Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

该协议的总体目标是分析成体果蝇髓质神经元在列和层中的树突路由，以表征树突模式，根据形态确定细胞类型，并识别突变体。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，包括绘制大脑回路和了解树突的布线机制。这种技术的主要优点是它在三维空间中传递了树突特性，从而提高了对树突布线逻辑和功能的理解。

该程序的目标是在两个正交、水平和正面方向上获取感兴趣神经元的两个图像堆栈。使用标准技术，用兔抗 GFP 和标记感光器轴突一抗的抗体对解剖的果蝇脑进行染色。然后用荧光二抗标记一抗，并在 70% 甘油和 1X PBS 中清除大脑。

为了在水平方向上安装大脑，将甘油清除的大脑转移到沉积在显微镜载玻片中央的 20 微升抗淬灭封固剂滴剂中。然后在盖玻片上，在四个角上贴上小块粘土，以防止盖玻片压碎大脑。现在在解剖显微镜下，将大脑置于腹侧向上的位置。

使用大脑的凸面背表面作为标志来识别大脑样本的方向。这将提供神经元的水平视图。然后盖上盖玻片。

使用配备 GaAsP 探测器的共聚焦显微镜，获得具有高数值孔径物镜和 2.5 数字变焦的水平视图图像堆栈。采集至少 180 个光学切片，具有 512 个方形像素和 2 微米的步长。拍摄第一个图像堆栈后，从载玻片上取下盖玻片，并将大脑重新定位在前向上的位置，以提供正面视图。

然后使用相同的技术，在水平视图中成像的相同神经元的正面视图制作一个新的图像堆栈。请务必记录感兴趣的神经元相对于延髓神经的位置。在较低的放大倍率下识别相同的神经元是可行的。

但是，如果由于组织很深而丢失信号，只需对大脑的腹侧进行成像即可。此外，通过检查图像堆栈来检查样本在采集图像时是否移动。文本协议中详细介绍了 Image de convolution 和 image combination。

该程序的目标是追踪神经突并分配配准参考点。首先打开重新组合的图像文件。然后去编辑。

然后显示显示调整并关闭红色的感光通道。接下来，在 surpass 模式下可视化图像。如果计算机配备了立体摄影系统，请打开立体并使用四缓冲模式来可视化 3D 图像。

添加新的 filaments，转到 surpass，然后 filaments，然后单击标有 skip automatic creation， edit manually 的选项卡。然后单击 draw 选项卡并选择 AutoDepth。接下来，选择 settings（设置）。

切换 line 选项并输入适当的像素编号以获得更好的可视化效果。然后切换显示树突、起点和分支点，并将渲染质量设置为 100%现在选择绘制选项卡，开始追踪神经突。从轴突开始，然后移动到树突。

跨髓质神经元的轴突和树突应该很容易区分。描摹神经突后，返回设置，然后切换起点和分支点。然后去 超越，然后导出.

选择对象，然后将灯丝另存为 Inventor 文件。下一步是分配参考点。首先，选择显示显示调整并打开两个成像通道。

然后去 超越，然后测量。然后在编辑选项卡下，切换特定通道，然后在这种情况下选择感光器通道。现在为顶层分配参考点。

选择 surpass，然后选择 measurement points，并将 m1 层的开头标记为顶层。使用剪切平面功能可以方便地进行点分配。点的顺序是赤道、前赤道、前、前腹、腹侧、腹侧后、后赤道和中心。

要找到中心感光器，它是与最树突状过程相关的感光器。接下来，使用相同的技术为 R8 和 R7 层分配参考点。定义每组参考点后，导出坐标。

选择 statistics（统计数据），然后选择 detailed （详细）、Specific values （特定值） 和 position （位置）。然后选择 export statistics on tab display to file，并将坐标另存为 CSV 文件。接下来，在电子表格编辑器中打开三个 CSV 文件。

将 27 个参考点的坐标复制并粘贴到新文件中，按照 top、R8 和 R7 的顺序。在计算树突分支和终止频率时，按照刚体和 TPS 非线性配准标准化的文本协议进行右腹侧配置。最终，这些数据用于制作各种信息图。使用此处介绍的双视图成像程序，在两个正交方向上对包含稀疏标记的 tm 20 神经元的苍蝇大脑进行成像。

图像重组提高了轴向分辨率。重组图像的分辨率优于水平视图和正面视图图像的分辨率。在查阅 3D 模型后，从 15 个 tm 20 神经元中收集树突痕迹，并与来自 15 个 tm 2 神经元的树突痕迹进行比较。

分析了这些神经元的分支和终止概率。对于小于 4 微米的节段，两种类型相似。树突终止的层特异性分析表明，两种神经元类型以不同的层特异性方式分布。

Tm 2 树突接收 m2 和 m5 的输入。而 tm 20 树突终止于 m1 到 m3 层。平面分析表明，tm 2 树突向前突出，而 tm 20 树突向后突出。

观看此视频后，您应该对如何采集两张共聚焦图像有很好的了解。读取成像文件上的研究标记，并从这些图像中提取树枝状特性。在尝试此过程时，在共聚焦成像之前正确标记样品非常重要。

因为如果样品在成像过程中移动，成像组合将失败。