Aβ的绝对定量 1-42在CSF使用质谱参考测量程序
March 21st, 2017
描述了基于固相萃取和液相色谱串联质谱法对人 CSF 中 Aβ1-42 进行绝对定量的参考测量程序。
该参考测量程序的总体目标是协调人 CSF 中 β 的测量。该方法有助于标准化 CSF a β 42 的测定，CSF β 42 是中枢淀粉样蛋白病理的生物标志物和阿尔茨海默病的神经病理学标志。该技术的主要优点是经过全面验证，并且不使用抗体定量 AVR 142。
这项技术的影响延伸到阿尔茨海默病的治疗，因为它将用于协调检测并促进在临床试验中引入一般临界水平。虽然这种方法可以提供对人类淀粉样蛋白病理学的见解，但它也可以应用于其他致命生物，如转基因小鼠和非人灵长类动物，以刺激新药。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为 AVR 142 非常疏水，很容易粘在移液器吸头和试管等表面上。
首先，在 0.5 mL 微量离心管中，将 40 μL N15 a β 肽添加到 0.46 mL 20% 乙腈和 4% 浓氨中。在涡旋混合器上混合肽溶液 1 分钟。在 2 mL 微量离心管中，将 50 μL 肽溶液加入 1.95 mL 20% 乙腈和 4% 浓氨中。
在涡旋混合器上混合肽溶液 1 分钟。接下来，通过在微量离心管中混合适当体积的每种溶液来制备六种校准品溶液。混合校准液溶液后，通过在 0.5 mL 微量离心管中混合适当体积的相应校准液溶液和人 CSF 来制备最终校准液，一式两份。
在涡旋混合器上混合每种溶液 1 分钟。要制备内标，首先在 2 mL 微量离心管中将 32 μL 13C a β 肽添加到 1.968 mL 20% 乙腈和 4% 浓氨中。在涡旋混合器上混合肽溶液 1 分钟。
接下来，将 0.1 mL肽溶液加入 5 mL 微量离心管中的 4.9 mL 20% 乙腈和 4% 浓氨中。在涡旋混合器上混合肽溶液 1 分钟。为了制备反应因子样品，在 0.5 mL 微量离心管中，将 40 μL 天然 A β 肽添加到 0.46 mL 20% 乙腈和 4% 浓氨中。
混合后，在 2 毫升微量离心管中加入 20 微升肽溶液和 20 微升 4 微克/毫升、15N β 肽与 1.96 毫升 20% 乙腈和 4% 浓氨中。在涡旋混合器上混合肽溶液 1 分钟。然后，在 0.5 毫升微量离心管中将 20 微升肽溶液添加到 0.38 毫升人工 CSF 中。
制备副本后，在涡旋混合器上混合每种溶液 1 分钟。在滚轮上解冻样品后，将 0.18 mL 的每种校准品、响应因子和未知样品添加到 1 mL Protein 96 深孔板中，确保将样品添加到孔内或靠近孔底部。现在，通过在靠近样品表面的孔侧面释放一滴标准品，向每个孔中加入 20 μL 内标，而无需浸没移液器吸头。
然后，向每个孔中加入 0.2 毫升 5 摩尔盐酸胍那定。将样品板放在微孔板摇床上，以 1100 rpm 的转速混合样品 45 分钟。混合后，向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸。
然后，将样品板放在微孔板振荡器上，以 1000 rpm 的速度短暂混合。在混合模式阳离子交换 96 孔固相萃取下放置废液储液槽，或在萃取板歧管室中放置 SPE 板。接下来，通过向每个孔中加入 0.2 mL 甲醇来调节 SPE 吸附剂。
然后，通过向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸来平衡吸附剂。使用八通道移液器将所有样品从深孔板转移到 SPE 板。之后，在样品通过后，向每个孔中加入 0.2 毫升 4% 磷酸，洗涤吸附剂两次。
清洗溶剂从吸附剂中洗脱后，用试管更换储液槽托盘。现在，通过加入两个 50 微升的 75% 乙腈和 10% 浓氨来洗脱吸附剂中的样品，注意该溶液需要非常低的真空才能通过吸附剂。使用真空离心干燥洗脱液，无需加热。
最后，密封试管并在 80 摄氏度下冷冻直至分析。校准品接近标准差较低的回归线。如果校准是非线性的，则应丢弃运行，偏差很可能是由于移液技术和/或校准品稀释错误造成的。
重复样品的变异系数最好低于 10%天然 15 N 和 13C a β 洗脱液，同时出现接近对称的峰，且无明显的拖尾。每个峰至少应进行 10 次测量，并且可以根据方法中的最长进样时间进行调整。在 MS 分析过程中，可以同时测量肽，除非方法灵敏度不理想，在这种情况下，每次进样只应测量目标肽。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住在转移肽溶液之前始终使移液器吸头浸透。使用尽可能少空隙量的管子也很重要。
开发后，这项技术为阿尔茨海默病领域的研究人员探索与其他方法（如淀粉样蛋白 PET 成像）的一致性铺平了道路。它还被用于为基于 CSF 的参考物质分配 beta 142 浓度。观看本视频后，您应该对如何在人 CSF 中制备校准品以及在 LCMS 分析之前使用固相萃取来测量样品中 β 142 的绝对浓度有很好的了解。
不要忘记，与人类 CSF 一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如手套、防护眼镜和其他安全措施。
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概述
本文描述了一种参考测量程序，用于通过固相萃取和液相色谱串联质谱法对人脑脊液（CSF）中的Aβ1-42进行绝对定量。该方法旨在标准化测量CSF Aβ 42的测定方法，而CSF Aβ 42是阿尔茨海默病的关键生物标志物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 临床研究
背景
- Aβ 42是中枢淀粉样蛋白病理的生物标志物。
- 测定方法的标准化对临床试验至关重要。
- 该方法已经验证，且不依赖于抗体。
- 它可以应用于各种生物体进行药物开发。
研究目的
- 协调人CSF中Aβ的测量。
- 促进临床试验中截止水平的引入。
- 提供有关淀粉样蛋白病理的见解。
使用的方法
- 肽溶液和校准标准的制备。
- 样品的固相萃取。
- 液相色谱串联质谱分析。
- 通过校准和重复测量验证方法。
主要结果
- 该技术可以在约四个小时内完成。
- 校准结果显示标准偏差低。
- 重复测量的变异系数应低于10%。
- 分析过程中肽以对称峰的形式洗脱出来。
结论
- 该方法提高了Aβ定量的可靠性。
- 它支持阿尔茨海默病的研究和药物开发。
- 适当的技术对于准确的结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Absolute quantification of CSF Aβ1-42 using an antibody-independent mass spectrometry reference measurement procedure addresses critical assay variability in Alzheimer's disease biomarker development. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing traceable, reproducible quantification essential for go/no-go decisions in therapeutic pipelines. Standardization of Aβ1-42 measurements supports risk-adjusted portfolio prioritization and facilitates cross-functional alignment in preclinical and clinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by providing absolute quantification of amyloid-beta pathology, a core neuropathological hallmark of Alzheimer's disease.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through antibody-free measurement, minimizing assay-specific artifacts in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering quantitative Aβ1-42 data with defined measurement ranges (150-4,000 pg/mL) for therapeutic intervention assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a validated reference system for assay standardization, enabling reliable comparison across laboratories and platforms in biomarker qualification.
- Operational Value: Ensures reproducibility through solid-phase extraction and LC-MS/MS workflows with internal standardization using isotope-labeled peptides.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse and cross-organism applicability (human CSF, transgenic mice, nonhuman primates) for consistent biomarker evaluation in drug discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical continuity by enabling Aβ1-42 quantification in disease-relevant systems, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive De-risking: Enhances confidence in target validation by delivering measurement data concordant with orthogonal methods such as amyloid PET imaging.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go criteria through low-variation calibration (CV <10%) and defined quantitation limits, reducing late-stage biological risk in Alzheimer's therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the Alzheimer's discovery continuum from target validation through preclinical development, providing quantitative Aβ1-42 measurements that inform lead identification and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports target validation by delivering absolute quantification of CSF Aβ1-42, enabling mechanistic interrogation of amyloid pathway modulation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized sample preparation and SPE-LCMS/MS analysis, ensuring reliable compound effect evaluation on biomarker levels.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Aβ1-42 concentration) with defined precision (CV <10%) and dynamic range (150-4,000 pg/mL) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing Aβ1-42 measurement in transgenic models, supporting biomarker-aligned therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable reference capability for longitudinal biomarker tracking across discovery, preclinical, and clinical stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through antibody-independent, traceable quantification of a core Alzheimer's pathology biomarker.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via isotope-labeled internal standards and validated SPE-LCMS/MS workflow.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reduced biomarker variability and enhanced assay harmonization across sites.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative Aβ1-42 data with defined measurement performance characteristics.
Implementation Considerations
- Expertise in mass spectrometry, peptide handling, and solid-phase extraction techniques required for accurate Aβ1-42 quantification.
- Instrumentation needs include high-resolution quadrupole-orbitrap LC-MS/MS systems capable of sensitive peptide detection in complex CSF matrices.
- Cross-team standardization requires adherence to calibrated sample preparation, internal standard use, and SPE protocol consistency.
- Adaptation considerations include managing the hydrophobic nature of Aβ1-42 to prevent surface adsorption losses during sample processing.
- Practical limitations include the need for meticulous pipetting technique and low-void-volume tubes to ensure recovery of hydrophobic peptides.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Preparation of the Calibrators and the Internal Standard
3:00
Preparation of the Response Factor Sample
4:01
Sample Preparation
5:06
Solid Phase Extraction
7:25
Conclusion
6:32
Results: Quantification of Aβ1-42 in CSF Using Solid Phase Extraction and LC-MS/MS
