非人类灵长类动物脑组织的制备预嵌入免疫组化和电子显微镜

本实验的总体目标是获得用于电子显微镜的非灵长类脑组织的可靠预包埋免疫染色。这种方法可以帮助回答神经解剖学领域的关键问题，例如精确大脑结构中给定神经支配的突触发生率。该技术的主要优点是它是一种简单且低成本的方法，可以标记适用于电子显微镜的特定神经支配。

首先将含有感兴趣区域的 50 微米厚的丙烯醛固定非人灵长类动物脑切片转移到含有 PBS 的 12 孔板中。在室温下用 PBS 洗涤自由漂浮切片 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下将切片在新鲜制备的硼氢化钠溶液中孵育 30 分钟。轻轻摇晃，不要盖上盖子。

30 分钟过后，吸出硼氢化钠并向每个孔中加入 PBS。将板放在摇杆上，剧烈摇晃 10 分钟。再重复洗涤两次或直到没有反应气体残留。

2% 正常血清和 0.5% 冷鱼明胶的 PBS 稀释溶液中在室温下轻轻摇动孵育 1 小时来封闭切片。孵育时间过后，在室温下轻轻摇动一抗溶液中孵育切片过夜。第二天，像以前一样清洗切片后，在室温下轻轻摇动切片在二抗溶液中孵育一个半小时。

像以前一样清洗切片后，在亲和素-生物素-过氧化物酶或 ABC 溶液中摇动孵育 1 小时。接下来，制备 0.05%3， 3'二氨基联苯胺和 0.005% 过氧化氢（用 TBS 稀释）的新鲜溶液。洗涤后，将切片在 DAB 溶液中孵育 3 到 7 分钟，轻轻摇动。

一旦棕色沉淀发展成所需的颜色，通过在冷 TBS 中快速洗涤两次来终止反应，然后通过一系列定时 TBS 和 PB 洗涤。将包含 DAB 染色切片的板转移到通风罩上。将切片转移到充满 PB 的六孔板中，小心地将 PB 从板中移出，使切片完全变平，然后逐滴加入四氧化锇溶液，以避免干扰压平的部分。

用铝箔盖住板以保护切片避光，并在室温下孵育 30 分钟，不要搅拌。在渗透过程中，将环氧树脂混合物的每种组分加入适量的憎水环氧树脂到一个大塑料杯中。用木棒或塑料移液管搅拌，直到获得均匀的棕色，然后将等量的树脂转移到适合待处理切片数量的铝杯中，并静置。

渗透期过后，用 PB 清洗切片 3 次，用低速摇动 10 分钟。洗涤后，将以下系列分级乙醇中的切片脱水，每个切片 2 分钟。接下来，将切片转移到装满环氧丙烷的玻璃瓶中，并在环氧丙烷中孵育 3 次，每次 2 分钟，以完成脱水过程。

然后小心地将各部分一个一个地转移到铝杯中，尽可能避免与空气接触。将切片平铺嵌入先前混合的防水环氧树脂中，并在室温下在通风罩下孵育过夜。第二天，用矿物油涂覆载玻片和塑料盖玻片，然后将铝杯在 60 摄氏度下孵育最多 12 至 15 分钟，以软化树脂。

小心地将载玻片涂有油脂的一侧的部分压平。放上涂有油脂的盖玻片，小心地推出所有剩余的空气。将玻片在 60 摄氏度下孵育 48 小时。

48 小时后，取下塑料盖玻片，将切片包裹在树脂中。首先使用双筒望远镜定位感兴趣的区域，然后使用手术刀切下一块约 1 平方毫升的小四边形组织。接下来，锉平树脂块的尖端，然后将四边形组织片粘在上面。

干燥后，将树脂块垂直放置在超薄切片机甲板中，用锋利的剃须刀片逐渐切割树脂块的每一面，形成侧面光滑的梯形。接下来，将甲板放在水平位置并旋转块，直到梯形的最长边朝下。将金刚石修剪工具或玻璃刀放在专用空间内。

将超薄切片机设置为以每秒 1 毫米的速度切割 300 微米的切片。将刀调整为垂直平行于四边形块，并显示大约一度的非常小的水平角，并修剪四边形块的表面，直到组织开始出现。现在，改用配备装满蒸馏水的船的超 45 度金刚石刀，以切割 80 微米厚的切片。

用一张浸有二甲苯的吸收纸在不接触水面的情况下越过切片，使切片平滑，并在裸露的 150 目铜网格上收集连续切片。将网格放入网格储存盒中，然后制备柠檬酸铅原液和蒸馏水的一对一溶液，并通过 0.2 微米注射器过滤器过滤。用铝箔盖住样品瓶以保护其避光。

将每个网格放在一滴稀释的柠檬酸铅溶液上，使部分与溶液接触，然后用小镊子固定网格，并在两个装有蒸馏水的烧杯中彻底冲洗。用吸水纸轻轻去除多余的水，然后将网格放入网格盒中。30 分钟后，可以通过透射电子显微镜检查切片。

这张松鼠猴内部苍白球的电子显微镜照片显示，在免疫过氧化物酶二氨基联苯胺技术中，丙烯醛-PFA 经心灌注后，物质保存完好。从那里看到，该程序允许看到由箭头指示的大轴突的髓鞘。这张苍白球外球的电子显微镜照片显示了树突状轮廓，用字母 d 表示，小的无髓轴突，用 a 表示，轴突曲张，标记为 av，可以很容易地识别。

箭头显示了轴突曲张与树突轮廓建立对称突触接触的实例。免疫标记元件可以很容易地通过其充满电子致密 DAB 沉淀物的细胞质或轴质来识别。在这里，GPi 中胆碱乙酰转移酶免疫染色的树突接收来自未标记轴突曲张的突触接触。

该电子显微镜照片显示 GPe 中有一个有髓鞘轴突，具有相对完整的髓鞘，其轴质被酪氨酸羟化酶免疫标记。这个例子显示了 GPi 免疫标记的 5-羟色胺转运蛋白中的轴突曲，它与树突建立了对称的突触接触。在这个例子中，DAB 沉淀物排列在质膜和细胞器的外表面。

此处显示的轴突曲张在 GPe 中观察到，并针对酪氨酸羟化酶进行免疫标记。这代表了 DAB 沉淀物完全充满轴质的一个例子，突触小泡是可见的，但更难描绘。按照此程序，可以执行其他方法，如预嵌入双免疫组化，以回答其他问题，如蛋白质或受体在突触水平的共定位。

看完这个视频，你应该对如何准备非灵长类动物脑组织的预包埋免疫组织化学有一个很好的了解，进行环氧树脂的包埋，并将感兴趣的区域超切成适合电子显微镜的 80 微米厚的切片。