Name: 一种在96孔板表演细胞迁移/伤口愈合设备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学习使用八通道机械细胞划痕器在96孔板中进行细胞迁移/伤口愈合实验的方法。该技术可快速、经济地高通量评估处理因素对细胞迁移的影响，适用于癌症和皮肤病学研究。

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作者谨此感谢香港浸会大学理学院工场的谭宝良先生、黄志健先生及技术团队，感谢他们在制作本伤口模型原型过程中提供的专业技术与建议。

1. 伤口仪各部件介绍（图1）
<ol>
	<li>通过将损伤针固定在等距离位置来准备针 holder。握住移液器吸头，并通过上下移动可调节的损伤针来调整吸头高度。</li>
	<li>将可调节导杆适配到不同品牌的 96 孔培养板上，并确保损伤区域处于固定位置。</li>
	<li>通过拧紧六角螺丝固定可调节损伤针。通过拧紧两端的六角内螺纹帽将导杆固定在位。</li>
</ol>
2. 设置针夹的宽度（图2）
<ol>
	<li>使用 M5 六角扳手松开六角圆柱头螺钉。</li>
	<li>在针座两侧安装适当数量的调整环，使导向杆与 96 孔培养板的宽度完全匹配。 
	注意：Corning 和 Iwaki 培养板需要 1 对大环和 1 对小环，Falcon 和 Nunc 培养板需要 1 对大环。</li>
	<li>拧紧六角圆柱头螺钉以固定导向杆。</li>
</ol>
3. 调整导引杆（图3）
<ol>
	<li>将无菌的 10-µL 塑料吸头安装到损伤针上。</li>
	<li>使用 M5 六角扳手松开六角圆柱头螺钉。</li>
	<li>握住伤口仪，将损伤针浸入 96 孔培养板的一列孔中。</li>
	<li>调节导杆的高度，直至所有吸头尖端刚好接触孔底。</li>
	<li>拧紧六角圆柱头螺钉，确保伤口仪能完全贴合培养板，并且各针准确地位于各孔中央。</li>
</ol>
4. 针头的校准
<ol>
	<li>将伤口装置垂直置于平坦的无菌表面即 培养皿）并使用 M3 六角扳手松开所有六角螺丝。</li>
	<li>轻敲移液器，直至所有吸头均均匀接触平坦的无菌表面。</li>
	<li>再次拧紧六角螺钉，以固定销钉的位置。</li>
	<li>通过将包扎器轻轻在无菌平面上轻敲，检查每个尖端的均匀性。</li>
</ol>
5. 划痕细胞单层（图4）
<ol>
	<li>将人脐静脉内皮细胞接种于经0.1%明胶包被的96孔细胞培养板中。使用添加了20%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和0.09 g/L肝素的Medium 199培养基进行培养。将细胞置于37 ºC、含5%二氧化碳的湿化培养箱中过夜，待用前培养至完全汇合。</li>
	<li>将划痕头置于培养板每列各孔的最左侧（或最右侧）。将划痕器沿孔底滑动至孔的另一侧，确保划痕头始终接触孔底表面。</li>
	<li>对所有列重复划痕操作（步骤5.2）。</li>
	<li>划痕完成后，弃去各孔中的培养基，并更换为含有待测化合物的新鲜培养基。</li>
</ol>
6. 数据采集与图像分析
<ol>
	<li>使用低倍显微镜配备数码相机对细胞单层上机械划痕的整个孔进行成像例如 10X 物镜）在损伤后立即（t=0 h）进行观察。</li>
	<li>根据需要加入待测化合物，并孵育所需时间。在预定的孵育时间后（t=Δh），再次对含有划痕区域的整个孔进行成像。</li>
	<li>使用图像分析软件（如 ImageJ）<a href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a>），使用手绘工具在图像上测量伤口区域。</li>
	<li>计算伤口闭合百分比： 
	<img alt="伤口愈合率计算公式，显示随时间推移伤口面积减少的百分比计算方法。" src="/files/ftp_upload/55411/55411eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prespecification+and+plasticity%3A+shifting+mechanisms+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
<li>Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+replication+in+endothelial+regeneration%3A+a+study+using+irradiated+endothelial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures.</a> Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).</li>
<li>Gotlieb, A. I., Spector, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+into+an+in+vitro+experimental+wound%3A+a+comparison+of+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells+and+the+effect+of+culture+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation.</a> Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).</li>
<li>Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparsion+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+repair+process+involved+in+the+repair+of+a+cell+monolayer+using+an+in+vitro+model+of+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury.</a> Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).</li>
<li>Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+quantifying+cell+migration%2F+wound+healing+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates.</a> J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).</li>
<li>Yue, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanisms+underlying+the+angiogenic+effects+of+ginsenoside+Rg%281%29+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro.</a> Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).</li>
<li>Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenoside-Rg1+induces+angiogenesis+by+the+inverse+regulation+of+MET+tyrosine+kinase+receptor+expression+through+miR-23a%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们的细胞划痕仪在解决传统细胞迁移实验存在的问题方面具有多项独特优势。这款8通道机械式细胞划痕仪由高等级不锈钢（304钢）制成，寿命长，可通过高压灭菌进行消毒。由于配备了可调节导杆，市面上几乎所有品牌的96孔培养板均可与该机械式细胞划痕仪配合使用。可调节导杆的设计还确保了划痕区域位于每个孔的中央位置。孔中央的划痕有利于使用显微镜进行图像采集。尽管在不同时间点拍摄的图像存在一定差异，但由于使用低倍物镜（即 10X）即可观察到约90%的孔面积，因此不会影响数据分析。因此，可在96孔培养板上实现半高通量分析7,8。然而，该方法仍需要采集大量图像，导致数据分析耗时较长。若具备自动图像采集系统，则可解决这一问题。
该划痕装置中各个可调节针头的设计可确保与96孔板表面均匀接触，从而在细胞单层上产生一致、平滑且边缘清晰的划痕。划痕针采用商用塑料移液器吸头，每次划痕后均可进行灭菌并丢弃，具有良好的弹性，可在不造成机械损伤的情况下接触孔底表面。这些优势可进一步最大限...

细胞迁移在多种细胞过程中发挥着重要作用，例如胚胎发生、神经发生、血管生成、伤口愈合、黏膜修复，以及在正常发育和疾病状态下的上皮-间质转化1。这是一个复杂的过程，涉及多种细胞内外事件的协调，包括信号分子相互作用、细胞极性建立、细胞骨架重组、基质重塑、膜突起形成以及细胞间黏附的动态调控2。通过研究细胞迁移，可以发现并验证能够诱导细胞运动及其相关生化通路的化学物质或生物分子。这一基本过程可作为多种应用的有效代理，例如疾病治疗和药物靶向。
划痕实验是细胞迁移实验方法之一3。在此方法中，通过机械方式部分去除单个样本中的细胞，形成一个无细胞区域，细胞将迁移以覆盖该区域。将在特定时间点监测修复面积的百分比。当处理大量样本时，实验成本以及样本间交叉污染等问题可能较为突出。尽管目前已有多种商用工具和实验方法可用于研究细胞迁移4,5,6，但其中许多方法需要昂贵且复杂的设备，仍需进一步改进。基于上述原因，开发了一种8通道机械式细胞划痕仪（图1）。
我们的8通道机械细胞划痕仪在解决上述问题方面具备多项独特设计。该仪器能够灵活地在96孔培养板中进行细胞迁移/划痕实验。可调节的导向杆设计确保划痕区域位于每个孔的中央位置。此外，导向杆的高度可调，使该划痕仪适用于不同品牌的培养板。最后，可调节的划痕针设计使移液器吸头能够均匀接触培养板表面，从而实现同步且可重复的划痕效果7,8。

<table><tbody><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>其他品牌的96孔细胞培养板也可使用</td></tr><tr><td>P10移液器吸头</td><td>Axygen</td><td>301-03-051</td><td>短型P10移液器吸头更易于形成清晰的划痕</td></tr><tr><td>划痕工具（Wounder）</td><td>R&amp;P Technology Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>199培养基</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td>用于人脐静脉内皮细胞的细胞培养。&lt;br/&gt; 其他类型细胞应使用适当的培养基和培养条件。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>用于人脐静脉内皮细胞的细胞培养。&lt;br/&gt; 其他类型细胞应使用适当的培养基和培养条件。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>用于人脐静脉内皮细胞的细胞培养。&lt;br/&gt; 其他类型细胞应使用适当的培养基和培养条件。</td></tr><tr><td>猪肠黏膜来源肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>用于人脐静脉内皮细胞的细胞培养。&lt;br/&gt; 其他类型细胞应使用适当的培养基和培养条件。</td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>用于人脐静脉内皮细胞的细胞培养。&lt;br/&gt; 其他类型细胞应使用适当的培养基和培养条件。</td></tr></tbody></table>

一种用于96孔板中进行细胞迁移/伤口愈合实验的装置

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

细胞迁移/划痕实验是一种常用的方法，用于研究细胞迁移及其他生物学过程，如血管生成和肿瘤转移。在该实验中，细胞培养形成融合的单层后，通过使用工具刮擦产生机械性划痕。随后可通过成像技术监测细胞向无细胞区域迁移的速率。我们的8通道机械划痕仪旨在解决细胞迁移实验中的大多数问题。首先，该划痕仪可通过高压灭菌或常用消毒剂轻松实现灭菌。其次，独立可调节的针头可确保与细胞培养板均匀接触，从而产生清晰且可重复的划痕。第三，划痕仪两侧的导向杆可保证每个孔中划痕位置的一致性。使用一次性塑料移液器吸头进行划痕，可进一步改善操作便利性，并最大限度减少交叉污染。总之，我们的细胞划痕仪可为研究人员提供一种用户友好且可重复的装置，适用于标准96孔培养板进行细胞迁移实验。

该8通道机械划痕仪用于在细胞单层上制造划痕，以进行细胞迁移实验。这是一种操作简便的装置，无需特殊培训即可在不到一分钟的时间内完成96孔板中的细胞划痕实验。该划痕仪可在细胞单层上产生宽度均一（约600 µm）、边缘清晰的划痕区域（图5和图6）。划痕宽度取决于移液器吸头的品牌及操作者的操作方式。该范围的划痕宽度适用于低倍放大下的常规成像（图7）。成像后可计算划痕闭合的百分比。该细胞划痕仪采用了多种策略来解决细胞迁移实验中遇到的问题，同时可在不同类型的96孔培养板中灵活开展细胞迁移实验。
<img alt="多通道移液工具示意图，标注各部件，用于实验室精确液体操作。" src="/files/ftp_upload/55411/55411fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> ...

本文介绍了一种在96孔细胞培养板上进行半高通量细胞迁移实验的方案。该方法是一种快速、简便且经济的手段，可用于在细胞单层上创建一致的划痕伤口。

细胞迁移/划痕实验是一种常用的方法，用于研究细胞迁移及其他生物学过程，如血管生成和肿瘤……

八通道机械细胞划痕仪的总体目标是通过划痕愈合实验，以快速且半高通量的方式量化处理因素对细胞迁移的影响，而无需使用昂贵且复杂的设备。细胞迁移是在不同生理和病理生理条件下重要的细胞过程。体外划痕愈合实验已广泛应用于包括癌症、血管系统及皮肤病学在内的多种研究领域。该方法的主要优势在于，可以在96轨板上同时监测对细胞迁移的影响，从而能够同步观察不同的处理条件。本次实验操作的示范者为我们实验室的研究生Ka Chun Ng。开始实验时，通过将划痕针以相等间距固定，制备好针架。握住移液器吸头，上下移动可调节的划痕针以调整吸头高度。接着，将可调节的导向条适配到不同品牌的96孔培养板上，并确保划痕区域处于固定位置。通过拧紧六角螺丝来固定可调节的划痕针。通过拧紧两端的内六角圆柱头螺钉来固定导杆位置。使用M5内六角扳手松开内六角圆柱头螺钉。在针座两侧插入适当数量的调整环，使导杆与96孔培养板的宽度完全匹配。然后拧紧六角凹头螺钉以固定导向杆。开始通过将损伤针安装灭菌的10微升塑料移液器吸头来调节导向杆。接着，使用M5六角扳手松开六角凹头螺钉。握住伤口装置，将伤口针浸入96孔培养板的一列中。然后调节导杆的高度，直到所有针尖刚好接触孔底。拧紧六角圆柱头螺钉。确保伤口器完全贴合在培养板上，且针头准确地位于各孔中央。将伤口器垂直置于平坦无菌的表面（如培养皿）上，使用M3六角扳手松开所有六角螺丝。轻敲伤口器，直至所有针尖均匀接触表面。当针尖均匀接触表面后，再次拧紧六角螺丝以固定针的位置。然后通过轻轻敲击包埋器的平坦无菌表面，检查每个针尖的平整度。将人脐静脉血管内皮细胞接种于经0.1%明胶包被的96孔细胞培养板上。在 M199 培养基中培养细胞，培养基中添加 20% 经热灭活的胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 0.09 克/升肝素。将细胞置于含 5% CO₂ 的湿润培养箱中，于 37 °C 培养过夜后使用。待细胞达到 100% 汇合度时，将划痕工具置于培养板同一列各孔的最左侧。将划痕器滑动至孔的另一侧。确保划痕头接触孔底。为保证每个细胞培养孔中的划痕居中且位置一致，将划痕器横跨孔径摆动至另一端。对所有列重复划痕操作。划痕后，弃去每孔中的培养基，更换为含有待测化合物的新鲜培养基。随后进行数据采集与图像分析。划痕后立即拍摄的孔板中一行和一列孔的代表性图像可用于定量分析每个伤口的宽度。伤口图像来源于人脐静脉内皮细胞和人皮肤成纤维细胞。虚线表示伤口区域，实线表示细胞迁移区域。观看本视频后，您应能充分掌握如何在96孔板中以半高通量方式使用该设备进行伤口愈合实验，并确保每个孔均被划痕器划出划痕。

a-device-for-performing-cell-migrationwound-healing-in-a-96-well-plate

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