Name: 分析树突状形态的列和图层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习利用双视角成像和计算工具分析果蝇髓质神经元的树突路由。该方法通过三维空间映射树突结构，帮助研究人员表征细胞类型并识别突变体，从而深入理解神经环路连接机制。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院院内研究计划、尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（资助号 HD008913，授予 C.-H.L.）以及信息技术中心（P.G.M.、N.P.、E.S.M. 和 M.M.）的支持。

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<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+NeuronJ+tracing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of NeuronJ tracing data.</a> Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了如何对黑腹果蝇（Drosophila）髓质神经元的树突树进行成像与分析。第一部分“双视角成像”介绍了如何将两组图像堆栈去卷积并合并为一组高分辨率的图像堆栈。第二部分“树突追踪与配准”描述了将髓质神经元的树突进行追踪，并将其配准至参考柱状阵列的方法。第三部分“树突分析”阐述了如何利用自定义脚本分析树突的分布模式。上述实验方案共同构成了一套完整的工作流程，可用于提取树突在神经层和神经柱中的分布信息，并确定树突分支与终止的频率。
本文介绍的双视角成像方法在概念上类似于光片显微镜中实现的多视角成像技术，即通过正交采集两个或多个图像堆栈并将其重组，以实现高轴向分辨率17,18。然而，由于成像细长树突需要两个高数值孔径（N.A.）的物镜，而将这两个物镜正交布置在技术上具有挑战性。因此，双视角方法需要在两个连续步骤中对同一脑样本进行成像，并在两次成像之间重新调整样本方向。图像组合失败最可能的原因是在成像过程中样本发生移动，或在操作过程中样本被压扁。此外...

在发育过程中，神经元会形成复杂但具有高度保守特征的树突分支模式，以与其突触前伙伴建立突触连接。树突的分支模式与神经元的身份和功能密切相关。树突树的分布位置决定了其所接收的突触前输入类型，而树突分支的复杂程度和树突野的大小则决定了输入信号的数量。因此，树突的形态学特性是决定突触连接性和神经元信息处理能力的关键因素。在许多复杂大脑区域中，例如果蝇视叶和脊椎动物视网膜，突触回路以柱状和层状结构进行组织，以促进信息处理1,2。在这种柱-层结构中，特定感觉模态的突触前神经元会将其轴突投射至特定的层（即所谓的层特异性靶向），并形成有序的二维阵列（即所谓拓扑图谱）；而突触后神经元则在特定层内延伸出适当大小的树突，以接收正确类型和数量的突触前输入。尽管轴突对层和柱的靶向机制已被广泛研究3,4，但对于树突如何被引导至特定层，并扩展出适当大小的感受野以与正确的突触前伙伴建立连接，目前仍知之甚少5。对树突在层和柱结构中靶向过程的成像与定量分析存在技术困难，这阻碍了柱状和层状脑结构中树突发育的研究进展。
Drosophila 视叶神经元是研究柱状和层状结构中树突投射路径及神经环路组装的理想模型。果蝇视叶神经组织在三维空间上被组织成一个包含10个层和约750个柱的立体晶格结构。每个柱由一组传入神经支配，包括光感受器R7/R8和视网膜下神经节细胞L1-L5，这些神经元的轴突终末以层特异性的方式形成拓扑图谱6。每个视叶柱中存在约38种不同类型的视叶神经元，它们在特定层中形成树突，并具有适当的树突野大小，以接收这些传入神经的输入信号7。视叶中的突触环路已在电子显微镜水平上完成重构，因此其突触连接关系已明确建立7,8。此外，目前已开发出多种可用于标记不同类型视叶神经元的遗传工具9,10,11。通过研究三种跨视叶（Tm）神经元（Tm2、Tm9和Tm20），我们先前鉴定了两种细胞类型特异性的树突特征：（i）Tm神经元的树突沿前向或后向投射（平面投射方向），该方向取决于具体的细胞类型；（ii）视叶神经元的树突在特定视叶层中终止，且终止模式具有细胞类型特异性（层特异性终止）12。平面投射方向和层特异性终止足以区分这三种Tm神经元类型，而干扰Tm神经元对层和柱线索响应的突变则会影响这些特征的不同方面。
本文介绍了一种完整的流程，用于研究果蝇（Drosophila）髓质神经元在神经柱和神经层中的树突形态（图1）。首先，我们展示了一种双视角成像方法，该方法利用定制软件将两组共聚焦图像堆栈合并，生成高质量的各向同性图像。该方法仅需常规共聚焦显微镜即可获得高质量图像，能够可靠地追踪树突分支，而无需依赖STED（受激发射损耗）或结构光照明显微等超分辨率成像技术。其次，我们介绍了一种追踪树突树并将其神经突轨迹配准至参考柱状阵列的方法。第三，我们展示了提取树突平面投射方向和层特异性终止信息的计算方法，以及估算树突分支频率和终止频率的方法。综合这些方法，可实现对树突模式的三维表征，基于树突形态对细胞类型进行分类，并识别突变体中可能存在的缺陷。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>科学体积成像</td><td>版本 16.05</td><td>用于图像去卷积（https://svi.nl）。&amp;nbsp; 商业软件</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>7.3.0 版本</td><td>用于图像重组与配准（http://mipav.cit.nih.gov/）；免费软件</td></tr><tr><td>MIPAV 插件：PlugInDrosophila&lt;br/&gt;RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td>免费软件</td></tr><tr><td>MIPAV 插件：PlugInDrosophilaStandard&lt;br/&gt;ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>免费软件</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>用于追踪神经突并为图像配准指定参考点（http://www.bitplane.com）；商业软件</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>用于可视化 swc 文件（https://github.com/Vaa3D/release/releases/）；免费软件</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td><td>用于树突形态计量分析（http://www.mathworks.com）；商业软件</td></tr><tr><td>Matlab 工具箱：TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>用于分析树突形态测量参数（http://www.treestoolbox.org/download.html）；免费软件</td></tr><tr><td>Matlab 工具箱：Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>用于计算形态计量参数（https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration）。免费软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;示例文件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC 文件定义</td><td></td><td></td><td>http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>图像组合与配准的代码及示例文件</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/用于图像组合与标准化柱状注册的数据集合</td></tr><tr><td>参考点示例&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&amp;amp;修改日期=&lt;br/&gt;1471880596000&amp;amp;api=v2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;计算机系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 或 Macintosh OS X 10.7 及更高版本</td><td></td><td></td><td>3GHz 64位四核处理器，16G内存（最低配置）</td></tr><tr><td>可选：Quadro4000&amp;nbsp; （或更高）显卡</td><td>Nvidia</td><td></td><td>用于树突的立体可视化。</td></tr><tr><td>可选：NVIDIA 3D Vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>可选：适用于 NVIDIA 3D Vision2 的 120 Hz LCD 显示器</td><td></td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP标签抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔（H+L），Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠（H+L），Alexa Fluor 568</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>固定样品&amp;nbsp;克莱&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS 中的 70% 甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，高性能，D = 0.17&amp;nbsp;毫米</td><td>蔡司</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

分析柱状和层状结构中的树突形态

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

在中枢神经系统的许多区域，如果蝇视叶和脊椎动物大脑皮层，突触环路以层状和柱状结构排列，以促进发育过程中的脑连接以及成熟动物的信息处理。不同类型的突触后神经元在特定层内以类型特异性的模式形成树突，与相应的突触前末梢形成连接。果蝇的髓质神经网由10层和约750个柱状结构组成；每个柱状结构中分布着超过38种髓质神经元的树突，这些树突以类型特异的方式与大约7种传入神经元的轴突末梢相匹配。本报告详细描述了对髓质神经元树突进行成像和分析的操作流程。该工作流程包括三个部分：（i）双视角成像部分，将两个正交方向采集的共聚焦图像堆栈合并，生成高分辨率的树突三维图像；（ii）树突追踪与配准部分，在三维空间中追踪树突分支结构，并将树突轨迹注册到参考柱状阵列中；（iii）树突分析部分，针对柱状和层状结构分析树突分布模式，包括树突分支在特定层的终止特征和平面投射方向，并估算树突分支频率和终止频率。本方案利用基于开源MIPAV（医学图像处理、分析与可视化）平台开发的自定义插件，以及基于矩阵实验室语言（matrix laboratory language）开发的自定义工具箱。这些方法共同提供了一套完整的分析流程，可用于研究果蝇（Drosophila）髓质神经元在层和柱结构中的树突投射模式，识别细胞类型，并确定突变体中的结构缺陷。

利用本文介绍的双视角成像方法，对一个包含稀疏标记Tm20神经元的果蝇大脑在两个正交方向上进行了成像。成像前，大脑组织使用适当的初级和次级抗体进行染色，以可视化膜锚定型GFP和光感受器轴突。成像时，首先将大脑以水平方向安装（图2A，B），然后使用共聚焦显微镜对一个GFP标记的Tm20神经元及其周围的光感受器轴突进行成像（图3A）。随后，重新调整大脑的方向（图2A，B），并对同一个Tm20神经元在额面方向上再次成像（图3B）。在成像过程中，该Tm20神经元的位置被确定为位于右侧髓质神经 Neuropil 的腹侧半部（RV构型）。这两个图像堆栈通过图像去卷积软件进行去卷积处理，并使用MIPAV软件（图3C）合并，生成重组图像堆栈（图3C'）。与任一原始输入图像堆栈相比，重组图像堆栈显著减少了轴向畸变（图3A'，B'）。
<p class...

本文展示了如何分析果蝇（Drosophila）髓质神经元在神经小柱和层中的树突投射。该工作流程包括一种双视角成像技术，以提高图像质量，以及一系列计算工具，用于追踪树突分支、将树突结构配准至参考小柱阵列，并在三维空间中分析树突结构。

在中枢神经系统的许多区域，例如果蝇视叶和脊椎动物大脑皮层中，突触环路以分层形式组织排列……

本方案的总体目标是分析成年果蝇（Drosophila）视叶神经元在柱状与层状结构中的树突投射模式，以表征树突形态、基于形态特征确定细胞类型，并鉴定突变体。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，包括脑神经环路的绘制以及树突连接机制的理解。该技术的主要优势在于能够呈现树突特性在三维空间中的分布，从而提升对树突连接逻辑与功能的理解。本实验的目的是以两个正交的水平和额面方向获取目标神经元的两组图像序列。采用标准技术，使用兔抗GFP抗体和标记光感受器轴突的一抗对解剖得到的果蝇大脑进行染色，随后用荧光二抗标记一抗，并在70%甘油和1×PBS中对大脑组织进行透明化处理。为了以水平方向封片脑组织，将经甘油透明处理的脑组织转移至载玻片中央的20微升抗荧光淬灭封片剂液滴中。然后在盖玻片的四个角上粘附少量黏土小块，以防止盖玻片压碎脑组织。接着在解剖显微镜下，将脑组织置于腹面朝上的位置。利用脑组织背侧的凸面作为解剖标志，确定脑样本的方位。这将提供神经元的水平视图。然后贴附盖玻片。使用共聚焦显微镜（最好配备 GaAsP 检测器），采用高数值孔径物镜并设置 2.5 倍数字放大，获取水平切面的图像序列。至少采集 180 个光学切片，图像分辨率为 512 × 512 像素，步进尺寸为 2 µm。完成第一组图像序列采集后，从载玻片上移除盖玻片，并将脑组织重新放置为前部朝上的位置，以获得额面视图。然后使用相同技术，对在水平视角下成像的相同神经元获取其正面视角的新图像序列。务必同时记录目标神经元相对于髓质神经组织的位置。在较低放大倍数下即可实现相同神经元的识别。然而，如果由于组织较深而导致信号丢失，则仅对脑组织的腹侧半部分进行成像。在采集图像时，通过检查图像序列来确认样本是否发生移动。图像去卷积与图像合并的具体步骤详见文本方案。本实验步骤的目标是追踪神经突并为配准分配参考点。首先打开重组后的图像文件，然后进入编辑模式。然后进行显示调整，并关闭光感受器通道（红色）。接着以超越模式观察图像。如果计算机配备了立体成像系统，请开启立体显示，并使用四缓冲模式来观察三维图像。添加新的纤维，进入 surpass，然后选择纤维，点击标有“跳过自动创建，手动编辑”的选项卡。接着点击“绘制”选项卡并选择 AutoDepth。然后选择“设置”。切换线条选项并输入适当的像素数值以获得更好的可视化效果。然后勾选显示树突、起始点和分支点，并将渲染质量设置为100%。接着选择绘制选项卡，开始追踪神经突起。先从轴突开始，再追踪树突。透射中脑神经元的轴突和树突应易于区分。追踪完神经突后，返回设置，取消勾选起始点和分支点。然后进入超越，再进行导出。选择对象，并将纤维保存为 Inventor 文件。下一步是指定参考点。首先，选择显示显示调整，并打开两个成像通道。然后进入 surpass，进行测量。在编辑选项卡下，切换至特定通道，并选择此处的光感受器通道。现在为顶层分配参考点。选择“surpass”，然后选择测量点，并将 m1 层的起始位置标记为最上层。使用裁剪平面功能以辅助点的分配。各点的顺序依次为：赤道、前赤道、前部、前腹侧、腹侧、后腹侧、后部、后赤道和中心。为了找到中心感光细胞，需选择与最多树突过程相关联的细胞。接下来，使用相同的技术为R8和R7层分配参考点。在定义每组参考点后，导出其坐标。选择统计，然后选择详细、具体的数值和位置。接着在标签显示中选择导出统计到文件，并将坐标保存为 CSV 文件。然后在电子表格编辑器中打开这三个 CSV 文件。将27个参考点的坐标按顶部、R8、R7的顺序复制并粘贴到一个新文件中。随后按照文本协议进行刚体和TPS非线性配准，标准化至右侧腹侧构型，以计算树突分支和终止频率。最终，利用这些数据生成多种信息图表。通过本文所述的双视角成像程序，对包含稀疏标记tm 20神经元的果蝇大脑在两个正交方向上进行了成像。图像重组提高了轴向分辨率。重组后的图像分辨率优于水平视图和前视图图像。在参考三维模型后，采集了15至20个神经元的树突轨迹，并与2个神经元的树突轨迹进行了比较。对这些神经元的分支和终止概率进行了分析。对于小于4微米的节段，两种类型相似。树突终止的层特异性分析显示，这两种神经元类型以不同的层特异性方式分布。tm 2 树突在 m2 和 m5 层接收输入，而 tm 20 树突终止于 m1 至 m3 层。平面分析显示，tm 2 树突向前投射，而 tm 20 树突向后投射。观看本视频后，您应能充分了解如何获取共聚焦图像中的两项图像。阅读成像文件中的研究标记，并从这些图像中提取树突特性。在尝试该操作流程时，务必在共聚焦成像前对样品进行正确的标记。因为如果样品在成像过程中发生移动，成像组合将失败。

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神经科学

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我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。...

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利用高尔基-考克斯法评估老龄小鼠海马树突复杂性

本方案重点介绍果蝇（Drosophila）神经元树突分支复杂性（NDAC）的定量分析，可用于树突形态发生相关研究。...

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通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

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树突棘是大多数兴奋性突触的突触后区室。在神经发育、衰老、学习过程以及许多神经和精神疾病中，树突棘形态会发生改变，这凸显了可靠分析树突棘的重要性。本方案描述了如何使用自动三维神经元重建软件，准确且可重复地量化树突棘形态。...

使用自动三维神经元重建软件进行树突棘定量分析

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分析柱状和层状结构中的树突形态

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