Name: 增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习cPILOT定量蛋白质组学技术，通过组合前体同位素标记和标记等压的复用方法，同时分析阿尔茨海默病小鼠模型与野生型对照的脑、心脏和肝脏组织样本，提高多重分析能力并减少误差。

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作者感谢匹兹堡大学的启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）R01 资助（GM 117191-01）对 RASR 的支持。

伦理声明：小鼠购自一家独立的非营利性生物医学研究机构，并饲养于匹兹堡大学实验动物资源部。所有动物实验方案均经匹兹堡大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 蛋白质提取及用于化学标记的肽段制备
<ol>
	<li>从组织、细胞或体液中提取蛋白质。
	<ol>
		<li>使用机械匀浆器将60–90 mg组织（例如脑、心脏和肝脏）在含8 M尿素的磷酸盐缓冲液（1× PBS）中匀浆（500 µL）。如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本项目中未使用此类抑制剂。匀浆参数如下：使用裂解基质A珠子，速度4 m/s，时间20 s。心脏组织可能需要最多9个匀浆循环。 
		注意：如必要，可在缓冲液中添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂。本研究中未使用。
		<ol>
			<li>将组织匀浆液从裂解管中取出，转移至微量离心管中。用100–500 µL含8 M尿素的PBS冲洗裂解管，并将冲洗液与组织匀浆液合并。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀浆后的组织在9,447 × g、4 °C条件下离心15分钟，并收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。 
	注意：若蛋白质浓度过高，可能需要用缓冲液进一步稀释。本实验中这些组织样品的最终浓度介于6–13 µg/µL之间。
	<ol>
		<li>可选：加入内标质量控制标准品（例如牛α-酪蛋白或其他外源性蛋白质），比例为1 µg标准品 : 100 µg蛋白样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品消化
<ol>
	<li>从每个样品中取100 µg（100 × 10-6 g）蛋白质，加入分别标记的微量离心管中。体积取决于蛋白质浓度（见步骤1.2）。</li>
	<li>向每个样品中加入二硫苏糖醇（DTT）（试剂与样品的摩尔比为40:1）。在37 °C孵育2小时。摩尔比的计算基于牛血清白蛋白（BSA）的蛋白质分子量，即66.5 × 103 g/mol。</li>
	<li>向每个样品中加入碘乙酰胺（IAM）（试剂与样品的摩尔比为80:1）。在冰上避光孵育2小时。此反应在冰上进行2小时，以防止副反应发生。</li>
	<li>向每个样品中加入L-半胱氨酸（试剂与样品的摩尔比为40:1）。在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>加入含10 mM CaCl2 的20 mM Tris缓冲液（pH 8.2），将尿素稀释至终浓度为2 M。</li>
	<li>向每个样品中加入经TPCK（L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）处理的胰蛋白酶（底物与酶的摩尔比为50:1），在37 °C孵育24小时。</li>
	<li>通过将样品在液氮中快速冷冻以终止蛋白质消化反应，并在-80 °C保存，待后续处理。</li>
</ol>
3. 样品脱盐
<ol>
	<li>通过加入甲酸（FA）重新酸化样品。加入足量甲酸，使最终浓度达到0.1%。如果样品原本保存在-80 °C，应在重新酸化前将样品置于冰上解冻。</li>
	<li>使用C18亲水-疏水平衡（HLB）10 mg小柱对肽段进行脱盐，方法如前所述16。</li>
	<li>通过真空离心（5 Torr，45 °C，77 × g）将样品干燥至体积约为10 µL。</li>
</ol>
4. 二甲基化标记（N-末端）
<ol>
	<li>用高效液相色谱（HPLC）级或超纯水溶解的1%乙酸溶液（0.25 µg/µL）重悬多肽。取50 µg转移至新的微量离心管（1.5 mL）中，其余部分储存于-80 °C。</li>
	<li>为进行轻或重二甲基标记，分别向样品中加入8 µL的60 mM（4%）CH2O（37% wt/v）或60 mM（4%）13CD2O（20% wt/v）。通常每25 µg多肽加入4 µL试剂（见步骤4.2、4.3、4.6）。</li>
	<li>分别向经轻或重二甲基标记的样品中加入8 µL的24 mM NaBH3CN或24 mM NaBD3CN。</li>
	<li>涡旋混匀，并在室温下于振荡器上震荡约10分钟。</li>
	<li>加入16 µL的1%氨水（~28–30% v/v）反应5分钟以终止反应。通常每25 µg多肽加入8 µL试剂。</li>
	<li>加入8 µL的5%甲酸（98% v/v）重新酸化反应体系。</li>
	<li>合并轻链和重链二甲基化多肽（图1），共生成六个样品。本研究所用样品标记与混合策略详见表1。</li>
	<li>按照步骤3.2和3.3进行样品脱盐处理。</li>
</ol>
5. 同重标记（赖氨酸残基）
<ol>
	<li>将100 µg二甲基化肽段（1 µg/µL）溶解于100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液（pH ~8.5）中。</li>
	<li>按照生产商说明书配制等重标记试剂（见材料/试剂表）。</li>
	<li>向肽段中加入溶解后的等重标记试剂（41 µL），涡旋约10秒。在微型离心管振荡器上震荡样品约1小时。用8 µL羟胺（10% w/v）终止反应，并在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将六个标记后的样品合并为单一混合物，并进行脱盐处理（步骤3.1–3.3），或于-80 °C保存以备后续使用。 
	注意：为提高蛋白质组覆盖度和深度，建议采用多维分离策略，例如强阳离子交换（SCX）。</li>
</ol>
6. 强阳离子交换
<ol>
	<li>按照制造商的说明书进行SCX（参见 材料表).
	<ol>
		<li>配制约 1 mL 的甲酸铵溶液（20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM、250 mM） &amp;#38; 500 mM) 加入10%乙腈（ACN）、0.1%甲酸（FA）（pH 3）</li>
		<li>取下移液器吸头顶部的红色帽，轻敲装有填料浆液的移液器吸头，确保填料位于移液器吸头的底部。 
		注意：关键步骤：在整个实验方案结束前，请勿丢弃移液器吸头。</li>
		<li>将离心机适配器置于微型离心管（2 mL）顶部，并将移液器吸头固定于其中。</li>
		<li>向移液器吸头中加入 150 µL SCX 重悬缓冲液。</li>
		<li>将移液器吸头在室温下离心6分钟（4,000 × g）。重复此步骤两次，弃去废液。</li>
		<li>将多肽溶解于150 µL的SCX复溶缓冲液中，确保pH为3。</li>
		<li>将多肽加入移液器吸头中，离心（参见6.1.5），并保留洗脱液。</li>
		<li>将滤膜和移液头转移至新的微量离心管（2 mL）中，加入150 µL 20 mM甲酸铵溶液。室温下离心6 min（4,000 × g），收集洗脱液。</li>
		<li>重复步骤 6.1.8 七次，依次使用不同浓度（即 40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM、250 mM 和 500 mM 的甲酸铵</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将八份SCX组分转移至微量离心管（1.5 mL）中，并通过离心浓缩法进行浓缩（参见步骤3.3）。</li>
</ol>
7. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和&#160;MS3
<ol>
	<li>用含0.1%甲酸（FA）的质谱级水溶解肽段，过滤后置于自动进样瓶中。按如下步骤过滤肽段：
	<ol>
		<li>将重悬的肽段加入含有0.65 µm滤膜的微量离心管中（见材料表）。</li>
		<li>在12,000 × g下离心1分钟。移除滤膜并弃去，将滤过的肽段转移至自动进样瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下方法配制流动相缓冲液：含0.1% FA的3%（v/v）乙腈（A）和含0.1% FA的100%乙腈（B）。</li>
	<li>将每份SCX分级样品各6 µL注入填充有C18材料（5 µm，200 Å孔径）至2 cm长度的捕获柱中。 
	注：捕获柱上的样品清洗条件如下：0% B，3分钟；流速3 µL/min，使用二维液相色谱系统（见材料表）。</li>
	<li>运行分析分离程序。使用内径75 µm、长度13.2 cm、激光拉制尖端的熔融石英毛细管柱，填充C18 材料（5 µm，100 Å）。梯度设置如下：0–5分钟，10% B；5–40分钟，10–15% B；40–90分钟，15–25% B；90–115分钟，25–30% B；115–130分钟，30–60% B；130–135分钟，60–80% B；135–145分钟，80% B；145–150分钟，80–10% B；150–180分钟，10% B；流速300 nL/min，总运行时间180分钟。</li>
	<li>在运行分析分离程序的同时进行质谱仪的数据采集。 
	注：MS一级扫描参数如下：质荷比（m/z）范围400–1,600，分辨率60,000，自动增益控制（AGC）目标值1 × 106离子，最大注入时间500 ms。CID–MS/MS参数如下：前1–7或前8–14个离子进行数据依赖性采集（DDA），隔离宽度3 m/z，最低信号强度500，归一化碰撞能量（NCE）35%，激活q值0.25，激活时间10 ms，AGC目标值3 × 104，最大注入时间50 ms。HCD–MS3 参数如下：最低信号强度200，隔离宽度4 m/z，NCE 60%，激活时间0.1，AGC目标值3 × 105，注入时间（IT）250 ms，MS/MS选择范围300–1,300 m/z，排除未碎裂的母离子。</li>
	<li>对前1–7和前8–14的每次运行均进行双重复分析。 
	注：对于在较新型号的Orbitrap或三合一质谱仪上运行的样品，DDA参数会有所不同，可优化以包含更多的MS/MS和MS3扫描。此外，对于三合一质谱仪，应采用同步前体选择（SPS）-MS3模式。</li>
</ol>
8. 数据分析16
<ol>
	<li>使用蛋白质分析软件，针对适当数据库（如小鼠 Uniprot 数据库）搜索 RAW 文件。 
	注意：为检测轻链和重链二甲基化肽段，需为每个 RAW 文件建立两个搜索流程。</li>
	<li>使用以下参数搜索 RAW 文件：胰蛋白酶消化，允许两个漏切位点；肽段质量范围为 300–6,000 Da；母离子质量容差为 15 ppm，碎片离子质量容差为 1 Da。固定修饰：肽段 N 端轻链二甲基化（+28.031 Da）或重链二甲基化（+36.076 Da）、半胱氨酸羧氨甲基化（+57.021 Da, C）。 
	注意：有时重链二甲基化峰的质量偏移约为 7 Da（+35.069 Da，肽段 N 端），源自轻链二甲基化峰，因此应在重链二甲基化肽段的搜索流程中纳入此质量偏移。动态修饰：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da, M）、6-plex 同重标记（229.163 Da, K）。包含反向数据库搜索以计算错误发现率（例如 1% 和 5%），并添加定量节点以提取同重标记的报告离子强度。</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>将数据导出至电子表格程序，用于标准化蛋白质报告离子值。对每种蛋白质，将其报告离子比值的中位数或原始报告离子强度分别除以内标蛋白质的报告离子比值中位数或内标蛋白质的原始报告离子强度中位数。使用适当的统计软件（如电子表格程序、Perseus 或 R）分析不同样本条件之间的显著性差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者没有竞争利益。

cPILOT 可实现对 12 个以上不同样本的同时检测。为确保肽段的 N 末端和赖氨酸残基均能成功标记，必须为每组反应设置合适的 pH 值，并优先进行肽段标记的二甲基化反应。通过将 pH 控制在约 2.5（±0.2），可实现对 N 末端的选择性二甲基化。该方法利用了赖氨酸侧链氨基与肽段 N 末端氨基 pKA 值的差异。在 pH 2.5 条件下，赖氨酸残基处于非活性状态（pKA ~10.5）；然而，若 pH 呈弱酸性（即 pH 5–7）或碱性，则 N 末端和赖氨酸残基均会被二甲基化。此外，若在低 pH 条件下先进行等重标记，则 N 末端将被等重标签标记，而赖氨酸残基则被二甲基化。这可能导致在 MS3 分析中可选的碎片离子减少，因为需要选择 b 离子。与商业化的等重试剂相比，二甲基化反应的成本相对较低。虽然每 100 µg 样本可使用一整瓶等重试剂，但我们此前已成功使用每 100 µg 样本仅用半瓶试剂，且标记效率相当。这显著降低了单次 cPILOT 实验的成本，使可分析的样本数量增加。还需注意，其他等重标记试剂也可替代本方案中使用的等重试剂，我们此前已有验证14<...

蛋白质组学通常涉及对大量样本的分析，以更深入地理解疾病过程、酶动力学、翻译后修饰、对环境刺激的响应、对治疗干预的响应、生物标志物的发现或药物作用机制。可采用定量方法来测量不同样本间蛋白质水平的相对差异，这些方法可以是无标记的，也可以涉及同位素标记（代谢标记、化学标记或酶法标记）。稳定同位素标记方法因其能够同时分析多个样本，并适用于来自不同细胞、组织、体液或完整生物体的样本，而日益受到青睐。同位素标记方法1,2,3,4,5,6,7能够提高实验通量，同时减少数据采集时间、成本和实验误差。这些方法利用前体离子质谱图，通过肽段峰来测量蛋白质的相对丰度。相比之下，等压标记试剂8,9,10会产生报告离子，这些报告离子在MS/MS或MS3 11质谱图中被检测，其峰强度用于反映蛋白质的相对丰度。
目前蛋白质组学多重分析的最高水平为10重检测12 或12重等压标签分析13. 增强的样本多重检测即 &#62;10个样本）的方法已由我们实验室针对组织开发14,15,16,17以及其他研究人员用于细胞分析的方法18,19,20组织 21或靶向肽22我们开发了一种增强型多重分析技术，称为结合前体同位素标记与等重标记（combined precursor isotopic labeling with isobaric tagging, cPILOT）。全局cPILOT可用于获取不同样本条件（≥12）下所有蛋白质相对浓度的信息。14. 图1 展示了一般的cPILOT工作流程。在低pH条件下，胰蛋白酶或Lys-C肽段的N端通过二甲基化被选择性标记2 并在高pH条件下使用6重plex试剂标记赖氨酸残基。该策略使可分析样本数量增加一倍，从而降低使用等重试剂的实验成本，同时减少实验步骤和时间。
cPILOT 具有良好的灵活性，我们已开发出其他方法用于研究氧化型翻译后修饰，包括3-硝基酪氨酸修饰的蛋白质14以及含S-亚硝基化半胱氨酸的肽段（oxcyscPILOT）23。我们还建立了一种氨基酸选择性方法——半胱氨酸cPILOT（cyscPILOT）17。采用MS3扫描模式结合前导离子（top-ion）11或选择性y1-离子方法15，有助于减少报告离子干扰，提高cPILOT定量的准确性。在采集方法中使用MS3需要配备Orbitrap质量分析器的高分辨率仪器，尽管低分辨率的离子阱仪器也可能适用24。
此前，cPILOT 已被用于研究阿尔茨海默病小鼠模型的肝脏蛋白质16。本文中，我们描述了如何利用脑、心和肝组织匀浆进行全局 cPILOT 分析，以研究外周系统在阿尔茨海默病中的作用。该实验包含生物学重复。由于 cPILOT 具有广泛的适用性，感兴趣的用户可将其应用于其他组织，以研究多种生物学问题和系统。

<table><tbody><tr><td>水 - 质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>乙腈 - 质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液（28 - 30%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka 分析</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce 赛默飞世尔科技</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAM）</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich，化学</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>经TPCK处理的牛胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich，生命科学</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) 溶液；H 中含 36.5 - 38%&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich，生命科学</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;CD&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) 溶液；20 wt % 于 D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，98 原子％ D，99 原子％ &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C</td><td>Sigma Aldrich，化学</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠；试剂级，95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氘化钠；96 原子% D，98% 化学纯</td><td>Sigma Aldrich，化学</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>强阳离子交换（SCX）离心柱样品制备试剂盒</td><td>Protea BioSciences</td><td>SP-155-24试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液</td><td>Sigma Aldrich，生命科学</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>等压标签试剂盒（TMT 6重标记）— 6次反应（1 × 0.8 mg）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>盐酸羟胺</td><td>Sigma Aldrich，化学</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>标准涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td>任何混匀器均可使用</td></tr><tr><td>Oasis HLB 1 cc（10 mg）萃取小柱</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>这些是 C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 盒式装置</td></tr><tr><td>Visiprep SPE 真空萃取装置，DL（一次性衬管），24 孔型号</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57265</td><td>12 端口型号也足够使用</td></tr><tr><td>Speed-vac</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SPD1010</td><td>任何品牌的真空浓缩仪均可满足要求</td></tr><tr><td>水浴室</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2825/2826</td><td>任何品牌的&amp;nbsp; 温度可控的水浴装置即可满足要求。</td></tr><tr><td>机械匀浆器（&lt;em&gt;即&lt;/em&gt; FastPrep-24 5G</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D 超高效液相色谱系统配备 Nano LC AS-2 自动进样器</td><td>Sciex</td><td>-</td><td>此型号已不再提供。任何配备自动进样器的纳米液相色谱仪均可满足需求。</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>-</td><td>此型号已不再提供。其他高分辨率仪器（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos 均可使用。</td></tr><tr><td>蛋白质软件&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Proteome Discoverer</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>任何品牌的磁力搅拌器均可满足要求</td></tr><tr><td>pH计（Tris兼容）</td><td>Fisher Scientific（Accumet）</td><td>13-620-183</td><td>任何品牌的pH计均可使用</td></tr><tr><td>pH 10 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>任何品牌的pH 10缓冲液均可满足要求</td></tr><tr><td>pH 7 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>任何品牌的pH 7缓冲液均可满足要求</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管，500 个/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>任何品牌的 1.5 mL 离心管均可使用</td></tr><tr><td>0.6 mL 离心管，500 个/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-408-120</td><td>任何品牌的 0.6 mL 离心管均可使用</td></tr><tr><td>0.65 &amp;micro;m Ultrafree MC DV 离心滤过装置</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管，72 个单位</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 填充材料（5&amp;nbsp;&amp;micro;米，100 &amp;Aring;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61100/000</td><td>此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足要求</td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 填充材料（5&amp;nbsp;&amp;micro;米，200 &amp;Aring;)</td><td>Bruker</td><td>PM5/61200/000</td><td>此产品已不再由 Bruker 供货。符合所列规格的替代包装材料即可满足需求</td></tr></tbody></table>

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cpilot）增强组织样本的多重检测能力

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

随着对疾病机制理解及生物标志物发现的需求日益增长，需要分析大量的生物样本。能够同时检测多个样本的定量蛋白质组学策略已得到广泛应用，显著降低了实验成本和时间。本实验室开发了一种名为前体同位素标记与等重标记联用（combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging, cPILOT）的技术，该技术增强了传统同位素标记或等重标记方法的样本多重分析能力。全局cPILOT可应用于来源于细胞、组织、体液或完整生物体的样本，并提供不同样本条件下蛋白质相对丰度的信息。cPILOT的工作原理包括两个步骤：1）在低pH缓冲条件下选择性地对肽段N端进行二甲基化；2）在高pH缓冲条件下使用商业化的等重试剂对赖氨酸残基的伯胺进行标记（见材料/试剂表）。可用的样本多重分析程度取决于所使用的前体标记种类和等重标记试剂的类型。本文展示了一种12重分析方法，结合轻型和重型二甲基化标记与六重等重试剂，用于在单次分析中检测来自小鼠组织的12个样本。增强的多重分析能力不仅有助于减少实验时间和成本，更重要的是，能够在多个样本条件（如生物学重复、疾病阶段、药物处理、基因型或纵向时间点）之间进行比较，从而降低实验偏差和误差。在本研究中，采用全局cPILOT方法分析了阿尔茨海默病小鼠模型和野生型对照组的脑、心脏和肝脏组织在生物学重复间的差异。全局cPILOT还可用于研究其他生物学过程，并可进一步优化以实现超过20个样本的多重分析。

cPILOT 采用基于胺的化学方法，在肽段的N端和赖氨酸残基上进行化学标记，从而增强样本多重检测能力。 图2 展示了来自阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组脑、心脏和肝脏组织的12重cPILOT分析所获得的代表性质谱数据。如图所示 表1在此12重分析中，包含了阿尔茨海默病小鼠和野生型小鼠的两个生物学重复。 图2A 显示一对双电荷峰，其间隔为 m/z 4 的间距表明肽段中引入了一个单二甲基化基团。该对中的轻链和重链二甲基化峰被分别独立地进行隔离，并通过 CID 碎裂。每种二甲基化肽段的 MS/MS 数据如图所示 图2B 和 C搜索结果显示，这对峰属于T(二甲基)ELNYFAK(同重标签)6) 蛋白质磷酸甘油酸激酶1的肽段。最强烈的碎片离子为 y3+ 其在轻链和重链二甲基化峰中表现相似。这些峰进一步被分离用于HCD-MS分析3 ...

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

分析大量生物样本以深入了解疾病并发现生物标志物的需求日益增长。定量蛋白质组学策略……

该增强型多重检测方法的总体目标是增加可同时分析的蛋白质样品数量，同时降低样品误差和仪器使用时间。该方法有助于回答衰老、神经退行性疾病、其他年龄相关疾病以及癌症等领域中的关键科学问题，涉及发病机制、疾病进展、诊断、预后及治疗靶点等方面。该技术的主要优势在于，能够全面获取多种条件下蛋白质变化的整体图谱。尽管该方法可为小鼠模型中的阿尔茨海默病研究提供见解，但它也可应用于阿尔茨海默病患者或其他多种疾病患者的组织样本。通常，初次接触该方法的研究人员会发现其具有挑战性，因为需要在较短时间内同时处理多个样本。我们最初萌生该方法的想法，是源于认识到乙酰化修饰可与等重标记技术结合用于蛋白质硝基化分析，这促使我们推动该技术实现对所有肽段的全局适用。本研究将分析阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组的脑、心脏和肝脏组织。取每种组织样本60至90毫克转移至裂解管中，加入含8摩尔尿素的500微升PBS。使用机械匀浆器对样本进行匀浆处理。从裂解管中取出组织匀浆，并转移至微量离心管中。用 100 至 500 微升含 8 摩尔尿素的 PBS 冲洗裂解管，将冲洗液与组织匀浆合并。将组织匀浆离心 15 分钟。从每个样品中收集上清液。进行BCA检测以确定蛋白浓度后，向分别标记的微量离心管中各加入100微克蛋白。向每个样品中加入二硫苏糖醇。37摄氏度孵育两小时。向每个样品中加入碘乙酰胺（IAM），冰上避光孵育两小时。接着向每个样品中加入L-半胱氨酸，室温孵育30分钟。30 分钟后，加入含氯化钙的 Tris 缓冲液，将尿素稀释至终浓度为 2 M。向每个样品中加入经 L1 对甲苯磺酰氨基苯乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶，并在 37 °C 下孵育 24 小时。次日，将样品在液氮中快速冷冻以终止蛋白质消化反应，并在负80摄氏度下保存，直至进一步处理。在进行二甲基化标记前，按照文本方案所述对肽段样品进行脱盐处理，并通过真空离心干燥。开始二甲基化标记步骤时，用含1%乙酸的HPLC级或超纯水溶解肽段。取每个样品 50 微克部分转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。将重建后多肽的剩余部分在 -80 °C 下保存，用于后续实验。在接下来演示的步骤中，关键是要快速加入试剂，以确保所有样品的化学反应启动时间一致。向需进行轻度二甲基化标记的样品中加入8 µL 60 mM的甲醛溶液。向需进行重度二甲基化标记的样品中加入8 µL 60 mM的碳13-氘代标记甲醛溶液。向进行轻度二甲基化标记的样品中加入8 µL 24 mM的氰基硼氢化钠溶液。向标记为重同位素二甲基化的样品中加入8 µL 24 mmol/L氰基硼氢化钠。涡旋混匀样品，然后在室温下于管式振荡器上轻柔振荡约10分钟。加入16 µL 1%氨水反应5分钟以终止反应。通过加入八微升5%甲酸使反应混合物重新酸化。合并轻链和重链的二甲基化肽段，共生成六个样品。按照文中所述方案进行样品脱盐。通过真空离心法干燥样品。为了对二甲基化样品进行等重标记，首先将100微克二甲基化肽段溶解于三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液中。接下来，根据等重标记试剂盒的生产商说明书配制等重标记试剂。加入适当体积的可溶性等重标记试剂，此处为 41 µL，分别加入各肽段样品中，涡旋混匀约 10 秒。室温下在微量离心管振荡器上震荡样品约 1 小时。为终止反应，向每个样品中加入 8 µL 盐酸羟胺。室温孵育样品15分钟。将六个标记的样品混合至同一管中，进行脱盐处理。用含0.1%甲酸的色谱纯水重新溶解肽段，以备液相色谱分析。将重悬的多肽加入含有0.65微米滤器的微量离心管中，然后在12,000 × g离心1分钟。移除并弃去滤器。将过滤后的肽段转移至自动进样瓶中。取六微升强阳离子交换分级样品注入捕获柱，用十八烷基碳材料填充至两厘米。运行分析分离和数据采集质谱方法。对阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照的小鼠脑、心脏和肝脏组织进行了12重cPilot分析。前体数据显示出由m/z 643.854和647.875处峰代表的轻链和重链二甲基化肽段。这些肽段被独立选择、分离，并通过碰撞诱导解离产生上述谱图。搜索结果显示，这些峰归属于磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase one）蛋白的一个肽段。这些峰进一步被分离，进行高能碰撞解离串联质谱分析，其报告离子如图所示。两组三重串联质谱谱图对于获取12个样品的信息均是必需的。在此示例中，阿尔茨海默病与野生型对照的离子比值在脑、肝和心脏组织的两个生物学重复之间相似。每次比较的倍数变化值表明，阿尔茨海默病小鼠脑和心脏中的磷酸甘油酸激酶1水平较高，而在肝脏中则较低。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在约五小时内完成。在实施该流程时，务必注意样品处理的谨慎性。本流程中可结合强阳离子交换或高pH分级等分离方法，以提高每日的检测深度和覆盖度。观看本视频后，您应能充分理解如何利用 C-Pilot 增强样本多重检测能力。

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增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。...

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA...

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。...

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习cPILOT定量蛋白质组学技术，通过组合前体同位素标记和标记等压的复用方法，同时分析阿尔茨海默病小鼠模型与野生型对照的脑、心脏和肝脏组织样本，提高多重分析能力并减少误差。

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