使用 体外 利用活细胞成像技术探究脂质纳米颗粒递送的化疗药物

该活细胞成像技术的总体目标是，在无需固定细胞的情况下，实时追踪细胞过程，例如化疗药物的摄取与分布。这些方法有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如：游离形式或纳米颗粒包封形式的化疗药物如何被肿瘤细胞摄取。该技术的主要优势在于我们对活细胞进行成像，从而避免了固定带来的假象，并实现了对细胞动态过程的实时评估。

我们最初产生这一方法的想法，源于在固定过程中观察到纳米颗粒发生降解，从而导致对药物递送的误判。组装成像腔时，将一片25毫米的盖玻片置于腔体底部，再将上部拧入底部。切勿过度拧紧，以免玻璃破裂。

对整个培养室进行高压灭菌。接种细胞时，在超净工作台内从灭菌袋中取出成像培养室，小心拧紧，并将其放入培养皿中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用一毫升0.1%无菌明胶处理成像培养皿的玻璃表面，孵育20分钟。从细胞培养瓶中移除培养基后，用1×PBS洗涤细胞一次，然后使用0.25%胰蛋白酶消化细胞使其脱离。加入细胞培养基以灭活胰蛋白酶。

然后，收集细胞并在 1,100 ×g 条件下离心五分钟。将沉淀重悬于 5 mL 细胞培养基中。按照文本方案中所述计数细胞后，吸除明胶，并以适当的稀释度接种细胞，使其在 24 小时内达到最多 70% 的汇合度。

将细胞置于5%二氧化碳、37°C条件下培养24小时，使其贴壁。在显微镜下观察细胞，评估其汇合度、细胞形态及污染情况。随后，打开共聚焦显微镜、荧光光源和计算机。

将镜头加热器连接到物镜上，并将其设置为35摄氏度。按照文本方案准备孵育装置。将孵育装置放置在显微镜载物台上，并连接二氧化碳进气管和出气管。

打开主二氧化碳阀门并开启二氧化碳控制器。检查控制器是否设定为5%二氧化碳。温度、CO2、pH、湿度和无菌性等适当的细胞培养条件对于长期细胞成像至关重要。

因此，每个培养箱都需要进行适当测试。将载物台温度设置为37摄氏度。让培养单元达到选定的温度和二氧化碳百分比。

从主二氧化碳培养箱中取出成像室，用培养皿将其运送至显微镜室。将成像室放入定制的35毫米直径载物台固定装置中，并用定制的密封盖封闭成像室。打开培养单元，迅速操作以防止细胞冷却；将红色封片替换为成像室，然后关闭单元。

确保载物台与显微镜之间没有电缆被夹住。让设备静置30分钟以适应环境温度。接着，打开软件并开启激光器。

单击“文件”选项卡下的“新建”以创建新数据库。为数据库命名并保存。单击“采集”选项卡下的“配置”以设置配置参数。

选择“通道模式”和“单轨”以检测单一荧光染料。若检测多种荧光染料，则选择“多轨”。然后选择合适的带通滤光片，并与相应的荧光染料相匹配。

选择其中一个轨道中的明场通道。扫描效果会受到化合物荧光信号与图像质量之间平衡的影响。曝光过度、光漂白、信噪比、细胞状态以及添加的化合物等因素均可能影响实验结果，需进行充分优化和测试。

通过点击“采集”选项卡下的“扫描”来设置扫描控制。然后点击“模式”以设置帧尺寸、扫描速度、扫描方向和扫描平均值。点击“通道”以设置针孔、增益与偏移以及激光功率。

通过点击“配置”选项卡中的“Config”来保存这些设置，并将其保存到配置数据库中。在“宏”选项卡中点击“Muti TimeX”以设置时间间隔。点击“单个位置”。

通过单击“单轨”应用已保存的配置，并在配置数据库中滚动至所需的配置。设置时间间隔和扫描次数。单击“加载配置”以加载配置。

在“基础文件名”中为延时成像命名，并通过点击“图像数据库”选择数据库以保存延时成像。通过点击“临时图像文件夹”设置临时文件夹。接下来，打开培养单元，抬起成像环，在物镜上滴加一滴浸油，然后尽快关闭单元。聚焦并在成像腔室中选择一个位置。

在层流柜中，将游离药物或纳米颗粒用细胞培养基稀释至药物浓度为每毫升5微克或脂质浓度为0.05微摩尔。如果药物或纳米颗粒不具无菌性，则需通过0.22微米针头滤器过滤。打开培养室并掀开顶盖。

然后，移除细胞中的培养基，加入一毫升稀释的药物或纳米颗粒，并尽快关闭成像单元。聚焦于细胞，在“扫描控制”选项卡中点击“Single”进行快速扫描。当明场图像显示细胞清晰聚焦时，在“Multi TimeX Macro”中点击“Start Time”开始延时成像。

重复次数和剩余时间显示在宏和图像中。请定期检查细胞是否仍处于焦距范围内，或使用自动对焦功能。该程序会自动将延时图像保存至数据库。

程序运行时请勿关闭数据库。这是细胞暴露于游离阿霉素后连续三小时的延时成像。观察红色荧光阿霉素被摄取后立即向细胞核转位的过程。

此处，细胞与包封的阿霉素共同孵育三小时。荧光信号明显较弱，主要位于细胞质中，细胞核内信号几乎不可见。

将这些延时电影导入Image J后，可在细胞核周围绘制感兴趣区域，并测量像素密度。此处展示的图表显示了用游离或包封的阿霉素孵育的细胞中，随时间变化的细胞核摄取差异。图中所示为用包封的阿霉素孵育的细胞，以红色显示。

紫色信号代表载体，溶酶体用绿色活细胞标记物染色。比较两种细胞类型可发现溶酶体分布的差异。B16BL6细胞中的溶酶体分布在细胞质中。

然而，BLM细胞中的溶酶体位于细胞核附近。但两种细胞系均显示出溶酶体中红色与紫色信号的高度共定位，表明阿霉素及其载体被滞留在这些细胞器中。观看本视频后，您应能充分理解如何对活细胞中数小时甚至数天内化疗药物及其他荧光标记物的摄取过程进行成像观察。