增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

这种增强型多重检测方法的总体目标是增加可同时分析的蛋白质样品数量，同时减少样品误差和仪器时间。该方法可以帮助回答衰老、神经退行性疾病、其他与年龄相关的疾病和癌症领域与发病机制、进展、诊断、预后和治疗靶点相关的关键问题。该技术的主要优点是可以生成许多条件下蛋白质变化的全面快照。

虽然这种方法可以在小鼠模型中提供对阿尔茨海默病的见解，但它也可以应用于阿尔茨海默病或一系列其他疾病患者的组织样本。通常，刚接触这种方法的人会发现它具有挑战性，因为在短时间内需要同时处理多个样本。当我们认识到乙酰化可以与蛋白质硝化的同工标记相结合时，我们第一次有了这种方法的想法，这促使我们在全球范围内使该技术适用于所有肽。

本研究将分析阿尔茨海默病小鼠模型和野生型对照的大脑、心脏和肝脏组织。将 60 至 90 毫克每个组织样品转移到裂解管中，并加入 500 微升 PBS 和 8 磨牙尿素。使用机械均质器对样品进行均质化。

从裂解管中取出组织匀浆并转移到微量离心管中。用 100 至 500 微升含 8 摩尔尿素的 PBS 冲洗裂解管，并将冲洗液与组织匀浆混合。将组织匀浆离心 15 分钟。

从每个样品中抓取上清液。在进行 BCA 测定以确定蛋白质浓度后，将每个样品中的 100 μg 蛋白质添加到单独标记的微量离心管中。向每个样品中加入二硫苏糖醇。

并在 37 摄氏度下孵育 2 小时。向每个样品中加入碘乙酰胺 IAM，并在冰上避光孵育 2 小时。接下来，向每个样品中加入 L-半胱氨酸，并在室温下孵育 30 分钟。

30 分钟后，加入含氯化钙的 tris 缓冲液，将尿素稀释至终浓度为 2 摩尔。向每个样品中加入 L1 tosilimitophehenylethylcholer 甲基酮处理的胰蛋白酶。并在 37 摄氏度下孵育 24 小时。

第二天，通过在液氮中快速冷冻样品来淬灭蛋白质消化，并在零下 80 摄氏度下储存直至进一步处理。在二甲基化标记之前，如文本方案中所述，对肽样品进行脱盐，并通过真空离心干燥。要开始二甲基化标记程序，请在溶解在 HPLC 或纳米纯级水中的 1% 乙酸中重构肽。

将每个样品的 50 μg 份量取出到新的 1.5 mL 微量离心管中。将剩余的重构肽储存在零下 80 摄氏度以备将来实验使用。在接下来将要演示的步骤中，快速添加试剂至关重要，这样所有样品的化学反应都将发生相同的时间。

向样品中加入 8 微升 60 毫摩尔甲醛溶液，以便用光二甲基化进行标记。向样品中加入 8 微升 60 毫摩尔碳 13 氘标记的甲醛溶液，以用重二甲基化标记。向用光二甲基化标记的样品中加入 8 微升 24 毫摩尔氰基硼氢化钠。

向用重二甲基化标记的样品中加入 8 微升 24 毫摩尔氰基硼二化钠。涡旋样品，然后在摇床上在室温下轻轻摇动约 10 分钟。加入 16 μL 1% 氨水 5 分钟，淬灭反应。

通过添加 8 微升 5% 甲酸对反应混合物进行再酸化。将轻二甲基化肽和重二甲基化肽混合，总共生成六个样品。按照文本实验步骤中的说明执行样品脱盐。

并通过真空离心干燥样品。为了对二甲基化样品进行同量异位标记，首先，重新配制 100 微克二甲基化肽和碳酸氢三铵或 TEAB 缓冲液。接下来，根据同量异位标记试剂盒的制造商方案制备同量异位试剂。

每个肽样品中加入适当体积的 41 μL 溶解同量异位标记试剂，涡旋约 10 秒。在微量离心管振荡器上，在室温下摇动样品约 1 小时。为了淬灭反应，向每个样品中加入 8 μL 羟胺。

并将样品在室温下孵育 15 分钟。将 6 个标记的样品汇集到单个混合物中并脱盐。通过在含有 0.1% 甲酸的质谱级水中重构肽来制备用于液相色谱分析的肽。

将重构的肽添加到含有 0.65 μm 过滤器的微量离心管中。并以 12， 000 倍 g 离心 1 分钟。取下并丢弃过滤器。

将过滤后的肽转移至自动进样器样品瓶中。将每种强阳离子交换派样品 6 μL 注入到捕获柱上。用碳 18 材料包装至 2 厘米。

运行分析分离和数据采集质谱方法。对阿尔茨海默病小鼠模型和野生型对照的脑、心脏和肝脏组织进行了 12 重 cPilot 分析。母离子数据显示轻二甲基化肽和重二甲基化肽，由 m/z 643.854 和 647.875 处的峰表示。

这些肽被选择、独立分离，并通过共聚诱导解离进行碎裂以生成这些光谱。检索结果表明，这些峰属于蛋白磷酸甘油酸激酶 1 的一个肽段。为了更高能量的共体解离串联质谱法，这些峰被进一步分离，并观察到报告离子，如图所示。

这两组三相质谱谱图对于获取有关 12 个样品的信息都是必要的。在这个例子中，阿尔茨海默病与野生型控制离子的比率在脑、肝和心脏组织的两个生物重复中相似。每个比较的倍数变化值表明，阿尔茨海默病小鼠大脑和心脏中的磷酸谷酸激酶 one 水平较高，但肝脏中的磷酸谷氨酸激酶 one 水平较低。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约五个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住要小心样品处理。将分离方法纳入该程序中，可以执行强阳离子交换或高 pH 分馏等分离方法，以增加每日测定深度和覆盖率。

观看此视频后，您应该对如何使用 C-Pilot 增强样品多路复用有很好的了解。