Name: 非人类灵长类动物脑组织的制备预嵌入免疫组化和电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学习使用丙烯醛固定非人灵长类动物脑组织进行预包埋免疫组化和电子显微镜观察的方法。该技术成本低、操作简便，可实现长期保存并精确定位突触结构。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC，项目号 401848-2011，授予 M.P.）提供资助。M.P. 获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S)）的职业奖项。L.E. 获得了魁北克健康研究基金会的博士奖学金（FRQ-S 14D 29441）。我们感谢 Marie-Josée Wallman 提供的技术支持。

伦理声明：所有涉及动物的实验方案均经拉瓦尔大学动物保护委员会（Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval）批准，并遵循加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》（第2版）的规定。本文所述方案针对体重约800 g的成年动物进行了优化。固定剂的用量应根据动物体型进行相应调整。
1. 心脏灌注溶液的制备
<ol>
	<li>按照以下步骤配制1 L 50 mM磷酸钠缓冲盐溶液（PBS）。溶液应在灌注前最多24小时内配制，并于4 °C保存至使用。
	<ol>
		<li>用量筒量取800 mL蒸馏水倒入1 L烧杯中。加入5.87 g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）。2HPO4)，1.20 克一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）2PO4·H2O）和 9 g 氯化钠（NaCl）。搅拌至溶解。</li>
		<li>用5 N NaOH逐步调节pH至7.4。加蒸馏水定容至1 L。 
		警告：NaOH 是一种腐蚀性化学化合物。请穿戴适当的个人防护装备（PPE；实验服、手套、护目镜）， 等等.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤配制 2 L 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。该溶液应在手术前最多 24 小时内配制，并于 4 °C 保存至使用。
	<ol>
		<li>在2 L烧杯中量取1.5 L蒸馏水。加入23.48 g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）2HPO4) 和 4.80 克一碱基一水合磷酸钠（NaH2PO4·H2O）。搅拌至溶解，加入蒸馏水定容至 2 L。</li>
		<li>在通风橱中加热溶液，直至温度达到约45 - 55 °C。切勿加热至60 °C以上。</li>
		<li>逐渐将80 g PFA加入溶液中，搅拌至完全溶解（约30–60分钟）。持续监测温度，确保其低于60 °C。 
		警告：PFA 粉末具有高度挥发性，接触眼睛或皮肤时具有高毒性，吸入或摄入时有危险。请佩戴个人防护装备，并在通风橱中小心使用。</li>
		<li>将溶液冷却至 4 °C 后过滤，于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤配制 1 L 的 3% 丙烯醛（acrolein）0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）。磷酸盐缓冲液（PB）应在灌注前最多 24 小时内配制。 
	警告：丙烯醛吸入后具有高毒性，可造成即时损伤。若经皮肤吸收，也具有腐蚀性和高毒性。该物质为致癌物和致突变物。请穿戴适当的个人防护装备，并在通风条件下使用。&#160;通风橱
	<ol>
		<li>量取800 mL蒸馏水，加入8.66 g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）。2HPO4) 和 5.38 克一碱式一水合磷酸钠（NaH2PO4·H2O）。搅拌至所有盐完全溶解，加入蒸馏水定容至 1 L。将溶液保存于 4 °C。</li>
		<li>手术前，将900 mL PB溶液转移至1 L玻璃容器中，在通风橱内加入30.94 mL 97%丙烯醛溶液。用PB溶液定容至1 L，搅拌均匀。过滤溶液后置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 经心脏灌注与脑组织解剖
<ol>
	<li>在整个手术过程中将溶液保持在冰上。通过将管路插入即将使用的第一个溶液（PBS；50 mM）中并开启泵，直到管路中无气泡残留，以完成泵的准备工作。对猕猴进行经心灌注时，使用21 G针头，并将流速设定为约80 mL/min。</li>
	<li>通过肌肉注射给予氯胺酮（20 mg/kg）、赛拉嗪（4 mg/kg）和乙酰丙嗪（0.5 mg/kg）混合物以麻醉动物。使用异氟烷（3%）维持动物的镇静状态。</li>
	<li>将动物的四肢固定在通风台上。</li>
	<li>使用手术刀切除至腋窝处的皮肤。切开腹肌。使用重型手术剪小心避开重要器官，从侧方剪开肋骨。</li>
	<li>用手术剪剪开膈肌，并抬起肋骨以暴露心脏。一旦切开膈肌，应迅速操作，因为心脏将在数分钟内停止跳动。</li>
	<li>用手术刀片去除心包膜，将针头插入左心室。用手术刀小心地在右心房做一小切口。立即以72 mL/min的速度启动泵，并固定针头位置。如有可能，倾斜动物身体，使其头部低于心脏水平。 
	注意：插入针头时需小心，避免刺穿室间隔。
	<ol>
		<li>用约300 mL PBS冲洗血液，直至肺部呈白色且右心房无血液流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>停止泵运行，迅速将管路/管子转移至3%丙烯醛溶液中，重新启动泵。待心脏停止跳动后，逐渐将泵速提高至80 mL/min。灌注约500 mL丙烯醛溶液。</li>
	<li>停止泵运行，迅速将管路转移至4%多聚甲醛（PFA）溶液中，再次启动泵。此步骤需使用约1 L的PFA。 
	注意：当动物前肢变得僵硬且颈部变硬时，表明固定已完成。</li>
	<li>切除头部，并小心地将脑组织从颅骨中分离出来。操作时注意避免手术器械损伤脑组织。理想的灌注效果表现为脑组织颜色苍白（无血迹残留）且质地坚硬（图1A）。</li>
	<li>将完整的脑组织浸入4% PFA中，在4 °C下固定1小时。</li>
	<li>使用低温振动切片机（4 °C）将脑组织按所需切面连续切成50 µm厚的切片，并收集于PBS（0.1 M）中（图1B）。 
	注意：此步骤可根据具体实验方案采用多种方式进行。可在振动切片前分离半球，也可保持完整。若脑组织过大无法放置于振动切片机载物台上，可将其切成较小的组织块。此步骤完成后，切片可长期保存于-30 °C的防冻液中，防冻液由40% PB（50 mM）、30%甘油和30%乙二醇配制而成。</li>
</ol>
3. 包埋前免疫组织化学（图1C）
<ol>
	<li>配制4 L Tris缓冲盐水（TBS，50 mM，pH 7.6）贮存液，步骤如下。
	<ol>
		<li>在4 L烧杯中量取2 L蒸馏水，加入24.23 g三羟甲基氨基甲烷（THAM；C4H11一氧化氮3），搅拌至溶解。</li>
		<li>用约148 mL的1 N HCl将pH值调节至7.6。应谨慎加入酸，以避免pH值低于7.6。总体积应为4 L。 
		警告：盐酸具有强腐蚀性。请穿戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选取包含待进行电镜免疫组织化学处理的目标区域的切片（来自步骤2.11）。</li>
	<li>漂洗游离切片3次&#160;在 PBS（0.1 M，pH 7.4）中，室温下孵育 5 分钟&#160;以冲洗防冻液溶液。</li>
	<li>配制 0.5% 的 NaBH 溶液4 用 PBS 稀释。
	<ol>
		<li>称取 0.05 g NaBH₄。4 用10 mL PBS稀释，不加盖。此溶液需在使用前现配。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片置于新配制的 NaBH 溶液中孵育4 室温下孵育30分钟。轻轻摇动。勿封盖。</li>
	<li>洗涤 3 次&#160;在室温下用 PBS 洗涤 10 分钟，剧烈振荡，直至反应气体完全消失。</li>
	<li>用 PBS 稀释 2% 相应的正常血清和 0.5% 冷鱼胶，配制用于电镜的封闭液。 
	注意：应计算好用量，以确保足以完成接下来的三个步骤。使用与二抗宿主动物相同物种的血清。&#160;避免使用抗原修复方法或添加少量吐温（以增强抗体渗透），因为这些方法会显著损害组织质量。</li>
	<li>室温下用封闭液孵育切片1小时，轻轻振荡。</li>
	<li>用封闭液稀释一抗，配制一抗溶液。 
	注意：一抗的浓度通常与光镜免疫组织化学相同，但建议预先测试不同抗体浓度，因为某些一抗可能不适用于丙烯醛固定。若出现此情况，可使用含0.1–2%戊二醛与4%多聚甲醛的混合液进行心脏灌注，亦可获得类似结果。同时需优化孵育时间和温度。</li>
	<li>在室温下，将切片置于一抗溶液中，轻轻振荡孵育过夜。孵育时间和温度应采用先前已验证的条件。</li>
	<li>在室温下，用 PBS 轻柔振荡洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>用封闭液将生物素标记的二抗稀释1000倍，配制1:1000的溶液。 
	注意：二抗必须针对用于制备一抗的宿主物种产生。</li>
	<li>在室温下将切片置于二抗溶液中孵育1.5小时，轻轻摇动。</li>
	<li>在二抗孵育结束前至少60分钟，配制亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC）溶液。
	<ol>
		<li>使用校准过的移液器量取每毫升8.80 µL的A溶液和B溶液，用PBS稀释。</li>
		<li>室温下轻轻摇动至少60分钟，以确保亲和素与生物素分子完全结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在二抗溶液中孵育后，于室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在室温下将切片置于ABC溶液中孵育1小时，轻轻振荡。</li>
	<li>用 PBS 洗涤一次，再用 TBS 洗涤两次，每次 10 分钟，室温下轻轻摇动。</li>
	<li>配制新鲜的含0.005% H₂O₂的0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液2O2 用TBS稀释。
	<ol>
		<li>称取12.5 mg DAB，溶于25 mL冷TBS中。避光保存。 
		警告：DAB 粉末具有高度挥发性，吸入后有害，且具有致癌性和致畸性。因此，孕妇或哺乳期妇女即使在稀释情况下也不应操作该产品。操作时应佩戴 N95 口罩，并穿戴个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>过滤溶液，加入 4.5 µL 的 30% H2O2 使用前立即</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下将切片置于DAB溶液中孵育3至7分钟，轻轻摇动。 
	注意：为了防止背景染色过深，棕色沉淀不应过深，应相应优化孵育时间。</li>
	<li>通过在冷的TBS中快速洗涤两次，然后在室温下于冷的TBS中轻轻振荡洗涤两次，每次10分钟，再在PB中轻轻振荡洗涤两次，每次10分钟，以终止反应。 
	注意：必须使用PB（而非PBS），以彻底去除任何残留的NaCl，因为NaCl会与锇反应并形成晶体。</li>
</ol>
4. 用于电子显微镜观察的四氧化锇固定与包埋
<ol>
	<li>用 PB 缓冲液配制 1% 四氧化锇（OsO4）溶液。避光保存。 
	警告：锇具有高度毒性，不可接触皮肤、眼睛或口腔，不可吸入。若误食可致死亡。仅可在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>将切片置于通风橱中，在室温下用 OsO4 溶液孵育 30 分钟（不振荡），并用铝箔覆盖以避光。在加入 OsO4 溶液前，需将切片完全展平。 
	注意：此步骤后切片会变得非常深色且坚硬，操作时应格外小心。</li>
	<li>在锇酸固定期间，配制疏水性环氧树脂。
	<ol>
		<li>将环氧树脂混合物各组分按适当比例加入一个大塑料杯中（20 g 环氧树脂、20 g 固化剂、0.6 g 促进剂和 0.4 g 增塑剂）。用木棒或塑料移液管搅拌，直至获得均匀的棕色溶液。 
		注意：必须严格按照各组分的精确比例进行配制。</li>
		<li>根据待处理切片的数量，将等量混合物转移至适当大小的铝杯中，静置备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PB 缓冲液在室温下低速振荡洗涤经锇酸固定的切片，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>依次用下列梯度乙醇溶液对切片进行脱水，每步 2 分钟：35% 乙醇中 2 次；50%、70%、80%、90% 和 95% 乙醇中各 1 次；100% 乙醇中 3 次&#160;。</li>
	<li>将切片转移至玻璃瓶中，通过在丙烯酸甲酯中孵育 3 次（每次 2 分钟）完成脱水过程。 
	警告：丙烯酸甲酯是一种高度挥发性和有毒的有机溶剂，接触或吸入、误食后可能对眼睛或皮肤造成严重损伤。已被归类为 2 类致癌物。仅可在通风橱内使用，并穿戴个人防护装备（PPE）。该物质还具有高度易燃性，应远离任何热源。 
	注意：由于丙烯酸甲酯为有机溶剂，与塑料不相容，因此在本步骤前应小心将切片转移至玻璃瓶中。此时切片极为脆弱，操作需谨慎。也可选择在步骤 4.5 之前即将切片转移至玻璃瓶中。</li>
	<li>将切片逐一小心转移至铝杯中，尽量避免接触空气。将切片平埋于预先混合好的疏水性环氧树脂中，并在通风橱内室温孵育过夜。 
	注意：此步骤中切片已完全脱水且极为脆弱，操作时应格外小心。</li>
	<li>使用石蜡油制备涂有润滑脂的载玻片以及涂有润滑脂的塑料盖玻片。</li>
	<li>将铝杯在 60 °C 下孵育最多 12–15 分钟以软化树脂。将切片小心展平于载玻片的涂脂面，盖上涂脂的盖玻片，并小心挤出残留空气。</li>
	<li>将载玻片在 60 °C 下孵育 48 小时。 
	注意：孵育时间不得超过 48 小时，否则树脂会变得过硬。</li>
	<li>移除塑料盖玻片。</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜超薄切片观察的样品制备
<ol>
	<li>使用双目显微镜定位目标区域，并切割一块约1 mm的微小四边形组织2 用手术刀。</li>
	<li>将树脂块的尖端打磨平整，并将方形小块粘附于其上（图1C）。在切片前，让胶水至少干燥1小时或过夜。</li>
	<li>使用超薄切片机将方形组织块切成80 µm厚的切片（图1D).
	<ol>
		<li>将树脂块垂直放置于超薄切片机载物台上，使用锋利的剃刀刀片逐渐切割树脂块的每一侧，形成侧面光滑的梯形。</li>
		<li>将平台置于水平位置，并旋转模块，使梯形的最长边朝下。</li>
		<li>使用金刚石修块工具或玻璃刀修整四方形样品的表面。将超薄切片机设置为以1 mm/s的速度切割300 µm厚的切片。调整刀片使其与四方形样品垂直平行，并呈现约1°的微小水平角度。 
		注意：此角度可使操作者几乎平行于组织块表面进行切削，从而更有可能发现免疫标记的结构。使用金刚石修块工具并采用这些参数时，树脂呈现闪亮的白色；当切割到组织时，颜色会变为紫色或略带绿色。&#160;</li>
		<li>使用带有盛有蒸馏水舟槽的超薄45°钻石刀切取80 µm厚的切片，&#160;用二甲苯浸润的吸水纸轻轻擦拭切面以使其平滑，并将连续切片收集于聚乙烯醇包被的镍质载网或裸露的150目铜网上图1E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载网放入载网储存盒中。</li>
	<li>用柠檬酸铅对载网进行染色。
	<ol>
		<li>使用5 mL注射器和0.2 µm注射式滤器，将过滤后的柠檬酸铅贮存液与过滤的蒸馏水按1:1比例配制成溶液。避光保存。 
		注意：柠檬酸铅储备液应每月新鲜配制，以避免形成固体沉淀。储备液配方详见材料安全数据表。此外，若需染色的载网系列较多，当稀释液变浑浊时应及时更换。</li>
		<li>将每张载网置于稀释液滴上，使切片面与溶液接触，孵育3分钟。</li>
		<li>使用小镊子夹住载网，先后在两个盛有蒸馏水的烧杯中彻底冲洗。</li>
		<li>用吸水纸轻轻吸去多余水分。将载网放入载网盒中储存。在透射电子显微镜（TEM）观察切片前，静置30分钟。 图1F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种可靠的非人灵长类动物经心脏灌注及适用于电镜样本检测的包埋前免疫组织化学染色方案。尽管典型的冷冻电镜技术（如CEMOVIS）能够良好地保存脑组织超微结构，但其限制了免疫组织化学染色的应用12。其他技术，包括冷冻置换和Tokuyasu法，虽可实现包埋后免疫染色，但由于过程中需要额外设备，成本较高，且耗时较长、技术难度大12,14,15。此外，为了有效使用冷冻固定方法，样本必须相对较小（使用高压冷冻时厚度不超过200 µm28，常压下仅为10 µm29）。理想情况下，灵长类脑组织的冷冻固定需取自活检样本，这会导致难以准确定位目标区域。该问题必须通过立体定位坐标来规避。上述采用丙烯醛化学固定结合包埋前免疫染色的技术，为灵长类脑组织样本制备和电镜水平的免疫标记提供了一种简便、低成本、高效且可靠的方法。按照本...

光学显微镜技术，包括共聚焦显微镜和双光子显微镜，已被证明是研究 体内 神经元突起等结构1,2尽管光学显微镜（LM）水平的典型空间分辨率约为200 nm，但近年来利用不同光源（如极紫外光和软X射线显微技术）的技术进步已显著将该分辨率提升至接近10 nm的空间分辨率。3,4,5其他成像技术的进步包括磁共振成像与组织学的结合，为测量髓鞘厚度提供了一种新方法 体内，这一参数传统上仅能在电子显微镜（EM）水平下测量6,7尽管在光学显微镜（LM）水平上的这些进展为研究生命过程提供了极佳的工具，但对突触接触等结构进行详细观察和表征仍需依赖电子显微镜（EM），其分辨率可达0.5 nm。然而，电子显微镜观察要求样品必须死亡并在一定程度上经过化学固定剂处理和脱水等处理方式，以保持细胞结构的完整性。因此，由于电子束引起的辐射损伤、对比度低、膜结构的形变，或在脱水及环氧树脂包埋后可能出现的假象，高分辨率下生物样品的观察仍具有挑战性。8,9,10.
通过使用&#34;Cryo EM of Vitrified Sections&#34; 或 CEMOVIS 技术，可将样本以接近天然状态的形式保存，用于结构分析。该方法涉及将样本快速冷冻并包埋于玻璃态冰中，随后在低温电子显微镜下观察超薄切片11,12。此技术可在样本保持固态且充分水合的状态下进行观察，从而避免脱水过程所导致的结构伪影13。然而，该方法需要配备用于冷冻超薄切片的额外设备，以及对常规电镜进行低温观测所需的附加装置，导致显著增加的成本。此外，CEMOVIS 方法无法应用免疫标记技术，因为抗体通常需在室温（RT）下孵育。另一种替代方案是采用冷冻置换法，将冷冻固定的样本在低温保护性化学试剂中缓慢解冻，随后包埋于Lowicryl等特殊树脂中，从而实现超微结构分析与免疫组织化学的结合12。可在包埋后对此类样本进行免疫标记。然而，冷冻置换与冷冻固定技术耗时较长，需安装额外设备，且样本仍需暴露于有机溶剂和化学固定剂中，即使在低温条件下，也可能改变细胞的超微结构14,15。因此，尽管光学显微镜和电子显微镜技术均已取得显著进展，化学固定脑组织（特别是使用丙烯醛固定）仍是将免疫组织化学与电镜技术相结合的一种低成本且高效的方法16。
近几十年来，人们进行了许多尝试，以寻找能够提供最佳组织保存效果的醛类混合物。在20世纪60年代之前，唯一可用于电镜（EM）且效果可接受的化学固定剂是四氧化锇。然而，四氧化锇具有高度毒性和昂贵成本，限制了其通过血管系统用于固定脑等器官。丙烯醛于20世纪50年代末被引入，作为一种适用于电镜观察细胞结构的动物组织保存的可靠方法17。与其他醛类相比，丙烯醛在浸入式固定时能更深入地渗透组织，反应速度更快，并能良好保存细胞质成分，同时使组织收缩最小化17。这一特性使得丙烯醛固定在新鲜组织中的应用明显优于其他醛类，能够更准确地定位活体分子化合物，如酶和其他蛋白质18。事实上，多年来丙烯醛固定已被验证为一种简便、高效且低成本的电镜水平可视化方法，适用于多种物种（包括两栖类和啮齿类），因其能有效稳定肽和蛋白质、保留抗原性，并在与其他醛类固定剂联合使用时提供相对完整的超微结构16,18,19,20,21。针对啮齿类动物的丙烯醛固定方案此后已实现标准化并被广泛使用，尤其是Pickel研究组将其应用于电镜水平的双重免疫标记16,22。少数研究组已在非人灵长类脑组织中使用丙烯醛固定23。然而，据我们所知，目前仅有一篇已发表的方案详细描述了适用于非人灵长类且兼容电镜免疫标记的丙烯醛化学固定方法24。
本文提供了一种简便且可靠的方法，可使用丙烯醛对非人灵长类动物脑组织进行高效的化学固定，从而实现长期保存，并可用于包埋前免疫标记及透射电镜检查。

<table><tbody><tr><td>无水磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>EM Science</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>羟甲基氨基甲烷（THAM）</td><td>Fisher scientific</td><td>T370-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>1 N 稀释液。产品具有腐蚀性。使用时应采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590-1</td><td>5 N 稀释液。产品具有腐蚀性。使用时应采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% 稀释液。粉末形式高度挥发且剧毒。应在通风橱内谨慎操作，并采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>丙烯醛（90%）</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>3% 稀释液。产品剧毒。应在通风橱内操作，并采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>尸体解剖通风台</td><td>Mopec</td><td>CE400</td><td></td></tr><tr><td>电子灌注泵</td><td>cole parmer</td><td>masterflex L/S 7523-90</td><td></td></tr><tr><td>灌注针头</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-1838R</td><td>18 G 11/2</td></tr><tr><td>针头</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-2713R</td><td>21 G 1/2</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>4 mg/kg</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td></td><td></td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Feather&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; lance</td><td>201011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; J9913</td><td>手术使用 No.22，电镜使用 No.11</td></tr><tr><td>手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>每次使用前校准刀片（在设备允许的情况下）</td></tr><tr><td>振动切片机刀片</td><td>Gillette</td><td>GIN 642107</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>30% 稀释液</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Fisher scientific</td><td>E178-4</td><td>30% 稀释液</td></tr><tr><td>硼氢化钠（NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>S-9125</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清（NHS）</td><td>Jackson immunoResearch Laboratories</td><td>008-000-121</td><td>2% 稀释液</td></tr><tr><td>冷鱼明胶</td><td>Aurion</td><td>900.033</td><td>0.5% 稀释液。原始产品浓度为 40%</td></tr><tr><td>一抗，SERT</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>SC-1458</td><td>1/500 稀释</td></tr><tr><td>一抗，ChAT</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB144P</td><td>1/25 稀释</td></tr><tr><td>一抗，TH</td><td>ImmunoStar</td><td>22941</td><td>1/1,000 稀释</td></tr><tr><td>生物素化二抗，山羊来源</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-9500</td><td>1/1,000 稀释</td></tr><tr><td>生物素化二抗，小鼠来源</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-2000</td><td>1/1,000 稀释</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 试剂盒</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td>每毫升 A 和 B 各 8.8 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺（DAB）</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td>0.05% 稀释液。粉末形式高度挥发且有毒。废弃物不得倒入水槽。</td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）30%</td><td>Fisher scientific</td><td>H-323</td><td>0.005% 稀释液</td></tr><tr><td>四氧化锇（OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Electron microscopic science</td><td>2% 19152&lt;br /&gt;4% 19150&lt;br /&gt;</td><td>原始溶液可为 2% 或 4%。注意计算最终 1% 稀释液时所用的浓度。产品对光极为敏感。锇具有高度毒性。仅可在通风橱内使用，并采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>Durcupan 防水环氧树脂</td><td>Sigma</td><td>A: M 环氧树脂（44611）&lt;br /&gt;B: 固化剂 964（44612）&lt;br /&gt;C: 加速剂 960（DY 060）（44613）&lt;br /&gt;D: 增塑剂（44614）&amp;nbsp;</td><td>聚合前在 58 &amp;deg;C 下加热 48 小时，之后方可作为废弃物处理。</td></tr><tr><td>铝制样品杯</td><td>Electron microscopic science</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>commercial alcohols</td><td>1019C</td><td>用蒸馏水稀释至适当浓度</td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Electron microscopic science</td><td>20401</td><td>有机溶剂。高度挥发且有毒。应在通风橱内使用。</td></tr><tr><td>未镀膜中等载玻片</td><td>brain research laboratories</td><td>3875-FR</td><td>用矿物油涂抹表面</td></tr><tr><td>塑料膜（Aclar 包埋膜）</td><td>Electron microscopic science</td><td>50425-25</td><td>用矿物油涂抹表面</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>钻石修块刀（ultratrim）</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>UT 1081</td><td>也可使用玻璃刀替代</td></tr><tr><td>45&amp;deg; Diatome 钻石刀</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>MC13437</td><td>配备小舟</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher scientific</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>150 目铜网</td><td>Electron microscopic science</td><td>G150-cu</td><td></td></tr><tr><td>铜网盒</td><td>Electron microscopic science</td><td>71138</td><td>最多可存放 100 个铜网</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Anachemia</td><td>81983</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>Sigma</td><td>L-6258</td><td>将 1.33&amp;nbsp;g 硝酸铅和 1.76&amp;nbsp;g 柠檬酸钠溶于 42&amp;nbsp;mL 预先煮沸并冷却的蒸馏水中，待硝酸铅完全转化为柠檬酸铅后，加入 8&amp;nbsp;mL 1&amp;nbsp;N NaOH，配制成储备液。pH 值应约为 12。溶液应储存于密封塑料瓶中，并避光保存。</td></tr><tr><td>注射器</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>SS-05L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Corning</td><td>431222</td><td>0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>吸水纸（bibulous paper）</td><td>Electron microscopic science</td><td>70086-1</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Laboratory film</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr></tbody></table>

非人灵长类动物脑组织的制备用于包埋前免疫组织化学与电子显微镜观察

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

尽管光学显微镜技术取得了所有进步&#160;在神经科学领域，电子显微镜仍是研究和表征神经元超微结构与形态细节（如突触连接）的唯一工具。通过严格的冷冻固定方法可实现脑组织在电镜观察中的良好保存，但这些技术成本较高，且限制了免疫标记的应用——而免疫标记对于理解特定神经系统的连接性至关重要。为此，已发展出冷冻置换技术，以实现冷冻固定与免疫标记的结合。然而，这些方法的可重复性通常依赖于昂贵的冷冻设备。此外，该技术获得可靠结果的过程耗时较长，且对操作技能要求较高。因此，传统的化学固定脑组织方法，特别是使用丙烯醛作为固定剂的方法，仍然是将电子显微镜与免疫组织化学相结合的一种高效、低成本的方案。本文提供了一种可靠的实验流程，采用化学丙烯醛固定法，可有效保存灵长类动物脑组织，并适用于包埋前免疫组织化学染色及透射电子显微镜观察。

本部分展示了在透射电子显微镜水平观察经3%丙烯醛与4%多聚甲醛混合液化学固定后的灵长类动物脑组织免疫染色样本所获得的代表性结果。超微结构保存良好，表现为髓鞘相对完整，双层膜结构清晰可见（图2A）。突触连接以及来自微环境的神经元结构可被明确识别（图2B）。在电镜下，以二氨基联苯胺（DAB）免疫沉淀物标记的神经元结构因其胞质或轴浆内充满沉淀物而得以辨认。质膜以及细胞器的外表面也通常可见电子致密沉淀物的包被（图3）。
在本实验中，我们使用了针对5-羟色胺转运体（SERT）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）或酪氨酸羟化酶（TH）的抗体，以可视化松鼠猴苍白球外侧段（GPe）或内侧段（GPi）中经免疫标记的神经元结构（图3）。为此，我们采用了一种固定液组合，既能保持抗原性，又能保存超微结构，从而实现细致的形态学观察。尽管上述经心灌流固定...

本文提供了一种简便、低成本且省时的化学固定方法，使用丙烯醛固定剂固定灵长类动物脑组织，可实现长期保存，并适用于透射电子显微镜所需的包埋前免疫组织化学分析。

尽管在光学显微镜技术层面取得了诸多进步，电子显微镜仍然是神经科学中用于观察和研究……的唯一工具

本实验的总体目标是获得适用于透射电镜观察的非灵长类脑组织包埋前免疫染色结果。该方法有助于回答神经解剖学领域的关键问题，例如特定脑结构中某种神经支配的突触发生率。该技术的主要优势在于，它是一种简便且低成本的特异性神经支配标记方法，适用于电子显微镜观察。首先，将含有目标区域的经丙烯醛固定的非人灵长类动物脑组织切成50微米厚的切片，并转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的12孔板中。在室温下用PBS漂洗游离切片三次，每次5分钟；随后将切片置于新鲜配制的硼氢化钠溶液中，在室温下孵育30分钟。孵育过程中轻轻摇动，无需加盖。30 分钟结束后，吸除硼氢化钠，并向每孔中加入 PBS。将培养板置于摇床，剧烈振荡 10 分钟。重复洗涤两次以上，直至无反应气体残留为止。将切片置于含2%正常血清和0.5%冷鱼胶原的PBS溶液中，室温下轻轻振荡孵育1小时进行封闭。封闭结束后，将切片转移至一抗溶液中，室温下轻轻振荡孵育过夜。次日，按前述方法洗涤切片后，将切片置于二抗溶液中，室温下轻轻振荡孵育一个半小时。按照之前的方法洗涤切片后，将切片在亲和素-生物素-过氧化物酶或ABC溶液中室温震荡孵育1小时。接着，配制新鲜的DAB显色液：将0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine）与0.005%过氧化氢溶于TBS缓冲液中。洗涤切片后，将其置于DAB溶液中，在轻柔震荡条件下孵育3至7分钟。当棕褐色沉淀达到理想颜色后，立即用冷TBS快速洗涤两次以终止反应，随后进行一系列定时的TBS和PB洗涤。将含有DAB染色切片的培养板转移至通风橱中。将切片转移至盛有PB的六孔板中，通过小心吸去PB缓冲液使切片完全展平，然后逐滴加入四氧化锇溶液，避免扰动已展平的切片。用铝箔覆盖载玻片，以保护切片免受光照，并在室温下静置孵育30分钟，避免振荡。在锇酸固定期间，通过将环氧树脂混合物的各组分按适当比例加入一个大塑料杯中，制备疏水性环氧树脂。用木棒或塑料移液管搅拌，直至获得均匀的棕色，然后将等量树脂转移至适当大小的铝杯中（铝杯数量需与待处理切片数量匹配），静置备用。锇酸固定时间结束后，用磷酸缓冲液（PB）以低速振荡洗涤切片三次，每次10分钟。洗涤后，将切片依次浸入梯度乙醇溶液中脱水，每级乙醇处理2分钟。随后，将切片转移至装有丙烯酸氧化物的玻璃小瓶中，再用丙烯酸氧化物孵育三次，每次2分钟，以完成脱水过程。然后将切片逐一小心转移至铝杯中，尽量避免与空气接触。将切片平整地包埋于预先混合好的疏水性环氧树脂中，并在室温下于通风橱内孵育过夜。次日，用矿物油涂抹载玻片和塑料盖玻片，随后将铝杯置于60摄氏度条件下孵育最多12至15分钟，以软化树脂。将切片在载玻片涂油的一侧轻轻压平。盖上涂油的盖玻片，并小心地排出任何残留的气泡。将载玻片置于60摄氏度下孵育48小时。48小时后，移除塑料盖玻片，使切片仍包埋在树脂中。首先使用双目镜定位目标区域，然后用解剖刀切割出约一平方毫米大小的方形组织小块。接着，将树脂块的尖端修平，再将方形组织块粘附于其上。干燥后，将树脂块垂直放置于超薄切片机的载物台上，使用锋利的剃刀片逐渐切割树脂块的每一侧，形成具有光滑侧面的梯形。接下来，将载物台转至水平位置，并旋转树脂块，使梯形的最长边朝下。将金刚石修块刀具或玻璃刀放置于指定位置。将超薄切片机设置为以每秒一毫米的速度切割300微米的切片。调整刀片使其与四方形组织块垂直平行，并呈现约一度的微小水平角度，修整四方形组织块表面，直至组织开始显露。随后，更换为装有蒸馏水舟的超45度金刚石刀，用于切割80微米厚的切片。用浸过二甲苯的吸水纸轻轻擦拭切片表面（不要接触水面）以展平切片，并将连续切片收集到裸露的150目铜网上。将铜网放入网格储存盒中，然后配制一份柠檬酸铅储备液与蒸馏水1:1的混合溶液，并通过0.2微米注射器滤器过滤。用铝箔包裹小瓶以避光保存。将每张载网置于一滴稀释的柠檬酸铅溶液上，使切面与溶液接触。然后用小镊子夹住载网，在两个盛有蒸馏水的烧杯中彻底冲洗。用吸水纸轻轻吸去多余水分，将载网放入载网盒中。30分钟后，可用透射电子显微镜观察切片。这幅松鼠猴内侧苍白球的电子显微照片显示了经丙烯醛-多聚甲醛经心灌注后，采用免疫过氧化物酶二氨基联苯胺技术处理，组织保存良好。如图所示，该方法可清晰观察到由箭头指示的大轴突的髓鞘结构。这幅外侧苍白球的电子显微照片显示了由字母 d 指示的树突轮廓、由 a 指示的小型无髓轴突，以及标记为 av 的轴突曲张体，均可被清楚识别。箭头显示了一个轴突曲张体与树突轮廓形成对称性突触接触的示例。免疫标记的结构可通过其细胞质或轴浆内充满电子致密的DAB沉淀物而轻松识别。此处，苍白球内侧部（GPi）中一个经胆碱乙酰转移酶免疫染色标记的树突，接受了一个未标记轴突曲张体的突触输入。该电子显微照片显示了苍白球外侧部（GPe）中一条具有相对完整髓鞘的有髓轴突，其轴浆内酪氨酸羟化酶呈免疫标记阳性。此例显示了苍白球内侧部（GPi）中一个5-羟色胺转运体免疫标记阳性的轴突曲张体，该曲张体与一条树突形成对称性突触接触。在此例中，DAB沉淀物沿质膜以及细胞器的外表面分布。此处所示的轴突曲张体是在苍白球外侧部（GPe）中观察到的，并对酪氨酸羟化酶进行了免疫标记。这代表了DAB沉淀物完全充满轴浆的一个示例，其中突触小泡可见但较难分辨。完成此操作后，可进一步采用其他方法，如包埋前双重免疫组织化学，以回答更多问题，例如在突触水平上蛋白质或受体的共定位情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对非灵长类脑组织进行包埋前免疫组织化学处理，随后将其包埋于环氧树脂中，并将目标区域超薄切片至80微米厚度，以适用于电子显微镜观察。

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非人类灵长类动物脑组织的制备预嵌入免疫组化和电子显微镜

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来源：Eid, L. &amp; Parent, M. 非人灵长类动物脑组织用于包埋前免疫组织化学与电子显微镜检查的制备方法。J. Vis. Exp.

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学习使用丙烯醛固定非人灵长类动物脑组织进行预包埋免疫组化和电子显微镜观察的方法。该技术成本低、操作简便，可实现长期保存并精确定位突触结构。

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