Name: 使用体外活体细胞成像技术研究脂纳米粒子化疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习活细胞成像技术用于实时追踪肿瘤细胞对化疗药物的摄取与分布。该方法避免固定伪影，可动态评估纳米粒子递送机制，为癌症治疗研究提供准确数据。

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所使用的显微镜设施隶属于伊拉斯谟光学成像中心，我们谨向光学成像中心工作人员提供的技术支持表示感谢。

1. 准备
<ol>
	<li>组装成像室，成像室由两部分组成。
	<ol>
		<li>将一个25 mm的盖玻片（图1A-1）放置在成像室的底部（图1A-2），然后将上部旋入底部（图1A-3）。切勿拧得过紧，以免玻璃破裂。对整个成像室进行高压灭菌（图1A-4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌条件下，通过向不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%热灭活胎牛血清（FCS）和1 mM L-谷氨酰胺来制备细胞培养基。4 °C保存，使用前预热至37 °C。</li>
	<li>采用标准细胞培养技术，使用细胞培养基在培养瓶中维持细胞生长。 
	注：本实验中使用了两种小鼠细胞系，即黑色素瘤B16BL611和Lewis肺癌（LLC），以及两种人源黑色素瘤细胞系BLM和1F612。</li>
	<li>称取明胶，加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37 °C条件下过夜溶解，配制成0.1%明胶溶液。使用0.22 µm滤器过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 培养细胞
<ol>
	<li>在超净工作台中从灭菌袋中取出成像腔室，小心拧紧腔室，并将其放入培养皿中。 
	注意：为避免污染，在将腔室置于显微镜下之前，应始终将其保留在培养皿中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，用1 mL 0.1%无菌明胶对成像腔室的玻璃表面进行包被，孵育20分钟。 
	注意：这有助于细胞更好地贴附。</li>
	<li>从细胞培养瓶中移除培养基（见步骤1.2和1.3），用1x PBS洗涤一次，使用0.25%胰蛋白酶消化使细胞脱落。加入细胞培养基以终止胰酶消化作用，收集细胞，在1,100 × g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于5 mL细胞培养基中。</li>
	<li>取20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝混合（死细胞会摄取台盼蓝），使用血细胞计数板计数活细胞与死细胞数量；死细胞比例不应超过10%。</li>
	<li>吸除明胶溶液，将细胞以适当稀释度接种，确保24小时内细胞覆盖率达到最多70%。例如，可使用5 × 104或10 × 104个细胞/1 mL的接种密度。将细胞置于5% CO2、37 °C条件下培养24小时，使其充分贴壁。</li>
</ol>
3. 时间序列显微镜（图2）
注意：此处使用了带有定制载物台支架的共聚焦显微镜，尽管大多数制造商提供多种适用于活细胞成像的培养箱，这些培养箱同样适用于纳米颗粒药物递送的研究。
<ol>
	<li>在显微镜下评估细胞的融合度、细胞形态及污染情况。将培养腔放回 CO2 培养箱。 
	注意：细胞融合度不应超过 70%。若细胞形态异常（即细胞无法贴壁）或检测到污染，请丢弃该成像腔。</li>
	<li>打开共聚焦显微镜（图 1E-1）、荧光光源（图 1E-2）和计算机（图 1E-3）。</li>
	<li>将镜头加热器连接至物镜，并设定为 35 °C（图 1E-4 + 插图）。</li>
	<li>按照图 1B所示准备孵育装置。 
	注意：该装置包括加热载物台（图 1B-1）、带 CO2 管路接头的流动载物台（图 1B-2）和 CO2 探针（图 1B-3），以及一个红色封闭贴片（图 1B-4）。该贴片用于在放置成像腔之前暂时封闭装置。</li>
	<li>将孵育装置放置在显微镜载物台上，并连接进气和出气的 CO2 管路（图 1E-5）。打开主 CO2 阀门（图 1E-6），并开启 CO2 控制器（图 1E-7）。检查控制器是否设定为 5% CO2。 
	注意：为实现湿度控制，CO2 气体需通过加湿器（图 1E-8）。对于缺氧实验，系统中还包括一个独立的 O2 调节器（图 1E-9）。</li>
	<li>将载物台温度设定为 37 °C（图 1E-10）。对于高温实验，将温度设定为 42 °C。使孵育装置达到设定的温度和 CO2 浓度。</li>
	<li>从主 CO2 培养箱中取出成像腔，并将其置于培养皿中运送至显微镜室。</li>
	<li>将成像腔（图 1A-4）放入定制的直径为 35 mm 的载物台支架（图 1A-5）中，并用定制的密封盖（图 1A-6）封闭成像腔。 
	注意：该盖子允许 CO2 通过，同时防止蒸发和污染。
	<ol>
		<li>打开孵育装置，用成像腔替换红色贴片，并关闭装置（图 1C）。此操作应尽快完成，以避免细胞冷却。确保载物台与显微镜之间无电缆卡住。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让装置平衡适应环境 30 分钟。</li>
	<li>打开软件并开启激光器。 
	注意：本实验中使用了 488 nm 氩离子激光器、543 nm 氦-氖激光器和 633 nm 氦-氖激光器。</li>
	<li>点击“文件”选项卡下的 &#34;新建&#34; 创建一个新的数据库。为数据库命名并保存。</li>
	<li>点击“采集”选项卡下的 &#34;配置&#34; 设置参数。选择 &#34;通道模式&#34; 和 &#34;单轨&#34; 以检测单一荧光染料，或选择 &#34;多轨&#34; 用于多个荧光染料。选择与荧光染料匹配的带通滤光片（例如，dox 和 Dox-NP 使用 560 至 615 nm 带通滤光片；更多示例见“代表性结果”部分）。在其中一个轨道中选择明场通道。</li>
	<li>点击“采集”选项卡下的 &#34;扫描&#34; 设置扫描控制。点击 &#34;模式&#34; 设置帧尺寸（1,024 × 1,024）、扫描速度（最优）、扫描方向（8 位，单次）和扫描平均次数（4）。点击 &#34;通道&#34; 设置针孔（200 µm）、增益和偏移（例如，580、700 和 835；见 图 3），以及激光功率（488 = 10%，543 = 100%，633 = 100%）。</li>
	<li>点击“配置”选项卡中的 &#34;配置&#34; 保存这些设置，并将其保存至配置数据库中。</li>
	<li>点击“宏”选项卡中的 &#34;多时间点 X&#34;（图 1D）设置时间序列。点击 &#34;单个位置&#34;。</li>
	<li>为保持细胞聚焦，点击 &#34;自动对焦&#34; 在宏中选择自动对焦功能。 
	注意：自动对焦通过 633 nm 激光利用玻璃表面的反射作为参考点实现。</li>
	<li>点击 &#34;单轨&#34; 或 &#34;多轨&#34;，在配置数据库中滚动至所需配置，设置时间间隔（例如，15 分钟）、扫描次数（例如，97），然后点击 &#34;加载配置&#34; 应用已保存的配置。 
	注意：使用这些参数，将生成一个 97 × 15 分钟 = 24 小时的时间序列。</li>
	<li>在 &#34;基础文件名&#34; 中为时间序列命名，并通过点击 &#34;图像数据库&#34; 选择数据库（步骤 3.11 创建）。通过点击 &#34;临时图像文件夹&#34; 设置临时文件夹。 
	注意：若系统因任何原因停止或崩溃，图像将保存在此文件夹中。</li>
	<li>打开孵育装置，提起成像环，在物镜上滴加一滴浸油，然后尽快关闭装置。对焦并选择成像腔中的一个位置。 
	注意：该位置应包含单层细胞，融合度至少为 70%，以便对单个细胞进行成像。</li>
	<li>检查背景的配置设置，并根据需要进行调整。 
	注意：可通过降低增益或激光功率来校正背景。任何配置更改均需保存（见步骤 3.17）并在宏中重新加载（见步骤 3.18）。</li>
	<li>在超净工作台中，用细胞培养基将游离药物或纳米颗粒稀释至药物浓度为 5 µg/mL 或脂质浓度为 0.05 µmol。若药物/纳米颗粒未灭菌，需通过 0.22 µm 注射器滤器过滤。</li>
	<li>打开孵育腔，提起密封盖，移除细胞培养基，加入 1 mL 稀释后的药物/纳米颗粒，然后尽快关闭装置。</li>
	<li>对细胞进行对焦，并在“多时间点 X”宏中点击 &#34;开始时间&#34; 启动时间序列采集。</li>
	<li>定期检查细胞是否仍处于聚焦状态，或使用自动对焦功能（见步骤 3.16）。程序会自动将时间序列保存至数据库；运行过程中请勿关闭数据库。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>根据原始研究问题，使用 ImageJ 等软件程序进行数据分析（示例见结果部分）。</li>
</ol>

<ol><li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+liposomal+doxorubicin%3A+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer%2C+ovarian+cancer%2C+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li>
<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li>
<li>Ten Hagen, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+augments+antitumor+activity+of+stealth+liposomal+doxorubicin+%28DOXIL%29+in+soft+tissue+sarcoma-bearing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats.</a> Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).</li>
<li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%29+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).</li>
<li>Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+safety+of+pegylated+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%2FCaelyx%29+demonstrated+by+endomyocardial+biopsy+in+patients+with+advanced+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Invest%22%5BJournal%5D)">Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies.</a> Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).</li>
<li>Muggia, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+encapsulated+anthracyclines%3A+new+therapeutic+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons.</a> Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+content+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+using+mild+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia.</a> J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).</li>
<li>Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+optimization+of+idarubicin+thermosensitive+liposomes+provides+ultrafast+triggered+release+at+mild+hyperthermia+and+improves+tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response.</a> J Control Release. 220, 425-437 (2015).</li>
<li>Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome%3A+Evaluated+by+in+vitro%2Fin+vivo+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li>
<li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+Thermosensitive+Liposomes%3A+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li>
<li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF%2C+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma%2C+on+a+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li>
<li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li>
<li>Das, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+TIMP3+expression+affects+tumor+progression+and+angiogenesis+in+melanomas+through+regulation+of+directionally+persistent+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).</li>
<li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%29+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li>
<li>Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li>
<li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li>
<li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li>
<li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

正如以往观察到的，固定过程几乎会立即破坏脂质体纳米载体&#160;，而从这些被破坏的脂质体中释放出的阿霉素（DXR）仍有足够时间进入细胞核，这使得数据的解读变得极为困难，甚至产生误导。通过一些显微镜参数的调整，可常规地在活细胞和组织中研究化疗药物的命运，以验证或推翻组织学观察结果。最近一项研究利用活细胞延时成像技术，展示了游离型和包载型阿霉素（dox）处理细胞后，DXR的摄取、释放及定位过程9。本文更详细地描述了该实验装置。利用该模型，可以直观地观察到阿霉素被迅速转运至细胞核，并在其中持续积累，直至细胞最终死亡。相比之下，当使用Dox-NP时，仅在细胞核中检测到少量释放的阿霉素。尽管持续暴露会导致DXR不断积累，但Dox-NP处理组细胞中的荧光信号明显低于游离dox处理组，表明其细胞内浓度及后续细胞毒性存在差异。此外，通过使用活细胞标记物发现，在细胞暴露于Dox-NP时，DXR与纳米载体均定位于溶酶体中。这表明完整的脂质体被细胞摄取，并揭示了这些纳米颗粒的摄取过程涉及内吞途径。细胞核中的DXR显然来源于已释放的阿霉素。然而，由于该方法显示DXR与载体共定位且似乎被滞留在溶酶体中，目前尚不能确定溶酶体内的是包载状态还是已释放的阿霉素。有可能是纳米颗粒本身的固有稳定性导致其在溶酶体定位时抑制了阿霉素的释放。
在本方案中，使用特定的显微成像系统进行活细胞成像，配备定制的载物台支架（规格可应要求提供）。然而，大多数共聚焦显微镜制造商均提供多种适用于活细胞成像的培养箱。维持细胞培养条件（即， 温度，CO2pH、湿度和无菌性）是这些培养箱的主要性能指标，需通过初步测试来确定合适的培养条件，相关内容将在下文进一步说明。同一制造商还可提供自动数据采集程序。 &#34;多位置&#34; 该选项可实现对同一培养腔内多个位置进行成像，从而提升统计分析的精确性。然而，本文所述宏程序中的此选项需要固定的XYZ坐标，因而丧失了对Z轴漂移进行校正的可能性。虽然可在该宏中加入对Z轴维度的扫描，并采用焦平面进行分析，但这需要额外的扫描步骤，可能增加光毒性和荧光淬灭的风险。
与所有荧光检测一样，过曝是一个需要关注的问题，尤其是在比较两种细胞摄取能力不同的化合物时。荧光强度不仅取决于化合物本身的固有信号，还受到摄取速率、浓度以及药物作用时间的影响。如图3所示，经阿霉素（dox）处理的细胞中细胞核内的DXR信号已清晰可见，而在Dox-NP处理的细胞中则未观察到信号。只有通过提高增益才能观察到Dox-NP处理细胞中的DXR信号，但这会导致dox处理组细胞出现过曝现象。此外，即使在细胞内，Dox-NP的分布也是不均一的，这可能导致不可避免的曝光不足或过曝。特别是在研究细胞内DXR滞留情况时，需显著降低增益以区分单个细胞器（图5B 和 图5C）。因此，基于像素密度的定量结果必须结合代表性图像进行综合解读，以确保结果解释的准确性。
光毒性、荧光淬灭以及低信噪比也是荧光显微镜技术中的重要问题，必须在图像质量与图像采集之间取得平衡。然而，即使显微镜设置处于最佳状态，图像质量仍在很大程度上取决于细胞的质量以及所添加化合物的性质。DXR可产生强烈的荧光信号，只要采取适当预防措施，即使在较长时间（长达72小时）后也未观察到荧光淬灭现象。然而，荧光信号的减弱也可能由外排作用引起。外排作用是药物耐药性中的一个重要现象。15 当细胞将药物从细胞内作用位点泵出时会发生此现象。因此，随时间推移荧光信号的减弱也可能是柔红霉素外排的结果。9通过比较实验结束时未扫描位置的荧光信号与延时成像序列的最后一张图像，可证明光漂白现象即， 信号在未扫描位置会更高）或外排（即， 两个信号将完全相同）。多种校正选项（例如， 背景、漂移、漂白 等等。) 可在 ImageJ 等程序中获取16此外，由于荧光强度随时间逐渐增强，可在预实验中预先评估配置参数，以尽量减少延时成像结束时的过度曝光（步骤 3.21）。或者，也可使用已用药物处理目标时长的细胞样本的成像腔来初始化设置。最后，对于此类分析，应避免使用具有毒性的药物浓度（步骤 3.22），并事先通过常规生物测定方法确定适宜浓度。
细胞需在不含酚红的培养基中持续培养和维持。酚红在光谱的红色区域具有荧光特性，可在细胞器（最可能是溶酶体）中被观察到，从而产生假阳性信号（步骤 1.2）。为了便于对单个细胞进行监测，细胞汇合度不应超过 70%（步骤 3.1）。CO2 流速（步骤 3.5）应在设备购置或维护后通过验证实验进行调节。若流速过高，培养基会蒸发；若流速过低，培养基的 pH 值将升高，从而影响细胞生长。由于培养基中不含酚红 pH 指示剂，pH 的变化无法被直接观察，因此容易被忽视。一旦完成 CO2 流速的验证，这些设定参数可在后续所有实验中沿用。
利用本文所述方法，可通过活细胞成像和延时显微镜技术方便地研究纳米颗粒的命运。本实验中使用了市售的纳米颗粒。然而，热敏性17、阳离子脂质体10；富含短链鞘脂的脂质体18；以及包载其他药物的纳米颗粒8,19，也已通过该方法在肿瘤细胞和正常细胞中进行了研究。

在活细胞和组织中追踪生物学过程（如细胞间相互作用、细胞间与细胞内运输、细胞毒性化合物摄取以及单分子水平的蛋白质-蛋白质相互作用）的能力在过去十年中受到广泛关注，因为它提供了额外的维度 &#34;实时&#34; 本文描述了一种追踪游离阿霉素（dox）及纳米颗粒载药阿霉素（Dox-NP）在细胞内命运的方法。
数十年来，纳米颗粒已被用于治疗某些癌症。阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）已获批准用于治疗艾滋病相关的卡波西肉瘤、晚期卵巢癌和乳腺癌以及多发性骨髓瘤1。它是最早开发并应用于临床的脂质体纳米颗粒之一。游离形式的阿霉素（dox）在血液中被迅速清除，限制了其到达肿瘤部位的足够剂量。此外，该药物治疗常伴随严重且剂量受限的副作用，例如口腔炎和心力衰竭。当其被包封于聚乙二醇化脂质体纳米颗粒中时，血液循环时间可从数分钟延长至数天2。这种含胆固醇的脂质体具有较高的稳定性，其稳定性决定了包封药物的药代动力学特性。
然而，这种刚性也存在缺点。化合物对肿瘤细胞的细胞毒性首先被评估 体外，且细胞毒性实验已表明，dox 的作用强于 Dox-NP3,4. 推测载体的稳定性阻碍了药物的释放和细胞摄取，值得进一步研究这一现象。脂质体固有的特性旨在抵御血液中的各种攻击性因素并完整到达肿瘤部位，但这也导致其细胞毒成分的生物利用度降低即， dox）在靶位点（即， 肿瘤细胞核）。尽管与游离形式相比，Dox-NP对治疗反应的改善有限，但仍具有临床价值，因为药物包封显著降低了心脏毒性作用5在随后的几年中，其他化合物被封装在纳米载体中6此外，对载体的修饰实现了药物的触发释放（即， 在肿瘤部位发挥作用，但在血液循环中保持稳定7,8尽管经过多年的深入研究和临床应用，诸如Dox-NP等纳米载体在肿瘤内部的命运仍未完全明确。在近期一项研究中发现，纳米颗粒以整体形式被细胞摄取，而其中的阿霉素（dox）则仍滞留在溶酶体中。9.
纳米颗粒的细胞摄取及药物释放是动态过程，最适合通过活细胞成像进行监测。此外，传统的组织学方法通常先孵育细胞再进行固定，但如果固定过程破坏了脂质体载体并引入人为假象，则可能导致错误结果。活细胞成像的主要要求是对目标过程进行可视化，最好通过荧光实现。某些化合物（如阿霉素，dox）具有内在的红色荧光。此外，可将荧光标记物引入载体中，同时利用活细胞标记物对细胞器进行可视化。通过这种方法，可以对一系列参数（如载体的摄取、药物释放以及载体和药物的细胞内定位）进行成像与分析。本文描述了一种实时追踪多种肿瘤细胞中阿霉素（dox）及其纳米颗粒制剂（Dox-NP）细胞内命运的方法。该方法还可轻松调整，以构建实现靶向（例如，带电荷的纳米颗粒10）和触发式（例如，热疗7）药物释放的理想条件。

<table><tbody><tr><td>DMEM（无酚红）</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>添加 1 mM L-谷氨酰胺和 10 % 胎牛血清</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-versene（EDTA）</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>55 &amp;ordm;C 加热灭活 30 分钟</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>牛皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>用 PBS 配制 0.1% 溶液，无菌</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &amp;micro;m 滤器 - 500 ml&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>细胞：Lewis 肺癌肉瘤</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>细胞：B16BL6</td><td>Dr. P. Brouckaert，根特大学</td><td>捐赠</td><td>参考文献10</td></tr><tr><td>细胞：BLM 和 1F6</td><td>Dr. van Muijen，奈梅亨大学</td><td>捐赠</td><td>参考文献11</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>多柔比星</td><td>Actavis&amp;nbsp;</td><td></td><td>文中简称为 dox</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>文中简称为 Dox-NP</td></tr><tr><td>注射器滤器 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-绿色 DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>文中简称为溶酶体标记物（LM）-绿色</td></tr><tr><td>Lysotracker-红色 DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>文中简称为溶酶体标记物（LM）-红色</td></tr><tr><td>Attofluor 细胞环</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>载物台支架 + 密封盖</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软件 LSM 510 版本 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

使用 体外 利用活细胞成像技术探究脂质纳米颗粒递送的化疗药物

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

传统的成像技术可以提供有关细胞过程的详细信息。然而，这些信息基于在一个动态系统中的静态图像，因此容易忽略或误解连续的动态过程。活细胞成像和延时显微镜技术能够以近乎连续的方式对活细胞进行数小时甚至数天的追踪观察，因此具有很高的信息价值。本文所述的实验方案可用于研究化疗用纳米颗粒在活细胞中递送阿霉素（dox）后的去向。阿霉素是一种嵌入剂，必须从其纳米载体中释放出来才能发挥生物学活性。尽管阿霉素已在临床上使用超过二十年，但其摄取、降解及药物释放过程仍未被完全阐明。本文探讨了以下假设：基于脂质的纳米颗粒被肿瘤细胞摄取后会缓慢降解，释放出的阿霉素随后被转运至细胞核。为避免固定带来的假象，可采用本实验流程中描述的活细胞成像和延时显微镜技术。

已有关于使用不同标记物对脂质体载体进行标记的描述9。本文展示了用远红染料二辛基十八烷基四甲基吲哚三羰花青高氯酸盐（DiD；Ex = 644 nm；Em = 665 nm）或绿色染料1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)（CF-PE；Ex = 490 nm；Em = 515 nm）标记的载体。为了揭示不同肿瘤细胞间在脂质体摄取、释放及细胞内定位方面的共性与差异，本研究选取了多种肿瘤类型进行分析，包括两种小鼠来源的肿瘤细胞系：B16BL6黑色素瘤11和Lewis肺癌（LLC），以及两种人源黑色素瘤细胞系：高转移性黑色素瘤（BLM）和非转移性黑色素瘤（1F6）12,13。所有实验均在活细胞中进行。实验中，分别使用5 µg/mL游离阿霉素（dox）、5 µg/mL阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）或0.05 µmol纳米颗粒处理细胞，作用时间为3小时或24小时。所检测和分析的阿霉素（以游离、释放、包封、隔离或嵌插形式存在）均统称为DXR。成像采用40X油镜（数值孔径：1.3），CF-PE和溶酶体标记物（LM）-绿色信号使用488 nm氩离子激光器（10%/0.2 mW功率）激发，并通过505至550 nm带通滤光片采集；阿霉素（dox）、Dox-NP和溶酶体标记物-红色信号使用543 nm氦氖激光器（100%/0.2 mW功率）激发，并通过560至615 nm带通滤光片采集；DiD信号使用633 nm氦氖激光器（100%/0.5 mW功率）激发，并通过640 nm长通滤光片采集。
由于其封装特性， 体外 阿霉素的细胞毒性、生物利用度和药代动力学均发生了显著改变3,9,14游离形式与包封形式给药时药物生物利用度的差异在下文中得到证实 图3Dox 是一种嵌入剂，必须进入细胞核才能发挥细胞毒性作用。 图3 以及相关的视频1和2展示了在相同条件下用dox或Dox-NP处理的BLM细胞的3小时延时成像。在接触dox数分钟内，即可观察到细胞核内的DXR信号（图 3A，视频1）并以较低增益（插图）可见其在细胞核内嵌入。相比之下，当暴露于Dox-NP时，在此时间段内几乎无法观察到细胞内的DXR图3B，电影2）。只有通过增加光电倍增管增益，才能观察到细胞质中的DXR（插图）。使用ImageJ对细胞质和细胞核中DXR的像素密度进行分析。由于在延时评估过程中细胞处于运动状态，因此必须将荧光图像与明场图像结合。这使得能够追踪单个细胞，并利用ImageJ中的特定插件稳定XY漂移。在下述分析中 图3，使用明场图像在细胞质（实线）和细胞核（虚线）周围绘制感兴趣区域（ROI）。ImageJ 中的 ROI 管理器可在菜单项“分析”中找到 &gt; 工具 &gt; ROI 管理器。这些 ROI 用于荧光图像中，通过“分析”菜单项分析像素密度 &gt; 测量。细胞核内像素密度与细胞质内像素密度的差值图3C) 和细胞质（图3D) 对经dox或Dox-NP处理的细胞的定量分析结果与图像中观察到的现象一致。此外，细胞与dox或Dox-NP共孵育24小时后，更换为新鲜培养基，并立即以提高光电倍增管增益灵敏度的方式进行成像。图4）。其他设置（如激光功率、偏移、针孔和图像显示）均保持一致。与多柔比星（dox）处理的细胞相比，Dox-NP处理细胞中较低的DXR信号十分显著。当增益设为700时，Dox-NP处理细胞中的DXR信号变得可见，而多柔比星处理组的图像已过度曝光。这一简单 体外 该实验直观展示了游离药物与包封药物在生物利用度上的显著差异。
当细胞持续暴露于Dox-NP中24小时后，DXR会随着时间逐渐积累，如图5A及影片3和4所示。荧光信号首先在细胞质中增强，随后DXR也出现在细胞核内并发生嵌插。这些现象可通过像素密度图进一步证实（图5B）。由于细胞内分布的差异，BLM细胞的细胞质像素密度测量值低于1F6细胞。在1F6细胞中，DXR在整个细胞内分布较为均匀；而在BLM细胞中，DXR则更集中于靠近细胞核的一个细胞器中（图5C）。
因此，药物与载体在不同细胞系中的定位（图6) 进行了研究。细胞与Dox-NP/DiD共孵育24小时后进行成像。根据明场图像，在三种不同细胞系的荧光图像上叠加绘制出细胞膜（实线）和细胞核（虚线）。结果显示，以DiD标记的载体与DXR在细胞质内的分布模式一致：在BLM细胞中集中于靠近细胞核的某一细胞器内，在LLC细胞中围绕整个细胞核分布，在B16BL6细胞中则随机分散于整个细胞质中。在细胞核内仅可见DXR而无DiD信号，表明阿霉素已从载体中释放。通过降低光电倍增管增益，可观察到含有DXR及以DiD和CF-PE标记的载体的单个细胞囊泡图6B 和 6C可以看到。
胞质内的阿霉素（DXR）被隔离在小囊泡中，细胞用绿色或红色的活细胞溶酶体标记物进行标记。这些溶酶体在细胞内的运动可以被追踪（视频5）。胞质中的DXR与纳米载体在这些结构中共定位，细胞间DXR分布模式的差异如图6所示，在此进行解释。溶酶体在B16BL6细胞中随机分布于胞质中，而在BLM细胞中则位于细胞核附近（图7A）。使用ImageJ软件计算DXR与载体在溶酶体内的共定位情况（图7B）。将彩色图像转换为二值图像（Process &gt; Binary &gt; Make Binary），然后利用共定位插件（Analyze &gt; Colocalization）生成DXR与DiD的共定位图像。该方法生成一幅绿-红-白三色图像，其中白色像素代表两幅图像中重叠的像素。通过菜单项Process &gt; Binary &gt; Make Binary，可将白色像素分离并转化为黑色像素，并测量其像素密度（Analyze &gt; Measure）。随后，生成该DXR-DiD图像与溶酶体标记物（LM）二值图像之间的共定位图像，并测量像素密度。共定位数据表示同时对DXR-DiD和DXR-DiD/溶酶体标记物呈阳性的像素所占百分比（图7C）。此外，使用CF-PE和DiD双重标记的载体定位于溶酶体中，这一点也在图7D中得到证实。
<img alt="用于声学成像的超声显微镜装置；仪器、控制面板、分析工作站。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：仪器与设备装置。 A) 成像室及相关配件。25 mm #1 盖玻片（1），腔室底部（2），腔室顶部（倒置放置）和O形圈（3），载物台支架（4），以及密封盖（5）。比例尺：2 cm。B) 培养单元。加热显微镜载物台（1），带CO2进/出流通道的流动腔室（2），CO2探针（3），以及封闭补片（4）。比例尺：2 cm。C) 显微镜下观察到的培养单元中的成像室。D) 多时间序列宏。E) 成像设备。倒置显微镜（1），荧光光源（2），计算机（3），环形加热器（4，插图）和控制器（4，主图），CO2流路管（5），CO2阀门（6），CO2控制器（7），CO2加湿器（8），O2阀门及控制器（9），以及载物台温度控制器（10）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜工作流程图；设置包括激光器、成像室、纳米颗粒和时间推移法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：方案第 3 节中详述的显微镜参数示意图。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像，阿霉素摄取；曲线图显示随时间变化的像素强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：研究阿霉素（dox）及其纳米颗粒（Dox-NP）的短期摄取情况。 BLM细胞持续暴露于阿霉素（dox）或Dox-NP中3小时，并进行延时成像。（A）与阿霉素（dox）共同孵育的细胞延时图像的静态截图。（B）与Dox-NP共同孵育的细胞延时图像的静态截图。比例尺 = 50 µm。（C）经阿霉素（dox）和Dox-NP处理的细胞中细胞核内DXR的像素密度增加情况。（D）经阿霉素（dox）和Dox-NP处理的细胞中细胞质内DXR的像素密度增加情况。数据表示每视野3个细胞的平均值 ± 标准差（SD）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示BLM、1F6、LLC细胞中DXR摄取的荧光显微镜图像；与明场对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：在不同细胞系中研究阿霉素（dox）和阿霉素纳米颗粒（Dox-NP）的长期摄取情况。将细胞暴露于dox或Dox-NP中，24小时后进行成像。图像在药物去除后立即采集，并采用三种不同的增益设置。比例尺 = 50 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过共聚焦显微镜分析细胞摄取；图表显示随时间变化的像素密度；BLM 与 1F6 对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：研究脂质体药物的细胞摄取与释放。 细胞持续暴露于Dox-NP中24小时，并进行时间延时成像。（A）时间延时图像的静态截图。比例尺 = 50 µm。（B）细胞核与细胞质中DXR的像素密度随时间增加。数据表示每视野3个细胞的平均值 ± 标准差。（C）显示DXR在细胞内定位的图像。实线：细胞膜；虚线：细胞核。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析药物分布的荧光显微镜图像；DXR（Dox-NP）、DiD、CF-PE 通道。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：研究药物与载体在不同细胞系中的定位。 （A）细胞经Dox-NP/DiD处理24小时后成像。比例尺 = 50 µm。（B）细胞经Dox-NP/DiD/CF-PE处理24小时后成像，采用较低强度增益以区分单个囊泡。（C）明场与DXR叠加图像，显示DXR位于胞质囊泡中（箭头所示）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="溶酶体细胞共定位分析；荧光显微镜图像、二值共定位、图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：药物与载体在细胞内的定位研究。 细胞分别暴露于 Dox-NP/DiD 或 CF-PE/DiD 中 24 小时，使用活细胞溶酶体标记物（LM）以绿色或红色显示溶酶体。(A) DXR 与载体（DiD）在细胞内的定位。箭头表示 DXR 与 DiD 定位于溶酶体中的三个示例。比例尺 = 50 µm。(B) 使用 ImageJ 对 DXR 与载体（DiD）在溶酶体（LM）中的共定位进行分析。(C) DXR 与载体在溶酶体中共定位的百分比。数据表示三次独立实验的平均值 ± 标准误。(D) 使用两种不同标记物可视化载体在溶酶体中的滞留。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；红色染色细胞；细胞结构分析；比例尺：50 μm。" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 1"> 
视频 1：关联于 图 3： BLM 细胞与柔红霉素孵育 3 小时。 时间序列：共 19 张图像，拍摄间隔为 10 分钟。帧速率为 3 fps。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="荧光显微镜图像，70分钟时的细胞分析，突出显示红色染色的细胞结构。" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 2"> 
视频 2：关联于 图 3：BLM细胞与Dox-NP孵育3小时。 时间序列：共19张图像，间隔10分钟。帧速率为3帧每秒。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="荧光显微镜；细胞成像；蛋白质表达分析；6小时时的荧光发射。" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 3"> 
视频 3：关联于 图 5：BLM 细胞与 Dox-NP 共同孵育 24 小时。时间推移：共采集 96 幅图像，时间间隔为 15 分钟。帧速率为 8 fps。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.avi" target="_blank">请点击此处查看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="显示红色荧光蛋白表达的细胞培养物荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 4"> 
视频 4：关联于 图 5：1F6 细胞与 Dox-NP 共同孵育 24 小时。 时间序列：共 96 幅图像，拍摄间隔为 15 分钟。帧速率：8 帧/秒。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="荧光显微镜图像，细胞蛋白定位，绿色发射分析。" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 5"> 
视频 5：关联于 图7： 使用活细胞标记物对B16BL6细胞的溶酶体进行染色。 时间序列：共10张图像，间隔10秒。帧率：3帧/秒。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">请点击此处观看视频。（右键可下载。）</a>

活细胞成像是一种用于可视化动态过程的强大工具。对固定细胞的观察仅能提供静态图像，可能导致对过程的误解和混淆。本研究介绍了一种用于在活细胞中研究脂质体纳米颗粒的摄取、药物释放及细胞内定位的方法。

传统的成像技术可提供有关细胞过程的详细信息。然而，这些信息基于在...中的静态图像

该活细胞成像技术的总体目标是，在无需固定细胞的情况下，实时追踪细胞过程，例如化疗药物的摄取与分布。这些方法有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如：游离形式或纳米颗粒包封形式的化疗药物如何被肿瘤细胞摄取。该技术的主要优势在于我们对活细胞进行成像，从而避免了固定带来的假象，并实现了对细胞动态过程的实时评估。我们最初产生这一方法的想法，源于在固定过程中观察到纳米颗粒发生降解，从而导致对药物递送的误判。组装成像腔时，将一片25毫米的盖玻片置于腔体底部，再将上部拧入底部。切勿过度拧紧，以免玻璃破裂。对整个培养室进行高压灭菌。接种细胞时，在超净工作台内从灭菌袋中取出成像培养室，小心拧紧，并将其放入培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用一毫升0.1%无菌明胶处理成像培养皿的玻璃表面，孵育20分钟。从细胞培养瓶中移除培养基后，用1×PBS洗涤细胞一次，然后使用0.25%胰蛋白酶消化细胞使其脱离。加入细胞培养基以灭活胰蛋白酶。然后，收集细胞并在 1,100 ×g 条件下离心五分钟。将沉淀重悬于 5 mL 细胞培养基中。按照文本方案中所述计数细胞后，吸除明胶，并以适当的稀释度接种细胞，使其在 24 小时内达到最多 70% 的汇合度。将细胞置于5%二氧化碳、37°C条件下培养24小时，使其贴壁。在显微镜下观察细胞，评估其汇合度、细胞形态及污染情况。随后，打开共聚焦显微镜、荧光光源和计算机。将镜头加热器连接到物镜上，并将其设置为35摄氏度。按照文本方案准备孵育装置。将孵育装置放置在显微镜载物台上，并连接二氧化碳进气管和出气管。打开主二氧化碳阀门并开启二氧化碳控制器。检查控制器是否设定为5%二氧化碳。温度、CO2、pH、湿度和无菌性等适当的细胞培养条件对于长期细胞成像至关重要。因此，每个培养箱都需要进行适当测试。将载物台温度设置为37摄氏度。让培养单元达到选定的温度和二氧化碳百分比。从主二氧化碳培养箱中取出成像室，用培养皿将其运送至显微镜室。将成像室放入定制的35毫米直径载物台固定装置中，并用定制的密封盖封闭成像室。打开培养单元，迅速操作以防止细胞冷却；将红色封片替换为成像室，然后关闭单元。确保载物台与显微镜之间没有电缆被夹住。让设备静置30分钟以适应环境温度。接着，打开软件并开启激光器。单击“文件”选项卡下的“新建”以创建新数据库。为数据库命名并保存。单击“采集”选项卡下的“配置”以设置配置参数。选择“通道模式”和“单轨”以检测单一荧光染料。若检测多种荧光染料，则选择“多轨”。然后选择合适的带通滤光片，并与相应的荧光染料相匹配。选择其中一个轨道中的明场通道。扫描效果会受到化合物荧光信号与图像质量之间平衡的影响。曝光过度、光漂白、信噪比、细胞状态以及添加的化合物等因素均可能影响实验结果，需进行充分优化和测试。通过点击“采集”选项卡下的“扫描”来设置扫描控制。然后点击“模式”以设置帧尺寸、扫描速度、扫描方向和扫描平均值。点击“通道”以设置针孔、增益与偏移以及激光功率。通过点击“配置”选项卡中的“Config”来保存这些设置，并将其保存到配置数据库中。在“宏”选项卡中点击“Muti TimeX”以设置时间间隔。点击“单个位置”。通过单击“单轨”应用已保存的配置，并在配置数据库中滚动至所需的配置。设置时间间隔和扫描次数。单击“加载配置”以加载配置。在“基础文件名”中为延时成像命名，并通过点击“图像数据库”选择数据库以保存延时成像。通过点击“临时图像文件夹”设置临时文件夹。接下来，打开培养单元，抬起成像环，在物镜上滴加一滴浸油，然后尽快关闭单元。聚焦并在成像腔室中选择一个位置。在层流柜中，将游离药物或纳米颗粒用细胞培养基稀释至药物浓度为每毫升5微克或脂质浓度为0.05微摩尔。如果药物或纳米颗粒不具无菌性，则需通过0.22微米针头滤器过滤。打开培养室并掀开顶盖。然后，移除细胞中的培养基，加入一毫升稀释的药物或纳米颗粒，并尽快关闭成像单元。聚焦于细胞，在“扫描控制”选项卡中点击“Single”进行快速扫描。当明场图像显示细胞清晰聚焦时，在“Multi TimeX Macro”中点击“Start Time”开始延时成像。重复次数和剩余时间显示在宏和图像中。请定期检查细胞是否仍处于焦距范围内，或使用自动对焦功能。该程序会自动将延时图像保存至数据库。程序运行时请勿关闭数据库。这是细胞暴露于游离阿霉素后连续三小时的延时成像。观察红色荧光阿霉素被摄取后立即向细胞核转位的过程。此处，细胞与包封的阿霉素共同孵育三小时。荧光信号明显较弱，主要位于细胞质中，细胞核内信号几乎不可见。将这些延时电影导入Image J后，可在细胞核周围绘制感兴趣区域，并测量像素密度。此处展示的图表显示了用游离或包封的阿霉素孵育的细胞中，随时间变化的细胞核摄取差异。图中所示为用包封的阿霉素孵育的细胞，以红色显示。紫色信号代表载体，溶酶体用绿色活细胞标记物染色。比较两种细胞类型可发现溶酶体分布的差异。B16BL6细胞中的溶酶体分布在细胞质中。然而，BLM细胞中的溶酶体位于细胞核附近。但两种细胞系均显示出溶酶体中红色与紫色信号的高度共定位，表明阿霉素及其载体被滞留在这些细胞器中。观看本视频后，您应能充分理解如何对活细胞中数小时甚至数天内化疗药物及其他荧光标记物的摄取过程进行成像观察。

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使用体外活体细胞成像技术研究脂纳米粒子化疗

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内...

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

使用荧光染料进行 体内 成像效果可能因调理作用、快速清除、检测灵敏度低以及对宿主的细胞毒性效应而受到显著限制。通过薄膜水化与挤出法将荧光染料封装于脂质体中，可实现荧光淬灭与保护，从而提高成像性能 体内 具有高检测灵敏度的成像...

一种近红外荧光染料的脂质体包封型荧光淬灭技术作为工具 体内 光学成像

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

利用液晶纳米颗粒（LCNP）纳米载体作为载体，将疏水性货物可控地递送至活细胞的质膜。...

靶向液相晶体纳米颗粒载体包封疏水性货物的质膜递送

对...的了解不足 体内 纳米药物的性能阻碍了其临床转化。用于评估的程序 体内...

全面评估的综合流程 在体 内 癌症纳米药物的性能评估

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。...

长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本实验方案的目的是合成荧光标记的脂质体，并利用流式细胞术在细胞水平上鉴定脂质体在体内的定位情况。...

荧光染料标记脂质体的体内组织特异性细胞摄取的制备、给药与评估

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6...

测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

学习活细胞成像技术用于实时追踪肿瘤细胞对化疗药物的摄取与分布。该方法避免固定伪影，可动态评估纳米粒子递送机制，为癌症治疗研究提供准确数据。

使用体外利用活细胞成像技术探究脂质纳米颗粒递送的化疗药物

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