗原结合性B细胞在体内接触抗原前后其表型与生物学特性的关键问题。该技术的主要优势在于避免了几何学相关的问题，特别是在使用聚苯乙烯板或大尺寸磁珠时。

并且在通过流式细胞术从较大的起始细胞群体中分离稀有细胞时，该方法避免了与流速相关的问题。采集30至50毫升全血至含肝素的采血管后，立即将血液以1:1的比例与室温无镁无钙的PBS缓冲液混合。接着，使用平稳一致的移液器按压操作，将血液混合物缓慢叠加到无菌50毫升锥形管中10毫升室温密度梯度溶液上层。

通过离心分离细胞。弃去含有血浆和血小板的上层液体，使用无菌移液管将单个核细胞层（棕黄层）转移至新的无菌50毫升离心管中。加入最多50毫升的磷酸盐缓冲液（PBS），通过离心洗涤单个核细胞。

然后，将沉淀重悬于10毫升新鲜PBS中进行计数，并将细胞在冰上以每毫升1×10⁷个细胞的浓度重悬于新鲜PBS中。为进行磁珠结合染色，首先根据需要将1–2×10⁶个细胞的等分试样转移至5毫升聚苯乙烯管中，用于每个荧光补偿和荧光减一对照。接着，通过离心收集剩余的细胞样品，并将沉淀重悬于无菌过滤的冷FACS缓冲液中，调整细胞浓度至每毫升3–6×10⁷个细胞。

将细胞悬液等分为四份，分别加入预冷的FACS管中，并向这四个实验样品组分中加入人Fcγ受体阻断试剂。在非特异性结合阻断孵育结束时，向所有四个样品组分的细胞中加入相应的荧光标记细胞表面染色抗体。然后，向A组和D组中加入适量的生物素标记抗原，随后向B组中加入足量的未标记抗原，使具有至少1×10⁶摩尔亲和力的大多数受体被阻断。

将所有样品置于冰上孵育30分钟，随后将组分B与相应的生物素化抗原在冰上孵育30分钟。孵育结束后，每5×10^7个细胞用1毫升预冷的FACS缓冲液洗涤两次。然后将细胞沉淀重悬于1毫升2%甲醛中，每5×10^7个细胞于冰上避光孵育5分钟。

固定后，再按上述方法洗涤细胞两次。每 5×10⁷ 个细胞用 1 毫升预冷的 FACS 缓冲液重悬沉淀。然后在冰上避光条件下，加入 1 至 2 微克相应的生物素化二抗，孵育 20 分钟，再洗涤细胞两次。

对于基于磁性纳米颗粒的富集，将 A、B 和 C 细胞组分按每 5×10⁷ 个细胞加入一毫升冷分离缓冲液重悬，并通过各自的 40 微米滤器过滤，以去除任何团块。接着，在四摄氏度避光条件下，以适当浓度加入荧光染料标记的纳米颗粒，旋转孵育 10 分钟，并用一毫升冷分离缓冲液洗涤样品两次。然后按每 5×10⁷ 个细胞加入一毫升冷分离缓冲液重悬沉淀。

然后，将三个磁性柱分别置于相应大小的磁铁上，每柱加入三毫升分离缓冲液进行平衡，使全部分离缓冲液体积流过磁性柱进入废液容器。现在，在每个磁性柱下方放置一个已标记的15毫升锥形管，并将磁性颗粒标记的细胞加入对应的磁性柱中。当每个细胞组分的全部体积通过磁性柱后，向每个柱的顶部加入三毫升新鲜的冰上预冷的分离缓冲液，将流出液收集至已标记的试管中。

第二次洗涤液完全流过柱子后，将各组分的阴性选择细胞管置于冰上，并将柱子转移至对应各组分的新15毫升离心管中。每根柱子加入约6毫升新鲜分离缓冲液，立即推动缓冲液流过柱子，以收集磁性结合的细胞。然后通过离心收集阳性与阴性细胞组分，并将沉淀重悬于适合后续分析的适当溶液中。

在这些图中，来自一名十多年前最后一次接种破伤风疫苗的个体的破伤风类毒素反应性B细胞频率显示，该方法能够将破伤风类毒素结合细胞富集约七倍，纯度约为4%。在采集血样前约三年接种过疫苗的受试者细胞中，在加入生物素标记抗原之前，加入50倍过量的未标记破伤风类毒素，可使破伤风类毒素结合减少83%，表明抗原结合具有特异性。当实验过程中省略生物素标记抗原时，仅有0.2%的B细胞仍发生结合，这可能反映了吸附剂中某些非破伤风抗原的结合。

这些图表展示了健康受试者在加强免疫后第七天采集的血样中，针对破伤风类毒素的初始B细胞频率从加强免疫前的84%下降至64%；与此同时，记忆B细胞和浆母细胞群体的比例分别从16%上升至36%，以及从0上升至40%。此外，来自健康受试者加强免疫后第七天外周血样本的代表性ELISPOT数据显示，在分离出的破伤风类毒素结合B细胞中，分泌抗破伤风类毒素抗体的细胞频率增加了四倍。

一旦掌握，该技术在具备所有适当对照的情况下，可在大约三到四小时内完成。该方法可与次级检测联合使用，例如将细胞转移至过继受体，以进一步研究细胞命运与功能。观看本视频后，您应能充分理解如何使用适当的对照从人外周血中分离并富集稀有的抗原结合性B细胞。