使用质谱参考测量程序对脑脊液中Aβ_1-42进行绝对定量

本参考测量程序的总体目标是对人脑脊液中的β淀粉样蛋白进行测量标准化。该方法有助于标准化脑脊液Aβ42的检测，而Aβ42是中枢淀粉样蛋白病变的生物标志物，也是阿尔茨海默病的神经病理学特征。该技术的主要优势在于其经过充分验证，并且在Aβ42定量过程中不使用抗体。

该技术的应用前景涉及阿尔茨海默病的治疗，因为它可用于标准化检测方法，并促进在临床试验中建立通用的截断值。尽管该方法可为人类淀粉样蛋白病理提供深入见解，也可应用于其他有生命机体，如转基因小鼠和非人灵长类动物，以推动新药研发。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为AVR 142具有很强的疏水性，极易吸附于移液器吸头和试管等表面。

首先，在一个0.5毫升的微量离心管中，加入40微升N15标记的β肽至0.46毫升含20%乙腈和4%浓氨水的溶液中。将肽溶液在涡旋混合器上混合一分钟。然后，取50微升上述肽溶液加入到一个2毫升微量离心管中的1.95毫升含20%乙腈和4%浓氨水的溶液中。

将肽溶液在涡旋振荡器上混匀一分钟。接下来，通过在微量离心管中混合各溶液的适当体积，配制六种校准品溶液。混合校准品溶液后，在0.5毫升微量离心管中，将相应校准品溶液与人脑脊液按适当体积混合，每种设置两个复孔，制备最终的校准品。

将每种溶液在涡旋混合器上混合一分钟。配制内标时，首先在2毫升微量离心管中加入32 µL的13C标记β肽和1.968 mL含20%乙腈和4%浓氨水的溶液。将肽溶液在涡旋混合器上混合一分钟。

接下来，将0.1毫升肽溶液加入含有4.9毫升20%乙腈和4%浓氨水的5毫升微量离心管中。在涡旋混合器上混匀肽溶液1分钟。为制备响应因子样品，将40微升天然Aβ肽加入含有0.46毫升20%乙腈和4%浓氨水的0.5毫升微量离心管中。

混合后，取20微升肽溶液和20微升浓度为每毫升4微克的15N标记β肽，加入到含有1.96毫升20%乙腈和4%浓氨水的2毫升微量离心管中。将肽溶液在涡旋振荡器上混合1分钟。随后，取20微升该肽溶液加入到含有0.38毫升人工脑脊液的0.5毫升微量离心管中。

制备复孔后，将每种溶液在涡旋振荡器上混匀一分钟。在滚轴上解冻样品后，向一个1毫升蛋白96深孔板中每孔分别加入0.18毫升的标准品、响应因子及待测样品，注意将样品加至孔底或接近孔底的位置。随后，通过将内标液滴加到接近样品液面的孔壁侧边（避免移液枪头浸入液面以下），向每孔加入20微升内标液。

然后，向每个孔中加入 0.2 毫升 5 摩尔的盐酸胍。将样品板置于微量板振荡器上，在 1100 转/分钟的条件下振荡混匀 45 分钟。混匀后，向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸。

然后，将样品板置于微孔板振荡器上，以1000 rpm短暂混匀。在混合模式阳离子交换96孔固相萃取（SPE）板的萃取板歧管腔下方放置一个废液储液槽。接着，通过向每孔加入0.2毫升甲醇对SPE吸附剂进行活化处理。

然后，通过向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸溶液来平衡吸附剂。使用八通道移液器，将深孔板中的所有样品转移至固相萃取板中。样品完全通过后，再向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸溶液，洗涤吸附剂两次。

洗涤溶剂从吸附剂中流出后，将储液盘更换为收集管。随后，加入两份50 µL的75%乙腈和10%浓氨水溶液，将样品从吸附剂中洗脱，注意该溶液需要极低的真空度才能通过吸附剂。使用真空离心法干燥洗脱液，过程中不加热。

最后，密封试管并在 -80 摄氏度下冷冻保存，直至分析。校准品接近回归线，且标准差较小。如果校准呈非线性，应弃用该次实验，偏差很可能是由于移液技术不正确和/或校准品稀释错误所致。

重复样的变异系数最好低于10%。天然的15N和13C标记的β肽应同时从液相色谱柱洗脱，峰形接近对称，且无明显拖尾。每个峰至少应进行10次测量，可通过方法中设置的最大进样时间进行调整。在质谱分析过程中，可同时检测所有肽段，除非方法的灵敏度不理想，此时每次进样应仅检测感兴趣的肽段。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在四小时内完成。在进行此操作时，需始终牢记：在转移肽溶液前，务必先充分润洗移液器吸头。同时，应尽量使用死体积最小的离心管。

该技术问世后，为阿尔茨海默病领域的研究人员探索其与其他方法（如淀粉样蛋白PET成像）的一致性奠定了基础。该技术还已被用于为基于脑脊液的参考物质分配Aβ142浓度。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在人脑脊液中配制校准品，以及在LCMS分析前采用固相萃取法测定样本中Aβ142绝对浓度的操作流程。

请注意，处理人脑脊液（CSF）可能具有极高危险性，因此在进行本操作时，必须始终采取手套、防护眼镜及其他安全措施等预防手段。